Синтетические siRNA эффективно подавляют экспрессию провоспалительного цитокина интерлейкина-4 мыши in vitro Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012

ЦИТОКИНЫ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012

УДК 616-056.43-092:612.017.1]-078.33:577.27.08

И. П. Шиловский, Д. В. Мазуров, Н. Н. Шершакова, Л. С. Литвин, В. А. Гасанов,

М. Р Хаитов

СИНТЕТИЧЕСКИЕ siRNA ЭФФЕКТИВНО ПОДАВЛЯЮТ ЭКСПРЕССИЮ

провоспалительного цитокина интерлейкина-4 мыши IN VITRO

Лаборатория молекулярной иммунологии ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России (115478, г Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2)

В индукции и поддержании аллергического воспаления основополагающую роль играют провоспалительные цитокины или так называемые проаллергические цитокины. Ключевую роль в формировании аллергических состояний, таких как бронхиальная астма, играет IL-4. В частности, он обеспечивает переключение синтеза классов антител с IgM в IgE, а также является фактором роста базофилов и тучных клеток. Известны успешные попытки создания терапевтических препаратов, подавляющих активацию IL-4 посредством моноклональных антител, однако данный подход не получил дальнейшего продолжения. Таким образом, продолжает оставаться актуальным поиск методов эффективного подавления экспрессии гена IL-4. Недавнее открытие механизма интерференции РНК (РНКи) дало новые возможности для регуляции экспрессии генов. Для активации РНКи требуются молекулы малых интерферирующих РНК (миРНК) - так называемые siRNA (short interfering RNA), последовательность которых на 100% сходна с последовательностью мРНК-мишени. В данной работе мы попытались спроектировать молекулы siRNA для эффективного подавления (сайленсинга) экспрессии гена il-4 мыши в экспериментах in vitro. Методами in silico спроектированы 6 потенциально эффективных молекул siRNA и оценена их способность блокировать экспрессию гена-мишени в эксперименте in vitro. Как оказалось, два варианта синтетических молекул обеспечивают репрессию мышиного IL-4.

Ключевые слова: IL-4, РНК-интерференция, миРНК, сайленсинг, экспрессия гена Shilovsky I.P., MazurovD.V., Shershakova N.N., Litvin L.S., Gasanov V.A., Khaitov M.R.

siRNA SUPPRESSES THE EXPRESSION OF MURINE PROINFLAMMATORY INTERLEUKINE-4 IN viTRo

Activation of proinflammatory cytokines including IL-4, IL-5, IL-9 and IL-13 plays an important role in the induction and maintenance of the majority of the allergic diseases associated with allergic inflammation. Interleukin-4 makes an especially important contribution to pathogenesis of allergic conditions, such as bronchial asthma. Specifically, IL-4 provides a switch of antibody synthesis from IgM to IgE; moreover, it functions as the growth factor for mast cells and basophils. Successful attempts to create therapeutic preparations that suppress IL-4 activation by monoclonal antibody have been reported. However, these investigations were not continued. Therefore, the search for the methods to effectively suppress IL-4 remains a topical problem. The recent discovery of RNA-interference (RNAi) phenomena provides new possibilities for the regulation of gene expression. The activation of RNAi requires the use of siRNA molecules (short interfering RNAs) the sequence of which is 100% identical with that of the respective mRNA-target. In the present study, we designed siRNA molecules for the effective suppression (silencing) of murine Il-4 gene in vitro. Six potentially effective variants of siRNA molecules were designed in silico and their ability to suppress the expression and production of the target gene in vitro was estimated. It was demonstrated that two of these siRNAs variants were able to significantly suppress both IL-4 expression and production.

Keywords: IL-4, RNA interference, siRNA, silencing, gene expression

Введение. Аллергические состояния у человека, такие как аллергический ринит и конъюнктивит, пищевая аллергия, атопический дерматит, астма, являются генетически детерминированной группой заболеваний и характеризуются повышенной способностью В-лимфоцитов синтезировать аллергенспецифичные IgE-антитела. Характерной особенностью указанных выше состояний является аллергическое воспаление в органах-мишенях - результат комплексного взаимодействия тучных клеток, эозинофилов, Т-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток. В индукции и поддержании аллергического воспаления основополагающую роль играют провоспалительные

Шиловский Игорь Петрович - канд. биол. наук, науч. сотр., тел. 8 (926) 183-93-94, e-mail:igorshilovski@yandex.ru

цитокины или так называемые проаллергические цитокины. К ним относятся интерлейкины: IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13. Основным источником IL-4, IL-5, IL-13 являются активированные Т-хелперы второго типа (Th2) [11]. Дополнительным источником интерлейкинов в тканях могут быть эозинофилы, базофилы, тучные клетки, активация которых сопровождается экспрессией данных генов и последующей секрецией зрелых продуктов.

Упомянутые выше цитокины относятся к типичным ТЬ2-цитокинам, их эффекты сильно перекрываются, однако между ними есть и определенное разделение труда. Так, IL-4 играет ключевую роль в подготовке аллергических процессов (синтез IgE, развитие тучных клеток). IL-5 служит главным фактором привлечения эозинофилов в очаг воспаления [15]. При поздних про-

- 66 -

ЦИТОКИНЫ

явлениях аллергии основная роль принадлежит IL-13. IL-9 выступает в качестве вспомогательного фактора в большинстве упомянутых процессов [4]. IL-4 и IL-13 обладают сходной биологической активностью, стимулируют синтез IgE, играющего решающую роль в развитии аллергических реакций. Однако IL-13 дополнительно вызывает гиперреактивность бронхов, усиливает секрецию и эозинофилию в легких, а также продукцию эотаксина - члена суперсемейства хемо-кинов, ответственного за привлечение эозинофилов в ткани [12]. IL-9 увеличивает количество тучных клеток в легочной ткани и активацию гиперсекреции слизи эпителием дыхательных путей [14].

Целый ряд экспериментальных фактов свидетельствует о тесной связи активации ^2-клеток с аллергией у человека. Это в первую очередь относится к одному из наиболее тяжелых проявлений аллергии - бронхиальной астме (БА). Экспериментальные данные свидетельствуют, что наибольшее значение в формировании астмы принадлежит IL-4, который является основным секретируемым продуктом Th2, а также выполняет роль медиатора дифференцировки предшественников Т-хелперов в Th2. Ключевое значение IL-4 в патогенезе БА подтверждается результатами экспериментов с knockout-мышами по гену IL-4 (IL-4 -/-). У данных мышей почти полностью отсутствовало большинство симптомов астмы при стандартном моделировании этого состояния в эксперименте [15].

IL-4 имеет широкий спектр биологической активности, в частности усиливает пролиферацию В-лимфоцитов после распознавания антигена, а также регулирует синтез определенных классов антител (у человека - IgE и IgG4), участвующих преимущественно в развитии аллергии [1]. В частности, известно, что IL-4 связан с переключением синтеза тяжелых цепей молекул иммуноглобулинов от IgM в направлении IgE либо IgG4 [7]. Благодаря множеству биологических функций IL-4 может считаться одним из главных регуляторов развития аллергических реакций и аллергического воспаления в тканях, так как, помимо индукции синтеза указанных классов антител, этот цитокин является ростовым фактором для базофилов, тучных клеток и эозинофилов и усиливает экспрессию в этих клетках рецепторов Fc-фрагментов IgE (CD23).

Центральная роль IL-4 в ^2-ответе послужила основанием для попыток блокировать активность данного цитокина. Для этой цели использовали мутантный IL-4 (H124B), антитела к IL-4, рекомбинантный растворимый рецептор IL-4 (sIL-4R) [2]. К настоящему времени к клиническим испытаниям был допущен sIL-4R. Аэрозольное введение данного препарата привело к предотвращению нарушений функции дыхания на фоне отмены кортикостероидов у больных БА. Последующий 12-недельный поддерживающий курс аэрозольного препарата растворимого рецептора IL-4 позволил избежать развития приступов астмы у этих больных [5]. Тем не менее первые обнадеживающие результаты анти-^-4-терапии при астме в дальнейшем не получили подтверждения, и в настоящее время клинические испытания данного препарата прекращены. Таким образом, остается актуальным поиск способов эффективного подавления экспрессии гена IL-4.

С открытием механизма РНК-интерференции

(РНКи) в 1998 г. [10] ученые получили многообещающий и относительно простой инструмент для специфического подавления экспрессии генов. РНКи является естественным физиологическим процессом клетки, при котором экзогенная двухцепочечная молекула РНК, или эндогенная шпилечная молекула РНК, разрезается ферментом Dicer на малые интерферирующие РНК (siRNA) размером 21-26 п. н., которые обеспечивают специфическое посттранскрипционное подавление экспрессии генов посредством комплементарного связывания и деградации соответствующей мРНК-мишени или ингибирования трансляции мРНК [13].

К настоящему времени самым распространенным методом инициации РНКи является введение в клетку синтетических молекул siRNA размером 21-22 п. н.

[8], при этом теоретически можно спроектировать siRNA к любому интересующему гену и подавить его экспрессию. Поэтому в данной работе мы попытались спроектировать молекулы siRNA, которые бы эффективно подавляли экспрессию гена il-4 мыши.

Материалы и методы. Клеточные линии. В работе использованы клетки эмбриональной почки человека НЕК293Т, предоставленные ФГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России. Для роста клеток использовали полную питательную среду DMEM (“ПанЭ-ко”), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (“ПанЭко”), 300 мг/л глутамина (“ПанЭко”), 80 мг/л гентамицина (“Gibgo”) и 25 мМ HEPES (“ПанЭко”). Культивирование клеток проводили при 37oC в 5% атмосфере CO2. Трансфекцию клеток НЕК293Т осуществляли с использованием коммерческого реагента Lipofectamine 2000 (“Invitrogen”) в соответствии с рекомендациями производителя.

Экспрессия мышиного IL-4 in vitro

В ходе предыдущей работы из ConA-стимулированных клеток селезенки мыши BALB/c выделен полноразмерный ген il-4 и клонирован в плазмидный вектор под CMV, промо-тером в бицистронный вектор pUCHR IRES GFP. Благодаря этому удалось получить рекомбинантную плазмиду pUCHR IRES IL4 GFP, способную экспрессировать мышиный IL-4 в клетках эмбриональной почки человека НЕК293Т. Данные клетки для экспрессии клонированного цитокина были выбраны вследствие их высокой трансфекционной и экспрессионной способности. Применяя коммерческие трансфекци-онные реагенты, такие как Lipofectаmine 2000 (“Invitrogen”), использованный в данной работе, удавалось добиться высокой (50-90%) эффективности трансфекции клеток НЕК293Т всей популяции клеток, что очень важно при тестировании спроектированных siRNA, которые также необходимо доставлять в клетки в большой концентрации.

Важным преимуществом разработанной модели экспрессии IL-4 in vitro является то, что клонированный ген il-4 и репортерный gfp транскрибируются с рекомбинантной плазмиды в виде одного РНК-транскрипта, с которого затем транслируются 2 отдельных белка, один из них - GFP, ген которого находился downstream относительно клонированного il-4, а другой непосредственно IL-4. Благодаря этому уровень экспрессии модельного il-4 можно оценивать визуально - методом флюоресцентной микроскопии, что является простым и удобным способом при тестировании большого количества различных молекул siRNA. Кроме того, уровень экспрессии il-4 можно оценивать методом проточной цитометрии по интенсивности флюоресценции GFP+-клеток. Однако самым важным методом контроля экспрессии il-4 является определение концентрации непосредственно самого белкового продукта - мышиного IL-4 методом твердофазного ИФА. Поскольку IL-4 является секре-тируемым белком, то его концентрация оценивается преимущественно в клеточных супернатантах [3].

- 67 -

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012

Проектирование последовательности siRNA.

Последовательности siRNA проектировали с использованием интернет-приложения siRNA Target Finder (http:// www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). Согласно инструкции разработчиков, каждая вторая siRNA, спроектированная с помощью данного приложения, обеспечивает подавление гена-мишени на 50%. Синтез siRNA осуществлен в компании “Синтол”.

Количественная ПЦР.

Общую РНК из клеток НЕК293Т, котрансфецированных рекомбинантной плазмидой, и спроектированными siRNA выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (“Qiagen”) в соответствии с рекомендациями производителя. Обратную транскрипцию проводили с помощью набора RevertAid H Minus Strand cDNA Synthesis Kit (“Fermentas”) согласно инструкции производителя. Для обратной транскрипции использовали Random gexamer primer. Количественную ПЦР проводили в присутствии Sybr Green I с использованием набора реактивов (“Синтол”). Для количественной ПЦР использовали праймеры, направленные к гену il-4 мыши (прямой праймер: mIL4-F AGATGGATGTGCCAAACGTCCTCA, обратный праймер: mIL4-R AATATGCGAAGCACCTTGGAAGCC). Размер ам-пликона составляет 88 п. н. Реакцию проводили в конечном объеме 25 мкл в соответствии с рекомендациями производителя с использованием термоциклера BioRad IQ5. Для построения калибровочной кривой использовали образцы с известным количеством копий плазмидной ДНК, несущей ген il-4.

Оценка экспрессии IL-4 методом ИФА.

Количество IL-4 мыши в клеточных супернатантах клеток НЕК293Т проводили методом твердофазного ИФА с использованием набора Mouse IL-4 ELISA Set (“BD”) в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве контрольных образцов брали супернатанты клеток без стимуляции ConA. Для получения кДНК использовали набор RevertAid H Minus Strand cDNA Synthesis Kit (“Fermentas”) в соответствии с рекомендациями производителя.

Результаты

Дизайн молекул siRNA против мРНК гена il-4 мыши

Последовательность клонированного нами гена il-4 мыши соответствовала последовательности № М25892.1, депонированной в GeneBank. Структура кодирующей части il-4 была проанализирована, и с помощью специализированной программы удалось подобрать к мРНК-П-4 25 вариантов siRNA. Для дальнейших исследований выбраны 6 из них, в наибольшей степени соответствующие необходимым критериям [6, 9]. Во-первых, молекулы siRNA должны отжигаться с мРНК-мишенью не ближе чем 100 нуклеотидов от сайта инициации, так как эта область мРНК активно связывается с различными регуляторными белками и факторами трансляции, что может создавать пространственные препятствия для эффективного отжига с антисмысловой цепью siRNA. Во-вторых, последовательность спроектированных siRNA не должна иметь 100% сходства с последовательностями мРНК других генов мыши иначе это приведет к сайленсингу не только гена il-4, но и других генов-мишеней. Последовательности выбранных siRNA, направленных против мРНК-й-4, представлены в таблице. В качестве положительного контроля использовали siGFP, которая, по нашим данным, подавляла экспрессию IL-4 до 10 раз [3]. В качестве положительного контроля использовали siP4, направленную против гена p респираторносинцитиального вируса, последовательность данной siRNA не имеет 100% сходства ни с последовательностью il-4 мыши, ни с последовательностью gfp.

Последовательности молекул siRNA, направленных против мРНК гена il-4 мыши и контрольные siRNA

Название миРНК Последовательности смысловой и антисмысловой цепей миРНК

siIL4-127 5'-CGAGGUCACAGGAGAAGGGtt-3' 3'-ttGCUCCAGUGUCCUCUUCCC-5'

siIL4-174 5'-ACGUCCUCACAGCAACGAAtt-3 3'-ttUGCAGGAGUGUCGUUGCUU-5'

siIL4-267 5'-CUCCAUGCUUGAAGAAGAAtt-3' 3'-ttGAGGUACGAACUUCUUCUU-5'

siIL4-280 5'-GAAGAACUCUAGUGUUCUCtt-3' 3'-ttCUUCUUGAGAUCACAAGAG-5'

siIL4-373 5'-AGACUUCCUGGAAAGCCUAtt-3' 3'-ttUCUGAAGGACCUUUCGGAU-5'

siIL4-408 5'-AGAGCAUCAUGCAAAUGGAtt-3 3'-ttUCUCGUAGUACGUUUACCU-5'

siGFP* 5'-CAAGCUGACCCUGAAGUUCtt-3' 3'-ttGUUCGACUGGGACUUCAAG-5'

siP4** 5'-UGCUGUUGACAGUGAGCGAtt-3' 3'-ttACGACAACUGUCACACGCG-5'

Примечание. * - последовательности siRNA, направленная против мРНК гена gfp. Используется в качестве положительного контроля. ** - последовательность siRNA, направленная против мРНК гена p респираторно-синцитиального вируса (RSV). Используется в качестве отрицательного контроля.

Сайленсинг гена il-4 мыши молекулами siRNA в эксперименте in vitro

Созданная модель экспрессии гена il-4 мыши в клетках НЕК293Т использована для тестирования эффективности сайленсинга данного гена спроектированными молекулами siRNA. Для этого 1 • 105 клеток НЕК293Т трансфецировали смесью, состоящей из 0,5 мкг плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP и 1 мкг соответствующей siRNA.

Через 1 сут после котрансфекции методом проточной цитометрии оценены количество GFP+жлеток, а также средняя интенсивность их флюоресценции. Как оказалось, два варианта siRNA из трех (siIL4-267 и siIL4-408) приводили к заметному снижению интен-

Рис. 1. Изменение интенсивности флюоресценции GFP+-клеток HEK293T после котрансфекции молекул siRNA и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP.

На оси ординат представлена средняя интенсивность флюоресценции клеток HEK293T (в %) относительно контроля (siP4). Интенсивность флюоресценции клеток при ко-трансфекции siP4 и pUCHR IL4 IRES GFP принято за 100%. Представлены средние результаты двух независимых экспериментов.

- 68 -

ЦИТОКИНЫ

Рис. 2. Изменение экспрессии il-4 в клетках HEK293T после ко-трансфекции молекул siRNA и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP.

На рисунке представлено количество копий мРНК-й-4 (в %) относительно контроля (siP4). Количество мРНК-il-4 при котрансфекции siP4 и pUCHR IL4 IRES GFP принято за 100%. Представлены средние результаты двух независимых экспериментов.

сивности флуоресценции GFP+-клеток в 4 и 5 раз (рис. 1). Наиболее эффективную блокаду il-4 обеспечивала siIL4-408, так как при ее введении в клетки детектировалось наибольшее снижение интенсивности флюоресценции клеток, а именно в 5 раз в сравнении с отрицательным контролем (siP4). Котрансфекция siGFP, как и ожидалось, обеспечивает еще более существенное снижение флюоресценции клеток до 10 раз.

Результаты, полученные в ходе количественного ПЦР-анализа и ИФА, показали сходную картину. В клетках, взятых через 1 сут после котрансфекции, наблюдается снижение количества копий мРНК-й-4. Наиболее эффективное снижение обеспечивают также siIL4-267 и siIL4-408 до 3 раз, что сопоставимо с действием контрольной siGFP (рис. 2). В клеточных супернатантах в этот же период времени происходит снижение концентрации секретированного клетками IL-4 до 10 раз (рис. 3).

О бсуждение

В данной работе нами проанализирована последовательность гена il-4 мыши и спроектированы 6 потенциально эффективных молекул siRNA, направленных против мРНК-й-4. Их эффективность оценена с использованием полученной ранее модели экспрессии IL-4 мыши in vitro [3] и определена их блокирующая способность различными методами. Благодаря тому что репонтерный ген gfp и ген-мишень il-4 транскрибируются в виде единого мРНК-транскрипта, разработанная модель экспрессии позволяет оценивать эффективность молекул siRNA как визуально с использованием флюоресцентного микроскопа, так и методом проточной цитометрии, оценивая интенсивность флюоресценции GFP+-клеток НЕК293Т, появляющихся после котрансфекции рекомбинантной плазмидой и соответствующей siRNA.

Помимо метода проточной цитометрии, блокирующая активность siRNA оценивалась нами на уровне мРНК с использованием метода количественной ПЦР, при этом фиксировалось изменение количества копий мРНК-й-4 в клетках, а также на уровне конечного белкового продукта - секретируемого IL-4, концентрация

Рис. 3. Изменение концентрации IL-4 (%) (ось ординат) мыши в супернатантах клеток HEK293T после котрансфекции молекул siRNA и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP.

которого оценивалась в клеточных супернатантах методом ИФА. Как и ожидалось, данные, полученные с использованием проточной цитометрии, были сходны с результатами, полученными другими методами (количественная ПЦР и ИФА).

Суммировав все результаты, мы установили, что 5 из 6 спроектированных молекул siRNA в той или иной степени приводят к подавлению экспрессии il-4 in vitro, при этом siIL4-280 практически не оказывает блокирующего эффекта. Две из шести протестированных siRNA (siIL4-267 и siIL4-406) эффективно подавляют экспрессию il-4 в экспериментах in vitro до 10 раз на уровне конечного белкового продукта, что сравнимо с действием siGFP, использованной в качестве положительного контроля. По всей видимости siIL4-267 и siIL4-406 направлены к тем участкам мРНК-мишени, которые являются пространственно более доступными для комплементарного взаимодействия с антисмысловой цепью siRNA, что в конечном итоге определяет их большую эффективность.

Таким образом, в ходе работы нами спроектированы варианты siRNA, которые эффективно подавляют экспрессию провоспалительного гена il-4 мыши. В дальнейшем выбранные варианты siRNA можно будет испытать в экспериментах in vivo на моделях различных аллергических состояний, например на мышиной модели БА или мышиной модели атопического дерматита, в патогенез которых вовлечен IL-4.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С. Цитокины. - СПб., 2008.

2. Мейл Д., Бростофф Дж., Рот Д. Б., Ройтт А. Иммунология: Пер. с англ. - М., 2007.

3. Шиловский И. П., Мазуров Д. В., Шершакова Н. Н., Хаитов М. Р. Разработка модели РНКи-опосредованной супрессии гена интерлейкина-4 in vitro // ФИПИС. - 2011. - Т. 15, № 6. - С. 3-11.

4. Ярилин А. А. Иммунология: учебник. - М., 2010.

5. Borish L., Nelson H., Coren J. et al. Efficacy of soluble IL-4 receptor for the treatment of adults with asthma // J. Allergy Clin. Immunol. - 2001. - Vol. 107. - P 963-970.

6. Brown D., Jarvis R., Pallotta V. et al. RNA interference in mammalian cell culture: design, execution, and analysis of the siRNA effect // Ambion TechNotes. - Vol. 9, N 1. - P. 3-5.

- 69 -

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012

7. Callard R. Immunoregulation by IL-4 in man // Br. J. Haematol. - 1991. - Vol. 78. - P. 293-299.

8. Doench J. G., Petersen C. P., SharpP. A. siRNAs can function as miRNAs // Genes Dev. - 2003. - Vol. 17. - P 438-442.

9. Elbashir S., Martinez J., Patkaniowska A. et al. Functional anatomy of siRNA for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate // EMBO J. - 2001. - Vol. 20. - P. 6877-6888.

10. Fire A., Xu S., Montgomery M. K. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. - 1998. - Vol. 391. - P. 806-810.

11. Foley S., Hamid Q. Inflammatory patterns in allergic rinitis // Clin. Exp. Allergy Rev. - 2006. - Vol. 11. - P. 91-99.

12. Mattes J., Yang M., Siqueira A. et al. IL-13 induces airways hyperreactivity independently of IL-4Ra chain in the allergic lung // J. Immunol. - 2001. - Vol. 167. - P. 1683-1692.

13. Meister G., Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by doublestranded RNA // Nature. - 2004. - Vol. 431. - P. 343-349.

14. Townsend J., Fallon G., Matthews J. et al. IL-9 deficient mice establish fundamental roles for IL-9 in pulmonary mastocytosis and goblet cell hyperplasia but not T-cell development // Immunity. - 2000. - Vol. 13. - P. 573-583.

15. Wills-Karp M.Immunologic basis of antigen-induced airway hyperresponsiveness // Annu. Rev. Immunol. - 1999. - Vol. 17. -P. 255-281.

Поступила 15.09.11

ИММУНООНКОЛОГИЯ

©КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012

УДК 615.277.3.03:616.5-006.81.04-031.13].015.44

X. А. Бигвава, Т. Н. Заботина, А. А. Борунова, Л. Ф. Морозова, З. Г. Кадагидзе, Е. Г. Славина

ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ И ИНДУКЦИЯ АПОПТОЗА В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМ ПРИ комбинировании фактора некроза опухоли а (АЛьНОРИН) с противоопухолевыми химиопрепаратами

Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина, (115478, г Москва, Каширское ш., д. 24)

Фактор некроза опухоли а (ФНОа) в течение многих лет привлекает внимание исследователей, что связано с его избирательной способностью тормозить рост и вызывать лизис злокачественных клеток, активировать иммунный противоопухолевый ответ, оказывать повреждающее действие на сосуды. Однако наличие многочисленных, часто тяжелых, побочных эффектов препятствует широкому применению препаратов ФНОа в онкологии. Поэтому ряд исследователей работают над созданием новых форм и способов применения рекомбинантного ФНОа с целью снижения выраженности побочных действий и усиления его положительных свойств с одновременным максимальным уменьшением используемых доз. В настоящей работе показана способность очень низких доз отечественного рекомбинантного препарата ФНОа усиливать цитотоксическое и апопто-индуцирующее действие противоопухолевых лекарств - дакарбазина (DTIC), BCNU, ACNU и аранозы в отношении клеток 8 культуральных линий меланомы человека in vitro.

Ключевые слова: меланома, апоптоз, факторы некроза опухоли, альнорин

Bigvava Kh.A., Zabotina T.N., Borunova A.A., Morozova L.F., Kadagidze Z.G., Slavina E.G.

CYTOTOXICITY AND THE INDUCTION OF APOPTOSIS IN MELANOMA CELL LINES BY THE COMBINATION OF TUMOUR NECROSIS FACTOR-ALPHA (ALNORIN) WITH THE CHEMICAL ANTICANCER AGENTS

Tumour necrosis factor-alpha (TNF-a) has had been in the focus of attention of researchers during many years by virtue of its ability to selectively inhibit and induce lysis of malignant cells, activate the immune anti-tumour response, and cause vascular lesions. Numerous (and frequently severe) side effects of TNF-a preparations hamper their wide application in oncological practice. Many research teams are engaged in the development of new dosage forms and routs of administration of recombinant TNF-a producing fewer and less severe adverse events and enhancement of its beneficial action at minimal possible doses. The present study has demonstrated that low doses of the recombinant TNF-a preparation manufactured in this country stimulate the cytotoxic and apoptose-inducing action of many anticancer agents, such as dacarbazine (DTIC), BCNU, ACNU, and aranose, on the cultured human melanoma cells of 8 different lines in vitro.

Key words: melanoma, apoptosis, tumor necrosis factor, alnorin

Применение и совершенствование цитокинотерапии - одно из перспективных направлений лечения диссеминированной меланомы кожи. Фактор некроза опухоли а (ФНОа) в течение многих лет привлекает внимание исследователей, что связано с его избира-

Кадагидзе Заира Григорьевна - д-р мед. наук, проф., тел. 8 (903) 149-29-74.

тельной способностью тормозить рост и вызывать лизис злокачественных клеток, активировать иммунный противоопухолевый ответ, оказывать повреждающее действие на сосуды. Однако наличие побочных эффектов препятствует широкому применению препаратов ФНОа в онкологии. Поэтому в настоящее время ученые работают над созданием новых форм и способов использования рекомбинантного ФНОа

- 70 -