CC BY
60
© Коллектив авторов, 2019
Шиловский И.П., Никольский А.А., Ковчина В.И., Болотова С.И., Вишнякова Л.И., Соколова А.Р., Барвинская Е.Д., Хаитов М.Р.
Активация ThH-иммунного ответа при экспериментальной нейтрофильной бронхиальной астме у мышей
ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, 115522, г. Москва, Россия
Резюме
Бронхиальная астма (БА) - гетерогенное хроническое воспалительное заболевание респираторного тракта. Большинство пациентов, страдающих от БА легкой и средней тяжести, поддаются лечению с применением кортикостероидов. Однако существует группа пациентов (до 10%) с тяжелой формой БА, которые резистентны к стандартной терапии кортикостероидами. Изучение данного феномена выявило взаимосвязь тяжелого протекания БА с активацией Th1- и ТЪ17-иммунного ответа и нейтрофильного воспаления в легких. В то же время у пациентов, хорошо отвечающих на терапию кортикостероидами, как правило, наблюдается Th2-опосредованное эозинофильное воспаление дыхательных путей. В данном исследовании для детального понимания механизмов резистентности к кортикостероидам мы разработали модель БА у мышей с преобладающим нейтрофильным, а не эозинофильным типом воспаления. Для этого мышей линии BALB/c иммунизировали смесью модельного аллергена овальбумина и адъюванта Фрейнда с последующей аэрозольной провокацией тем же самым аллергеном в смеси с липополисахаридом из E. coli. В результате у мышей развивались ключевые проявления нейтрофильной БА: продукция аллерген-специфических антител класса IgE, развитие гиперреактивности бронхов, ремоделирование респираторного тракта и инфильтрация ткани легких нейтрофилами. При этом формирование данной патологии протекало по ТЫ7-зависимым механизмам, что соответствует клинической картине, наблюдаемой в практике. Созданная модель нейтрофильной БА может быть использована как для изучения патогенеза заболевания, так и для тестирования новых подходов к его терапии.
Ключевые слова: бронхиальная астма; модель на мышах; ТЪ17-иммунный ответ
Статья поступила 16.09.2019. Принята в печать 16.10.2019.
Для цитирования: Шиловский И.П., Никольский А.А., Ковчина В.И., Болотова С.И., Вишнякова Л.И., Соколова А.Р., Барвинская Е.Д., Хаитов М.Р. Активация ТЫ7-иммунного ответа при экспериментальной нейтрофильной бронхиальной астме у мышей. Иммунология. 2019; 40 (6): 5-15. doi: 10.24411/0206-4952-2019-16001
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ .№ МД-1578.2019.4 (075-15-2019-224).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Шиловский Игорь Петрович -доктор биологических наук, заместитель директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Shilovskiy I.P., Nikolskii A.A., Kovchina V.I., Bolotova S.I., Vishniakova L.I., Sokolova A.R., Barvinskaya E.D., Khaitov M.R.
Activation of Th17-immune response in a mouse model of neutrophilic asthma
National Research Center - Institute of immunology of Federal Medico-Biological Agency, 115522, Moscow, Russia
Abstract
Bronchial asthma (BA) is a heterogeneous chronic inflammatory disease of the respiratory tract. The majority of patients with mild to moderate BA are well respond to corticosteroid treatment. However, there is a group of patients (up to 10% of BA cases) with severe BA which resistant to conventional corticosteroid therapy. A detailed study of this phenomenon revealed a relationship between the severity of BA, activation of Th1- and Th17-immune responses and
neutrophilic type of inflammation. At the same time patients with Th2-mediated eosinophilic pulmonary inflammation respond to corticosteroids well. In order to understand the mechanisms of corticosteroid resistance we developed a model of BA in mice with a predominant neutrophilic rather than eosinophilic type of inflammation. BALB/c mice were immunized with the mixture of the ovalbumin allergen and Freund's adjuvant, followed by aerosol challenge with the same allergen mixed with E. coli lipopolysaccharide. As a result, mice developed key manifestations of neutrophilic BA: production of allergen-specific IgE antibodies, development of bronchial hyperreactivity, remodeling of the respiratory tract and infiltration of lung tissue with neutrophils. Moreover, the development of this pathology was Th17-dependent, that corresponds to the clinical observations in human. The presented model of neutrophilic BA in mice can be used both for studying the pathogenesis of the disease, and for testing new approaches to its therapy.
Keywords: bronchial asthma; mouse model; Th17-immune response
Received 16.09.2019. Accepted 16.10.2019.
For citation: Shilovskiy I.P., Nikolskii A.A., Kovchina V.I., Bolotova S.I., Vishniakova L.I., Sokolova A.R., Barvin-skaya E.D., Khaitov M.R. Activation of Th17-immune response in a mouse model of neutrophilic asthma. Immu-nologiya. 2019; 40 (6): 5-15. doi: 10.24411/0206-4952-2019-16001
Funding. The study was supported by the grant of the President of Russian Federation No. MD-1578.2019.4 (07515-2019-224).
For correspondence
Shilovskiy Igor P. - Dr.Sci., PhD, Deputy Director for Science and Innovation, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russia E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Введение
Бронхиальная астма (БА) - гетерогенное заболевание, которое обычно характеризуется хроническим воспалением дыхательных путей и сопровождается такими симптомами, как свистящие хрипы, одышка, заложенность в груди и кашель [1]. В отдельных регионах мира от БА страдает до 18% населения, а в целом мире диагноз БА был поставлен около 300 млн пациентов [2, 3]. В России общее число пациентов с диагнозом БА приближается к 10 млн человек, что составляет около 7% населения страны [4, 5]. Экономические потери от БА сопоставимы с ущербом от таких заболеваний, как диабет и цирроз печени. В США национальные медицинские расходы на борьбу с астмой оцениваются на уровне 18 млрд долл. в год; в странах Евросоюза примерно 17,7 млрд евро ежегодно [6, 7]. В России затраты государства на лечение пациентов с БА составляют примерно 130 млрд рублей в год [4].
С развитием молекулярно-биологических методов исследований и, главным образом, по мере активного использования генно-модифицированных животных удалось в значительной степени раскрыть молекулярные и клеточные механизмы патогенеза БА. В частности, была установлена роль Т112-клеток и врожденных лимфоидных клеток 2-го типа (ILC2 - type 2 innate lymphoid cells), а также продуцируемых ими цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-9 и ИЛ-13) в формировании основных проявлений БА: продукции аллерген-специфических антител класса IgE [8], развитии гиперреактивности бронхов (ГРБ), эозинофильного воспаления легких, ре-моделирования бронхов и др. [3, 9, 10].
Длительное время считалось, что БА развивается исключительно по Т1й-зависимому механизму, сопряженному с эозинофильным воспалением дыхатель-
ных путей и ^Е-опосредованной активацией тучных клеток. Однако к настоящему времени БА рассматривается как гетерогенное заболевание, включающее в себя несколько субгрупп патологии [11]. Накоплены экспериментальные свидетельства участия других воспалительных клеток - нейтрофилов - в патогенезе БА. В частности, количество нейтрофилов в мокроте коррелировало с тяжестью заболевания [12].
В отличие от эозинофильной, нейтрофильная астма трудно поддается традиционному лечению глюкокорти-костероидами [13, 14], и поэтому необходимы альтернативные терапевтические подходы. По эпидемиологическим данным до 10% пациентов с БА проявляют резистентность к терапии глюкокортикостероидами [15, 16]. На сегодняшний день в мировой научной литературе описано множество моделей БА (см. обзоры [17-19]), особенно с использованием мышей [20-22]. Однако в подавляющем большинстве работ моделируются проявления астмы с эозинофильным типом воспаления легких. С учетом вышесказанного, целью данной работы было создание модели нейтрофильной БА с использованием различных протоколов иммунизации у мышей.
Материал и методы
Лабораторные животные. Самок мышей линии БЛЬБ/с возрастом 6-8 нед, весом 18-20 г приобретали в питомнике лабораторных животных Филиала ИБХ РАН в г. Пущино (Россия). Животных кормили стандартным лабораторным кормом для грызунов («Дельта Фидс», Россия). Мышам был предоставлен неограниченный доступ к воде. Эксперименты на животных проводились в соответствии с принципами Директивы Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/Еи от 22 сентября 2010 г. по охране животных,
используемых в научных целях и были одобрены Этическим комитетом ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России.
Протокол эксперимента. Мыши были разделены на 4 группы (по 8 мышей в каждой). Животных первой группы (OVA/Alum) иммунизировали 3 раза (в дни 1, 14 и 28) внутрибрюшинно 0,2 мл смеси, состоящей из 20 мкг модельного аллергена овальбумина (OVA) (Sigma-Aldrich, США) и 2 мг адъюванта - гидроокиси алюминия [Al(OH)3] (Sigma-Aldrich, США). Мышам второй группы (OVA/FA) в том же объеме в первый день вводили внутрибрюшинно 20 мкг OVA эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда (Sigma-Aldrich, США). В 14-й и 28-й дни вводили вну-трибрюшинно 20 мкг OVA, эмульгированного в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда (Sigma-Aldrich, США). Третья группа лабораторных мышей (OVA/LPS) была иммунизирована по протоколу, аналогичному группе OVA/FA. В 42-44-й дни животным двух первых экспериментальных групп вводили раствор 10 мг/мл OVA в виде аэрозоля в течение 20 мин, а животным группы OVA/LPS - модельный аллерген в той же концентрации, но в смеси с 0,4 мг/мл ЛПС Escherichia coli (Sigma-Aldrich, США). Животные четвертой группы (Норма) никаким манипуляциям не подвергались. На 45-е сутки у мышей оценивали ГРБ и собирали кровь для определения уровней аллерген-специфических антител. На 46-й день мышей забивали цервикальной дислокацией и отбирали образцы бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) для последующего определения клеточного состава, левое легкое фиксировали в 10% формалине (Carl
Roth, Германия) для последующего изготовления гистологических срезов и оценки выраженности признаков воспаления (рис. 1).
Иммуноферментный анализ (ИФА). После последней аэрозольной провокации аллергеном из ретро-орбитального синуса мышей собирали периферическую кровь. Индивидуальные образцы сывороток получали путем центрифугирования при 350g в течение 15 мин при комнатной температуре и хранили при -70 °С до анализа. Уровни OVA-специфических антител IgE, IgG1 и IgG2a в сыворотке измеряли методом ИФА с использованием коммерческих наборов (Becton Dickinson, США).
Изучение гиперреактивности бронхов. Измерение ГРБ проводили на 45-е сутки после начала эксперимента. С помощью прибора для общей плетизмографии FinePointe NAM (Buxco, США) оценивали удельное сопротивление дыхательных путей (sRaw) в ответ на ингаляционное введение возрастающих концентраций ме-тахолина (Sigma-Aldrich, США): 6,25, 12,5 и 25 мг/мл. Методика детально описана в публикациях [20, 22].
Клеточный состав БАЛ. Взятие образцов БАЛ проводили на 46-й день эксперимента. Для этого у мышей сепарировали трахею и вводили в нее шприцем 0,5 мл полной среды RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 25 мМ HEPES («ПанЭко», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Филиппины), 300 мг/л L-глутамина («ПанЭко», Россия) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США), затем отбирали введенную в легкие жидкость. В полученных образцах проводили подсчет общего количества клеток в камере Горяева.
СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ
ПРОВОКАЦИЯ
1
OVA/Alum I-
14
ч-
28
Ч-
внутрибрюшинно
20 мкг OVA + 2 мг Al(OH)3
1
OVA/FA b
14
ч-
28
ч-
внутрибрюшинно
20 мкг OVA + 100 мкл НАФ
внутрибрюшинно
20 мкг OVA + 100 мкл ПАФ
42
ч-
43
ч-
44 45 46 Ч-1-1
аэрозольно
10 мг/мл OVA 20 мин
42
ч-
43
ч-
44
ч-
аэрозольно
10 мг/мл OVA 20 мин
45 46
ч—i
1
OVA/LPS Ь
14
ч-
28
ч-
внутрибрюшинно
20 мкг OVA + 100 мкл НАФ
внутрибрюшинно
20 мкг OVA + 100 мкл ПАФ
42
ч-
43
ч-
44
ч-
аэрозольно
10 мг/мл OVA + 0,4 мг/мл LPS 20 мин
45 46 Ч-1
1. БАЛ
2. Гистологический анализ
1. IgE, IgG1, IgG2a
2. ГРБ
Рис. 1. Дизайн исследования
Протоколы иммунизаций мышей модельным аллергеном трех экспериментальных групп (см. описание в тексте); OVA - овальбу-мин; ПАФ - полный адъювант Фрейнда; НАФ - неполный адъювант Фрейнда; LPS - липополисахарид, ГРБ - гиперреактивность бронхов; БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж.
Таблица 1. Последовательности праймеров и зондов
Ген-мишень Праймер/зонд Последовательность
Actb Прямой CTTTGCAGCTCCTTCGTTG
Зонд (ROX) GCCCTAGGCACCAGGGTGTGATG (RTQ2)
Обратный CACATAGGAGTCCTTCTGAC
Ifng Прямой AAATCCTGCAGAGCCAGATTAT
Зонд (ROX) ACGCTTATGTTGTTGCTGATGGCC (RTQ2)
Обратный GCTGTTGCTGAAGAAGGTAGTA
Il4 Прямой AGAGAGTGAGCTCGTCTGTAG
Зонд (FAM) CTCTGCAGCTCCATGAGAACACTAGAG (BHQ1)
Обратный GGTGCAGCTTATCGATG
Il17f Прямой GGATTACAACATCACTCGAGAC
Зонд (FAM) CAGACACTCAGGCTGCATCAATGC (RTQ1)
Обратный CAGGATTTCTTGCTGAATG
Далее образцы БАЛ центрифугировали в течение 7 минут при 2000 об/мин при 4 °C. Часть осадка клеток наносили на предметное стекло, высушивали около часа, затем фиксировали метанолом («Химмед», Россия) в течение 15 мин, после чего высушивали в течение 12 ч и окрашивали азур-эозином («ГЕМСТАНДАРТ-Р», Россия). Клеточный состав мазка БАЛ определяли с помощью световой микроскопии, проводя подсчет не менее 300 клеток на один мазок при увеличении в 400 раз.
Гистологические исследования ткани легких. Для приготовления микропрепаратов легкие после длительной фиксации в формалине обезвоживали путем проводки по спиртам и заливали образцы в парафин. Микро-томированием парафиновых блоков получали срезы легких толщиной 4-6 мкм. Полученные препараты окрашивали гематоксилин-эозином (Bio-Optica, Италия) для идентификации эозинофилов, нейтрофилов и лимфоцитов. Гистологическое исследование микропрепаратов легких осуществляли на световом микроскопе (Olympus, Япония). Проводили полуколичественную оценку воспалительных изменений и ремоделирования бронхов по методике, описанной в статье [23]. Выраженность признаков воспаления оценивали в баллах, где: «0» - отсутствует, «1» - слабая, «2» - умеренная, «3» - тяжелая.
Определение экспрессии генов в клетках БАЛ методом РВ-ПЦР. Общую РНК выделяли из клеток БАЛ с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем ее использовали в реакции обратной транскрипции для получения библиотеки кДНК с применением набора ОТ-1 («Синтол», Россия). При постановке реакции использовали неспецифические гексамерные прай-меры. Полученную кДНК в дальнейшем использовали для детекции мРНК генов-мишеней в образцах БАЛ при помощи ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) с применением амплификатора iCycler IQ5 (Bio-Rad, США) и специфической пары праймеров и зонда (табл. 1). В качестве контроля для последующей нормализации, определяли уровень экспрессии гена Actb, кодирующего ß-актин.
Статистический анализ данных. Для всех количественных данных вычисляли среднее арифметичес-
кое и стандартную ошибку среднего. Межгрупповые различия определяли с помощью непараметрического ^/-критерия Манна-Уитни. Для полуколичественных данных вычисляли медиану и межквартильный размах. Межгрупповые различия определяли с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Статистический анализ выполняли с применением программного обеспечения Statistica 12.0 (StatSoft inc., США).
Результаты
Изменение уровней специфических антител в сыворотке крови. На следующий день после последней провокации (на 45-й день) у мышей брали кровь для последующей количественной оценки уровней аллерген-специфический антител. Антитела класса IgE и субклассов IgG1, IgG2a наблюдались в образцах сывороток крови мышей всех трех экспериментальных групп. Уровни IgE и IgG2a были сопоставимы во всех трех группах, где моделировалась БА. Однако у мышей, иммунизированных аллергеном в комплексе с адъю-вантом Фрейнда (группы OVA/FA и OVA/LPS), рост уровней IgG1 был более существенным в сравнении с мышами, иммунизированными той же дозой аллергена, но в смеси с другим адъювантом - гидроокисью алюминия (группа OVA/Alum), в 2 и 3 раза соответственно (рис. 2А).
Изменение гиперреактивности бронхов. Гиперреактивность бронхов является характерной чертой БА. Поэтому через сутки после последней провокации аллергеном (45-й день) оценивали ГРБ мышей в ответ на ингаляционные введения возрастающих концентраций бронхоконстриктора метахолина. Во всех экспериментальных группах животных наблюдался статистически значимый рост ГРБ в сравнении с группой «Норма» (рис. 2, Б). Стоит отметить, что у мышей, иммунизированных смесью аллергена и адъюванта Фрейнда с последующей провокацией тем же аллергеном в смеси с ЛПС (группа OVA/LPS), развивалась менее выраженная ГРБ в сравнении с другими экспериментальными группами (группы OVA/FA и OVA/LPS). Прирост ГРБ в группе OVA/LPS в среднем составил 30%, в то время как в группах OVA/FA и OVA/LPS гиперреактивность
бронхов была повышена в среднем на 55% в сравнении с группой «Норма» (рис. 2Б).
Изменение клеточного состава БАЛ. Через 2 суток после последней провокации у мышей был изучен клеточный состав БАЛ. Статистически значимый рост количества клеток в БАЛ происходил во всех трех экспериментальных группах (OVA/Alum, OVA/FA и OVA/LPS) в сравнении с группой «Норма». Однако наибольший рост отмечался у мышей, иммунизированных аллергеном в комплексе с адъювантом Фрейнда с последующей провокацией тем же самым аллергеном в смеси с ЛПС (группа OVA/LPS). В этой группе количество клеток в БАЛ достигало 496 667 ± 72 049 кл/мл, что в 3,6 раза больше, чем у мышей, иммунизированных аллергеном в смеси с гидроокисью алюминия (группа OVA/Alum) и в 8,2 раза большей чем в группе «Норма» (рис. 3А).
Количество макрофагов в БАЛ у мышей из групп OVA/Alum и OVA/FA статистически значимо не отличалось от группы «Норма». Однако у мышей, получавших ингаляции смесью аллергена и ЛПС, выявлен значительный рост количества этих клеток, достигавший значения 384 156 ± 67 775 кл/мл, что в 7 раз превышает соответствующую величину в группе «Норма» (рис. 3Б).
Как ожидалось, значительное количество эозинофи-лов - 43 971 ± 12 182 кл/мл - выявлено в БАЛ мышей, иммунизированных аллергеном в смеси с гидроокисью алюминия (группа OVA/Alum). У мышей, иммунизированных аллергеном в смеси с другим адъювантом -адъювантом Фрейнда (группа OVA/FA), количество этих клеток в БАЛ было значительно меньше 10 800 ± 2 481 кл/мл. В группах «Норма» и «OVA/LPS» эозино-филы практически не выявлялись (рис. 3В).
Другие провоспалительные клетки - нейтрофилы, практический не обнаруживались у мышей, иммунизированных аллергеном в смеси с гидроокисью алюминия (2543 ± 1027 кл/мл), тогда как у мышей, получавших ингаляции аллергена в смеси с ЛПС (группа OVA/LPS), количество нейтрофилов было в 18 раз больше и достигало 39 800 ± 8843 кл/мл (рис. 3Г). Лимфоциты обнаруживались в значительных количествах в БАЛ всех трех экспериментальных групп - OVA/Alum, OVA/FA и OVA/LPS (рис. 3Д).
Гистологические изменения в ткани легких. Гистологический анализ выявил значительное воспаление в ткани легких у мышей всех трех экспериментальных групп (OVA/Alum, OVA/FA и OVA/LPS) в сравнении с группой «Норма». Гистологическое исследование в целом подтвердило данные, полученные при анализе клеточного состава БАЛ. В частности, инфильтрация дыхательных путей эозинофилами ожидаемо наблюдалась у мышей, иммунизированных аллергеном в смеси с гидроокисью алюминия (группа OVA/Alum), а также в группе OVA/FA. В то же время нейтрофилы в значительной степени выявлялись в группе OVA/LPS (рис. 4). Была оценена не только степень перибронхи-альной инфильтрации воспалительными клетками, но и выраженность признаков ремоделирования дыхательных путей, таких как: гипертрофия гладких мышц, ме-
ф 1,00
S 0,75 -------------
и
3 0,50 * *
С т rh
0 0,25 1
0,00 1
*#
i
*# i
ii
*
.1
i
IgG1 IgG2a
OVA/Alum □ OVA/FA □ OVA/LPS ■ Норма
6 12 25
Концентрация метахолина, мг/мл
i OVA/Alum S OVA/FA i OVA/LPS 5 Норма
Рис. 2. Уровни аллерген-специфических антител (A) и гиперреактивность бронхов в ответ на аэрозольное введение возрастающих концентраций метахолина (Б)
A - уровни аллерген-специфических антител класса IgE и субклассов IgG1 и IgG2a в сыворотке крови; представлены средние значения ± стандартная ошибка, n=8; Б - гиперреактивность бронхов оценивалась по показателю - удельное сопротивление дыхательных путей (sRaw); представлены средние значения см(Н20)хсек-1*мл-1 ± стандартная ошибка, n=8. Здесь и на рис. 2-5: * - статистически значимо отличается от группы «Норма»; # - статистически значимо отличается от группы «OVA/Alum» по U-критерию Манна-Уитни. Отличия принимались значимыми при р<0,05.
таплазия и гиперплазия бронхиальных клеток эпителия бронхов. Гипертрофия гладких мышц не наблюдалась ни в одной экспериментальной группе. Метаплазия и гиперплазия бокаловидных клеток бронхиального эпителия наблюдались во всех экспериментальных группах (OVA/Alum, OVA/FA и OVA/LPS), но не наблюдалась в группе «Норма» (рис. 4).
Экспрессия генов цитокинов в дыхательных путях. Методом количественного ПЦР-анализа была изучена экспрессия генов Ifng, Il4 и Il17f в клетках, выделенных из образцов БАЛ. Использование смеси OVA и ЛПС для ингаляции приводило к значительной (в 10 раз) активации экспрессии Il17f (рис. 5В). Экспрессия ИФН-у и IL-4 так же увеличивалась у этих мышей, однако не так значительно; в 7 и 4 раза, соответственно (рис. 5А, Б). Эти данные свидетельствуют о том, что развитие проявлений БА в данной модели происходит в большей степени по Th1- и ТЪ17-механизмам.
Обсуждение
Стандартная терапия кортикостероидами в подавляющем большинстве случаев позволяет хорошо контролировать течение БА. Однако примерно в 10% случаев
*
*
Э
Общее количество клеток
750 000
500 000
250 000
Э
Макрофаги
750 000
500 000
250 000
Эозинофилы
Нейтрофилы
75 000
50 000 -
25 000
75 000
50 000 -
25 000
Э
Лимфоциты
200 000
150 000 -
100 000 -
50 000
Рис. 3. Клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа
Представлены средние значения количества клеток в 1 мл БАЛ ± стандартная ошибка, п = 8.
0
0
0
0
0
*#
•к it it
it it it
I
Метаплазия Гиперплазия
Гипертрофия Эозинофилы Нейтрофилы Лимфоциты I OVA/Alum ■ OVA/FA ■ OVA/LPS ■ Норма
Общее воспаление
Рис. 4. Патологические изменения в ткани легких
Для оценки выраженности патологических процессов в дыхательных путях использовался полуколичественный метод оценки после дифференцированной окраски срезов органа гематоксилином и эозином. Выраженность признаков воспаления оценивали в баллах по следующей шкале: 0 - отсутствует; 1- слабая; 2 - умеренная; 3 - тяжелая. Представлены средние значения ± интерквартильный размах, п = 8.
наблюдается развитие тяжелой, стероид-резистентной астмы, которая сопровождается нейтрофильным воспалением в легких [14, 24-26]. Для того чтобы изучать механизмы нейтрофильной астмы, а также тестировать новые подходы к ее терапии, необходима разработка экспериментальной модели БА с преобладающим ней-трофильным типом воспаления.
Большинство описанных в научной литературе моделей БА воссоздают проявления так называемой эози-нофильной астмы (см. обзоры [17-19, 27]). Ее моделирование чаще всего осуществляется с использованием смеси модельного аллергена овальбумина и адъюванта -гидроокиси алюминия, которыми иммунизируют мышей с последующей аэрозольной провокацией тем же самым аллергеном. При таком протоколе у мышей формируются проявления БА (развитие ГРБ, продукция аллерген-специфических антител класса ^Е, ремодели-
рование дыхательных путей и т.д.), сопровождающиеся значительной инфильтрацией легких эозинофилами. При этом в индукции проявлений БА задействованы ТЬ2-зависимые механизмы [21, 22].
Существует несколько публикаций, в которых описаны протоколы экспериментальной индукции БА с нейтрофильным типом воспаления легких. Например, в работе Ito и соавт. [28] описана модель БА, в которой у мышей развивалось смешанное воспаление в легких. В этом исследовании мышей BALB/c иммунизировали высокой дозой OVA (50 вместо 20 мкг/мышь) в смеси с гидроокисью алюминия с последующей аэрозольной провокацией более концентрированным раствором аллергена (25 вместо 10 мг/мл). Такой протокол позволил индуцировать незначительное нейтрофильное воспаление в легких; доля этих клеток в перибронхиальных инфильтратах достигала 7%, в то время как доля эозино-
3
2
#
15
1О
Ifng
Ф
114
15
1О
Il17f
OVA/LPS Норма
OVA/LPS Норма
OVA/LPS Норма
Рис. 5. Изменение экспрессии цитокинов бронхоальвеолярного лаважа
Представлены средние значения относительной экспрессии генов цитокинов Ifng (A), Il4 (Б) и Il17f (В) ± стандартная ошибка, n = 8. Уровень экспрессии гена в группе «Норма» был принят за 1.
6
Ä
Ä
Ä
4
5
2
5
О
О
О
филов составляла 45%. Однако при системном введении таким мышам дексаметазона доля эозинофилов снижалась до 20%, а доля нейтрофилов, наоборот, возрастала до 50% [28]. Это связано с тем, что глюкокортикосте-роиды вызывают апоптоз эозинофилов [29] и в то же время пролонгируют период полужизни нейтрофилов [30]. Аналогичный эффект наблюдают и в клинической практике, когда у пациентов, получающих длительную терапию глюкокортикостероидными препаратами, накапливаются нейтрофилы в дыхательных путях [11]. В нашем исследовании у мышей, получавших иммунизации смесью OVA и гидроокиси алюминия (OVA/ Alum), нейтрофилы также обнаруживаются в БАЛ, но их доля незначительна и составляет менее 1% от общего количества клеток (рис. 3Г).
В работе Bogaert и соавт. [31] мышей иммунизировали модельным аллергеном овальбумином, но вместо гидроокиси алюминия использовали адъювант Фрейнда. В ходе этапа провокации мышам вводили те же аллергены в виде аэрозоля. В итоге авторы наблюдали формирование у мышей проявлений БА. Главным образом развивалось воспаление в ткани легких, в то время как другой важный признак патологии - ГРБ -авторами не оценивался. При анализе клеточного состава БАЛ была выявлена смешанная инфильтрация легких провоспалительными клетками - нейтрофилами и эозинофилами, содержание которых составляло 25 и 12%, соответственно, от общего количества клеток [31].
В другом исследовании описан аналогичный протокол иммунизации мышей линии C57BL/6 с использованием смеси OVA и адъюванта Фрейнда и последующей аэрозольной провокации OVA [32]. В результате у животных развивались ГРБ, гиперплазия бокаловидных клеток эпителия бронхов, а также детектировалось значительное количество нейтрофилов в БАЛ (около 50% от общего количества клеток), при этом эозинофилы также присутствовали в значительном количестве (20% от общего количества клеток). Вышеуказанные проявления патологии развивались по Th1-и ТЫ7-зависимым механизмам, так как наблюдалась значительная активация экспрессии ИФН-у и ИЛ-17. Системное введение дексаметазона не влияло на степень нейтрофильного воспаления в легких этих мышей и экспрессию ИФН-у и ИЛ-17 [32].
В данном исследовании мы применили описанный выше протокол, когда мышей иммунизировали OVA в смеси с адъювантом Фрейнда с последующей провокацией раствором OVA (группа OVA/FA). Аналогично, при анализе клеточного состава БАЛ мы наблюдали смешанную инфильтрацию легких нейтрофилами и эозинофилами, количество которых составило 5 900 ± 1766 кл/мл и 10 800 ± 2481 кл/мл, что соответствовало 3 и 6% от общего количества клеток в БАЛ (рис. 3В, Г). Кроме того, в отличие от исследования Bogaert и соавт. [31], мы регистрировали развитие выраженной ГРБ в данной группе мышей. Известно, что гидроокись алюминия является так называемым Th2-адъювантом, в то время как адъювант Фрейнда преимущественно
поляризует иммунный ответ по Th1- и ТЫ7-типу [33]. По всей видимости, замена гидроокиси алюминия на адъювант Фрейнда на этапе иммунизации привела к активации Th1- и ТЫ7-зависимых механизмов и, как следствие, к заметной инфильтрации легких нейтрофилами. Учитывая тот факт, что, как в нашем исследовании, так и в работах P. Bogaert и соавт. [31] и L. De-jager и соавт. [32], кроме нейтрофилов, в легких мышей в значительном количестве обнаруживались эозино-филы, можно предположить, что Th2-иммунный ответ на вводимый аллерген у этих мышей также был активирован. Это предположение подтверждается тем, что выявлена активация в БАЛ не только экспрессии ИФН-у и ИЛ-17, но и ^-цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-13) [31].
Опубликовано несколько исследований, в которых для индукции экспериментальной БА вместо OVA применяли причинно-значимый аллерген клещей домашней пыли (HDM) [34-37]. В работе Gavino и соавт. [34] раствор экстракта HDM вводили мышам ингаляционно в течение 3 недель без предварительной парентеральной иммунизации, после чего у них формировались признаки БА: ГРБ, гиперсекреция слизи и ремоделирование бронхов. В развитие этих патологический изменений лежат Th2-и ^П-зависимые механизмы, так как в легких мышей активировалась экспрессия как ИЛ-4, так и ИЛ-17 [34]. В другой работе H.T.T. Tan и соавт. [37] использовали похожий протокол, когда раствор HDM в высокой концентрации четырехкратно вводили мышам в виде аэрозоля. В результате также наблюдали нейтрофильное воспаление в легких, ГРБ, гиперсекрецию слизи и ремодели-рование респираторного тракта [37]. Такой эффект экстракта HDM авторы связывают с тем, что содержащийся в нем аллерген Dep p способствует формированию аллергической реакции, сопровождающейся продукцией аллерген-специфических антител класса IgE, инфильтрацией легких эозинофилами. В то же время содержащиеся в экстракте липополисахариды активируют Th17-опосредованную нейтрофилию легких [34].
Поэтому в ряде исследований для индукции нейтро-фильного типа воспаления применяли липополисаха-риды [35, 36, 38]. L. Xu и соавт. иммунизировали мышей внутрибрюшинно смесью OVA, HDM, гидроокиси алюминия и ЛПС с последующими провокациями OVA и HDM. Использование ЛПС способствовало значительному усилению нейтрофильного воспаления; доля этих клеток в БАЛ достигала 30% от их общего количества [35]. В работе An и соавт. ЛПС применялся не для иммунизации мышей, а для аэрозольной провокации в смеси с аллергеном OVA, что также приводило к значительной инфильтрации легких нейтрофилами, доля которых в БАЛ составляла в среднем 20% [36].
В нашем исследовании, в отличие от работ [35] и [36], на этапе сенсибилизации применялся OVA в смеси с адъювантом Френда с последующей провокацией смесью OVA и ЛПС (группа OVA/LPS). В результате в БАЛ значительно возрастало количество нейтрофилов (до 39 800 ± 8 843 кл/мл, что составляло ~10% от общего количества клеток) и макрофагов (до 384 156 ±
67 775 кл/мл, что составляло ~75% от общего количества клеток) (рис. 3Б, Г). Эти данные согласуются с результатами работы An и соавт., которые также выявили значительную инфильтрацию нейтрофилами (~20%) и макрофагами (~60%) легких мышей, подвергнутых ингаляциям смесью OVA и ЛПС [36]. Однако, в отличие от исследования [36], где инфильтрация эозинофилами также была высокой и составляла ~20% от общего количества клеток БАЛ, в нашем эксперименте эозинофилы не выявлялись (рис. 3В).
Следует отметить, что смешанная инфильтрация легких эозинофилами и нейтрофилами, которая наблюдается в подавляющем большинстве исследований в моделях на мышах [28, 31, 32, 35, 36], в целом соответствует клиническойкартине,наблюдаемойучеловека[11]. Однако для изучения механизмов нейтрофильного воспаления требуется создание модели на животных, в которой в очаге воспаления (в данном случае в легких) будут накапливаться преимущественно нейтрофилы. В данном исследовании мы описали протокол моделирования БА на мышах, при котором ткань легких экспериментальных животных преимущественно инфильтрирована нейтрофилами, а не эозинофилами. Для этого на этапе иммунизации животных аллергеном вместо гидроокиси алюминия использовали адъювант Фрейнда, а на этапе провокации мышам ингаляционно вводили смесь аллергена и липополисахарида. Такой протокол позволил воссоздать у мышей основные проявления БА: помимо нейтрофильного воспаления в легких (рис. 3Г, рис. 4), развивалась выраженная ГРБ (рис. 2Б) и формировались признаки ремоделирования респира-
торного тракта - гиперплазия и метаплазия эпителия бронхов (рис. 4).
Известно, что нейтрофильное воспаление тесно связано с активацией ТЪ17-клеток [39, 40], поэтому мы дополнительно изучили экспрессию маркерных генов Th1-, Th2- и ТЫ7-иммунного ответа в клетках БАЛ мышей группы OVA/LPS, в которой отмечалась максимальная нейтрофилия ткани легких. В качестве Thl-маркера был выбран ген Ifng, кодирующий ци-токин ИФН-у (рис. 5A), в качестве Th2-маркера - ген Il4, кодирующий цитокин ИЛ-4 (рис. 5Б), в качестве ТЫ7-маркера - ген Il17f, кодирующий цитокин ИЛ-17Б (рис. 5В). Мы подтвердили, что нейтрофильное воспаление в группе OVA/LPS ассоциировано с значительной активацией экспрессии гена Il17f (рис. 5В), в то время как экспрессия генов Ifng и Il4 увеличивалась, но не так значительно (рис. 5А, Б).
Таким образом, нами предложен протокол индукции экспериментальной нейтрофильной БА у мышей, который включает внутрибрюшинную иммунизацию смесью модельного аллергена овальбумина и адъюванта Фрейнда с последующей аэрозольной провокацией тем же самым аллергеном в смеси с ЛПС. Данный подход позволил воспроизвести основные проявления нейтрофильной БА: продукцию аллерген-специфических антител класса IgE, развитие гиперреактивности бронхов, ремоделирование респираторного тракта и инфильтрацию ткани легких нейтрофилами. При этом формирование данной патологии протекало по ТЫ7-зависимым механизмам, что соответствует клинической картине заболевания.
■ Литература
1. Bateman E.D., Hurd S.S., Barnes P. J., Bousquet J. et al. Global strategy for asthma management and prevention: GINA executive summary. Eur Respir J. 2018; 51 (2): 143-178. doi: 10.1183/13993003.513872007.
2. Linneberg A, Dam Petersen K, Hahn-Pedersen J, Hammerby E. et al. Burden of allergic respiratory disease: a systematic review. Clin Mol Allergy. 2016; 14: 12. doi: 10.1186/s12948-016-0049-9.
3. Akdis C.A., Agache I. Global Atlas of Asthma. Eur Acad Allergy Clin Immunol. 2013; 196.
4. Гудима Г.О., Ильина Н.И. Аллергия. Фундаментальные проблемы и практические вопросы. Иммунология. 2014; 35 (1): 48-50.
5. Козулина И.Е., Курбачева О.М., Ильина Н.И. Аллергия сегодня. Анализ новых эпидемиологических данных. Российский аллергологический журнал. 2014; 3: 3-10.
6. Bahadori K., Doyle-Waters M.M., Marra C., Lynd L. et al. Economic burden of asthma: a systematic review. BMC Pulm Med. 2009; 9 (1): 24. doi: 10.1186/1471-2466-9-24.
7. Accordini S., Corsico A.G., Braggion M., Gerbase M.W. et al. The cost of persistent asthma in Europe: an international population-based study in adults. Int Arch Allergy Immunol. 2013; 160 (1): 93101. doi: 10.1159/000338998.
8. Гущин И.С. IgE-опосредованная гиперчувствительность как ответ на нарушение барьерной функции тканей. Иммунология. 2015; 36 (1): 45-52.
9. Woodruff P.G., Modrek B., Choy D.F., Jia G. et al. T-helper type 2-driven inflammation defines major subphenotypes of asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2009; 180 (5): 388-395. doi: 10.1164/ rccm.200903-03920C.
10. Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Медуницын Н.В. Механизмы аллергической реакции немедленного типа, препараты и методы специфической иммунотерапии. Иммунология. 2016; 37 (1): 51-60.
11. Wenzel S.E. Asthma phenotypes: The evolution from clinical to molecular approaches. Nat Med. 2012; 18 (5): 716-725. doi: 10.1038/nm.2678.
12. Moore W.C., Hastie A.T., Li X., Li H. et al. Sputum neutrophil counts are associated with more severe asthma phenotypes using cluster analysis. J Allergy Clin Immunol. 2014; 133 (6): 1557-1563. e5. doi: 10.1016/j.jaci.2013.10.011.
13. Pelaia G., Vatrella A., Busceti M.T., Gallelli L. et al. Cellular mechanisms underlying eosinophilic and neutrophilic airway inflammation in asthma. Mediators Inflamm. 2015; 2015: 879783. doi: 10.1155/2015/879783.
14. Chambers E.S., Nanzer A.M., Pfeffer P.E., Richards D.F. et al. Distinct endotypes of steroid-resistant asthma characterized by IL-17A high and IFN-y high immunophenotypes: Potential benefits of calcitri-ol. J Allergy Clin Immunol. 2015; 136 (3): 628-637.e4. doi: 10.1016/ j.jaci.2015.01.026.
15. Dockrell M., Partridge M.R., Valovirta E. The limitations of severe asthma: The results of a European survey. Allergy Eur J Allergy Clin Immunol. 2007; 62 (2): 134-141. doi: 10.1111/j.1398-9995.2006.01304.x.
16. Holgate S.T., Polosa R. The mechanisms, diagnosis, and management of severe asthma in adults. Lancet. 2006; 368 (9537): 780-793. doi: 10.1016/S0140-6736(06)69288-X.
17. Shin Y.S., Takeda K., Gelfand E.W. Understanding asthma using animal models. Allergy, Asthma Immunol Res. 2009; 1 (1): 10-18. doi: 10.4168/aair.2009.1.1.10.
18. Aun M.V., Bonamichi-Santos R., Arantes-Costa F.M., Kalil J. et al. Animal models of asthma: utility and limitations. J Asthma Allergy. 2017; 10: 293-301. doi: 10.2147/JAA.S121092.
19. Mullane K., Williams M. Animal models of asthma: Reprise or reboot? Biochem Pharmacol. 2014; 87 (1): 131-139. doi: 10.1016/ j.bcp.2013.06.026.
20. Бабахин А. А., Шиловский И.П., Андреев И.В., Козмин Л. Д. и др. Экспериментальная аллергенспецифическая иммунотерапия аллерговакциной «Тимпол» на модели IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей. Иммунология. 2012; 33 (3): 134-141.
21. Shilovskiy I.P., Sundukova M.S., Babakhin А.А., GaisinaA.R. et al. Experimental protocol for development of adjuvant-free murine chronic model of allergic asthma. J Immunol Methods. 2019; 468: 10-19. doi: 10.1016/j.jim.2019.03.002.
22. Shilovskiy I.P., Babakhin A.A., Shershakova N.N., Kamysh-nikov O.Y. et al. Adjuvant and adjuvant-free protocols produce similar phenotypes of allergic asthma in mice. Curr Trends Immunol. 2015; 16: 79-91.
23. Ennis D.P., Cassidy J.P., Mahon B.P. Acellular pertussis vaccine protects against exacerbation of allergic asthma due to Bordetella pertussis in a murine model. Clin Diagn Lab Immunol. 2005; 12 (3): 409-417. doi: 10.1128/CDLI.12.3.409-417.2005.
24. Wenzel S.E., Schwartz L.B., Langmack E.L., Halliday J.L. et al. Evidence that severe asthma can be divided pathologically into two inflammatory subtypes with distinct physiologic and clinical characteristics. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160 (3): 1001-1008. doi: 10.1164/ajrccm.160.3.9812110.
25. Nakagome K., Matsushita S., Nagata M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. International Archives of Allergy and Immunology. 2012; 158: 96-102. doi: 10.1159/000337801.
26. Moore W.C., Hastie A.T., Li X., Li H. et al. Sputum neutro-phil counts are associated with more severe asthma phenotypes using cluster analysis. J Allergy Clin Immunol. 2014; 133 (6): 1557-1563. doi: 10.1016/j.jaci.2013.10.011.
27. Pichavant M., Goya S., Hamelmann E., Gelfand E.W. et al. Animal models of airway sensitization. Curr Protoc Immunol. 2007; 15 (15): 18. doi: 10.1002/0471142735.im1518s79.
28. Ito K., Herbert C., Siegle J.S., Vuppusetty C. et al. Steroid-resistant neutrophilic inflammation in a mouse model of an acute exacerbation of asthma. Am J Respir Cell Mol Biol. 2008; 39 (5): 543-550. doi: 10.1165/rcmb.2008-0028OC.
29. Woolley K.L., Gibson P.G., Carty K., Wilson A.J. et al. Eosin-ophil apoptosis and the resolution of airway inflammation in asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1996; 154 (1): 237-243. doi: 10.1164/ ajrccm.154.1.8680686.
30. Kato T., Takeda Y., Nakada T., Sendo F. Inhibition by dexa-methasone of human neutrophil apoptosis in vitro. Nat Immun. 1995; 14 (4): 198-208.
31. Bogaert P., Naessens T., de Koker S., Hennuy B. et al. Inflammatory signatures for eosinophilic vs. neutrophilic allergic pulmonary inflammation reveal critical regulatory checkpoints. Am J Physiol -Lung Cell Mol Physiol. 2011; 300 (5): 679-690. doi: 10.1152/aj-plung.00202.2010.
32. Dejager L., Dendoncker K., Eggermont M., Souffriau J. et al. Neutralizing TNFa restores glucocorticoid sensitivity in a mouse model of neutrophilic airway inflammation. Mucosal Immunol. 2015; 8: 1-14. doi: 10.1038/mi.2015.12.
33. Knudsen N.P.H., Olsen A., Buonsanti C., Follmann F. et al. Different human vaccine adjuvants promote distinct antigen-independent immunological signatures tailored to different pathogens. Sci Rep. 2016; 6: 19570. doi: 10.1038/srep19570.
34. Gavino A.C., Nahmod K., Bharadwaj U., Makedonas G. et al. STAT3 inhibition prevents lung inflammation, remodeling, and accumulation of Th2 and Th17 cells in a murine asthma model. Allergy Eur J Allergy Clin Immunol. 2016; 71 (12): 1684-1692. doi: 10.1111/all. 12937.
35. Xu L., Sun W.J., Jia A.J., Qiu L.L. et al. MBD2 regulates differentiation and function of Th17 cells in neutrophils- dominant asthma via HIF-1a. J Inflamm (United Kingdom). 2018; 15 (1): 1-12. doi: 10.1186/s12950-018-0191-x.
36. An T.J., Rhee C.K., Kim J.H., Lee Y.R. et al. Effects of mac-rolide and corticosteroid in neutrophilic asthma mouse model. Tu-berc Respir Dis (Seoul). 2018; 81 (1): 80-87. doi: 10.4046/trd.2017. 0108.
37. Tan H.T.T., Hagner S., Ruchti F., Radzikowska U. et al. Tight junction, mucin, and inflammasome-related molecules are differentially expressed in eosinophilic, mixed, and neutrophilic experimental asthma in mice. Allergy Eur J Allergy Clin Immunol. 2019; 74 (2): 294-307. doi: 10.1111/all.13619.
38. Бабахин А.А., Ласкин А.А., Никонова А.А., Камышников О.Ю. и др. Моделирование бронхиальной астмы с нейтро-фильным фенотипом воспаления. Иммунология. 2017; 38 (4): 199205.
39. Liu W., Liu S., Verma M., Zafar I. et al. Mechanism of TH2/TH17-predominant and neutrophilic TH2/TH17-low subtypes of asthma. J Allergy Clin Immunol. 2017; 139 (5): 1548-1558. doi: 10.1016/j.jaci.2016.08.032.
40. Morishima Y., Ano S., Ishii Y., Ohtsuka S. et al. Th17-asso-ciated cytokines as a therapeutic target for steroid-insensitive asthma. Clin Dev Immunol. 2013; 2013: 1-9. doi: 10.1155/2013/609395.
■ References
1. Bateman E.D., Hurd S.S., Barnes P.J., Bousquet J., et al. Global strategy for asthma management and prevention: GINA executive summary. Eur Respir J. 2018; 51 (2): 143-178. doi: 10.1183/13993003.513872007.
2. Linneberg A., Dam Petersen K., Hahn-Pedersen J., Hammerby E., et al. Burden of allergic respiratory disease: a systematic review. Clin Mol Allergy. 2016; 14: 12. doi: 10.1186/s12948-016-0049-9.
3. Akdis C.A., Agache I. Global Atlas of Asthma. Eur Acad Allergy Clin Immunol. 2013; 196.
4. Gudima G.O., Ilina N.I. Allergy - basic problems and practical questions. Immunologiya. 2014; 35 (1): 48-50. (in Russian)
5. Kozulina I.E., Kurbacheva O.M., Ilina N.I. Allergy today. Analysis of new epidemiological data. Rossijskij allergologicheskij zhurnal. 2014; 3: 3-10. (in Russian)
6. Bahadori K., Doyle-Waters M.M., Marra C., Lynd L., et al. Economic burden of asthma: a systematic review. BMC Pulm Med. 2009; 9 (1): 24. doi: 10.1186/1471-2466-9-24.
7. Accordini S., Corsico A.G., Braggion M., Gerbase M.W., et al. The cost of persistent asthma in Europe: an international population-based study in adults. Int Arch Allergy Immunol. 2013; 160 (1): 93101. doi: 10.1159/000338998.
8. Gushchin I.S. IgE-mediated hypersensitivity as a response to barrier tissue disfunction. Immunologiya. 2015; 36 (1): 45-52. (in Russian)
9. Woodruff P.G., Modrek B., Choy D.F., Jia G., et al. T-helper type 2-driven inflammation defines major subphenotypes of asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2009; 180 (5): 388-395. doi: 10.1164/ rccm.200903-0392OC.
10. Soldatov A.A., Avdeeva Z.I., Medunitsin N.V. Mechanisms of allergic reactions of immediate type, drugs and methods of immuno-therapy. Immunologiya. 2016; 37 (1): 51-60. (in Russian)
11. Wenzel S.E. Asthma phenotypes: The evolution from clinical to molecular approaches. Nat Med. 2012; 18 (5): 716-725. doi: 10.1038/nm.2678.
12. Moore W.C., Hastie A.T., Li X., Li H., et al. Sputum neutrophil counts are associated with more severe asthma phenotypes using cluster analysis. J Allergy Clin Immunol. 2014; 133 (6): 1557-1563. e5. doi: 10.1016/j.jaci.2013.10.011.
13. Pelaia G., Vatrella A., Busceti M.T., Gallelli L. et al. Cellular mechanisms underlying eosinophilic and neutrophilic airway inflammation in asthma. Mediators Inflamm. 2015; 2015: 879783. doi: 10.1155/2015/879783.
14. Chambers E.S., Nanzer A.M., Pfeffer P.E., Richards D.F., et al. Distinct endotypes of steroid-resistant asthma characterized by IL-17A high and IFN-y high immunophenotypes: Potential benefits of calcitriol. J Allergy Clin Immunol. 2015; 136 (3): 628-637.e4. doi: 10.1016/j.jaci.2015.01.026.
15. Dockrell M., Partridge M.R., Valovirta E. The limitations of severe asthma: The results of a European survey. Allergy Eur J Allergy Clin Immunol. 2007; 62 (2): 134-141. doi: 10.1111/j.1398-9995.2006.01304.x.
16. Holgate S.T., Polosa R. The mechanisms, diagnosis, and management of severe asthma in adults. Lancet. 2006; 368 (9537): 780-793. doi: 10.1016/S0140-6736(06)69288-X.
17. Shin Y.S., Takeda K., Gelfand E.W. Understanding asthma using animal models. Allergy, Asthma Immunol Res. 2009; 1 (1): 10-18. doi: 10.4168/aair.2009.1.1.10.
18. Aun M.V., Bonamichi-Santos R., Arantes-Costa F.M., Kalil J., et al. Animal models of asthma: utility and limitations. J Asthma Allergy. 2017; 10: 293-301. doi: 10.2147/JAA.S121092.
19. Mullane K., Williams M. Animal models of asthma: Reprise or reboot? Biochem Pharmacol. 2014; 87 (1): 131-139. doi: 10.1016/ j.bcp.2013.06.026.
20. Babakhin A.A., Shilovsky I.P., Andreev I.V., Kozmin L.D., et al. Experimental allergen-specific immunotherapy with the use of a Timpol allergovaccine as exemplified by the murine model of IgE-dependent bronchial asthma. Immunologiya. 2012; 33 (3): 134-141. (in Russian)
21. Shilovskiy I.P., Sundukova M.S., Babakhin A.A., Gaisina A.R., et al. Experimental protocol for development of adjuvant-free murine chronic model of allergic asthma. J Immunol Methods. 2019; 468 (March): 10-19. doi: 10.1016/j.jim.2019.03.002.
22. Shilovskiy I.P., Babakhin A.A., Shershakova N.N., Kamysh-nikov O.Y., et al. Adjuvant and adjuvant-free protocols produce similar phenotypes of allergic asthma in mice. Curr Trends Immunol. 2015; 16: 79-91.
23. Ennis D.P., Cassidy J.P., Mahon B.P. Acellular pertussis vaccine protects against exacerbation of allergic asthma due to Bordetella pertussis in a murine model. Clin Diagn Lab Immunol. 2005; 12 (3): 409-417. doi: 10.1128/CDLI.12.3.409-417.2005.
24. Wenzel S.E., Schwartz L.B., Langmack E.L., Halliday J.L., et al. Evidence that severe asthma can be divided pathologically into two inflammatory subtypes with distinct physiologic and clinical characteristics. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160 (3): 1001-1008. doi: 10.1164/ajrccm.160.3.9812110.
25. Nakagome K., Matsushita S., Nagata M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. International Archives of Allergy and Immunology. 2012; 158: 96-102. doi: 10.1159/000337801.
26. Moore W.C., Hastie A.T., Li X., Li H., et al. Sputum neutro-phil counts are associated with more severe asthma phenotypes using cluster analysis. J Allergy Clin Immunol. 2014; 133 (6): 1557-1563. doi: 10.1016/j.jaci.2013.10.011.
27. Pichavant M., Goya S., Hamelmann E., Gelfand E.W. et al. Animal models of airway sensitization. Curr Protoc Immunol. 2007; 15 (15): 18. doi: 10.1002/0471142735.im1518s79.
28. Ito K., Herbert C., Siegle J.S., Vuppusetty C., et al. Steroid-resistant neutrophilic inflammation in a mouse model of an acute exacerbation of asthma. Am J Respir Cell Mol Biol. 2008; 39 (5): 543-550. doi: 10.1165/rcmb.2008-00280C.
29. Woolley K.L., Gibson P.G., Carty K., Wilson A.J. et al. Eosin-ophil apoptosis and the resolution of airway inflammation in asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1996; 154 (1): 237-243. doi: 10.1164/ ajrccm.154.1.8680686.
30. Kato T., Takeda Y., Nakada T., Sendo F. Inhibition by dexa-methasone of human neutrophil apoptosis in vitro. Nat Immun. 1995; 14 (4): 198-208.
31. Bogaert P., Naessens T., de Koker S., Hennuy B., et al. Inflammatory signatures for eosinophilic vs. neutrophilic allergic pulmonary inflammation reveal critical regulatory checkpoints. Am J Physiol -Lung Cell Mol Physiol. 2011; 300 (5): 679-690. doi: 10.1152/aj-plung.00202.2010.
32. Dejager L., Dendoncker K., Eggermont M., Souffriau J., et al. Neutralizing TNFa restores glucocorticoid sensitivity in a mouse model of neutrophilic airway inflammation. Mucosal Immunol. 2015; 8: 1-14. doi: 10.1038/mi.2015.12.
33. Knudsen N.P.H., Olsen A., Buonsanti C., Follmann F., et al. Different human vaccine adjuvants promote distinct antigen-independent immunological signatures tailored to different pathogens. Sci Rep. 2016; 6: 19570. doi: 10.1038/srep19570.
34. Gavino A.C., Nahmod K., Bharadwaj U., Makedonas G., et al. STAT3 inhibition prevents lung inflammation, remodeling, and accumulation of Th2 and Th17 cells in a murine asthma model. Allergy Eur J Allergy Clin Immunol. 2016; 71 (12): 1684-1692. doi: 10.1111/all.12937.
35. Xu L., Sun W.J., Jia A.J., Qiu L.L., et al. MBD2 regulates differentiation and function of Th17 cells in neutrophils- dominant asthma via HIF-1a. J Inflamm (United Kingdom). 2018; 15 (1): 1-12. doi: 10.1186/s12950-018-0191-x.
36. An T.J., Rhee C.K., Kim J.H., Lee Y.R., et al. Effects of mac-rolide and corticosteroid in neutrophilic asthma mouse model. Tuberc Respir Dis (Seoul). 2018; 81 (1): 80-87. doi: 10.4046/trd.2017.0108.
37. Tan H.T.T., Hagner S., Ruchti F., Radzikowska U., et al. Tight junction, mucin, and inflammasome-related molecules are differentially expressed in eosinophilic, mixed, and neutrophilic experimental asthma in mice. Allergy Eur J Allergy Clin Immunol. 2019; 74 (2): 294-307. doi: 10.1111/all.13619.
38. Babakhin A.A., Laskin A.A., Nikonova A.A., Kamishni-kov O.Yu., et al. Modelling of bronchial asthma with neutrophilic phe-notype of inflammation. Immunologiya. 2017; 38 (4): 199-205. (in Russian)
39. Liu W., Liu S., Verma M., Zafar I., et al. Mechanism of TH2/TH17-predominant and neutrophilic TH2/TH17-low subtypes of asthma. J Allergy Clin Immunol. 2017; 139 (5): 1548-1558. doi: 10.1016/j.jaci.2016.08.032.
40. Morishima Y., Ano S., Ishii Y., Ohtsuka S., et al. Th17-asso-ciated cytokines as a therapeutic target for steroid-insensitive asthma. Clin Dev Immunol. 2013; 2013: 1-9. doi: 10.1155/2013/609395.
