CC BY
134
УДК 577.21
Регуляция репликации аденовирусов человека с помощью РНК-интерференции
Н. А. Никитенко1, T. Speiseder2, E. Lam2, П. М. Рубцов1, Х. Д. Тонаева3, С. А. Борзенок3, T. Dobner2, В. С. Прасолов1*
1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32, Россия
2Heinrich Pette Institute - Leibniz Institute for Experimental Virology, Martinistrasse 52 D-20251, Hamburg, Germany
3МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Минздрава РФ, 127486, Москва, Бескудниковский бул., 59а, Россия *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 23.06.2015
РЕФЕРАТ Аденовирусы являются причиной большого числа инфекционных заболеваний человека. Офтальмологические инфекции - аденовирусный конъюнктивит и эпидемический кератоконъюнкти-вит - вызывают, в основном, аденовирусы человека, относящиеся к группе D. Недостаточная эффективность современных методов лечения аденовирусной инфекции обусловливает необходимость поиска и разработки лекарственных средств, избирательно воздействующих на возбудителей данного заболевания. Потенциальными мишенями для создания терапевтических препаратов служат ранние гены аденовирусов человека, такие, как ген ДНК-полимеразы Е2В и ген Е1А, играющие важную роль в репликации вирусной ДНК. В настоящей работе предложен подход к эффективному подавлению репликации аденовирусов группы D человека с помощью РНК-интерференции. Созданы модельные линии клеток, которые позволяют быстро определять эффективность действия интерферирующих РНК, комплементарных различным участкам мРНК гена Е1А. Нами показано значительное подавление экспрессии Е1А с помощью интерференции РНК в таких клетках. Также показана высокая эффективность малых шпилечных РНК, специфичных в отношении ранних генов E1A и E2B аденовирусов группы D человека, при подавлении репликации аденовирусов типа D8 и D37 в первичных клетках лимба роговицы глаза человека. Мы надеемся, что результаты нашего исследования смогут послужить основой для разработки современных лекарственных средств для борьбы с заболеваниями человека, вызываемыми аденовирусами.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА РНК-интерференция, аденовирусы человека, малые интерферирующие РНК, лентиви-русные векторы, малые шпилечные РНК.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ siРНК - малая интерферирующая РНК; shРНК - малая шпилечная РНК; HAdV -аденовирус человека.
ВВЕДЕНИЕ
Проблема аденовирусных заболеваний глаз относится к числу наиболее актуальных в современной биомедицине в связи с широким распространением и высокой частотой вспышек аденовирусной инфекции. Аденовирусы вызывают инфекционные заболевания дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта человека. К аденовирусной офтальмологической инфекции относятся такие заболевания, как аденовирусный конъюнктивит - воспаление оболочки глаза, и эпидемический кератоконъюнктивит - сочетанное воспаление конъюнктивы и роговицы [1]. В России ежегодно эпидемический кератоконъюнктивит вы-
являют более чем у 300000 человек [2]. Наиболее тяжелые поражения глаз вызывают аденовирусы человека (HAdV), относящиеся к группе D (типы D8, D19, D36 и D37) [3]. HAdV-инфекциям подвержены все возрастные группы [4]. В России по поводу воспалительных заболеваний глаз к офтальмологу обращается примерно 18 млн человек в год, что составляет до 80% случаев временной нетрудоспособности по причине офтальмологических заболеваний и 10-30% случаев снижения остроты зрения и слепоты [5]. Эпидемический характер распространения, большие потери по временной нетрудоспособности, высокая вероятность развития осложнений - вре-
менной или стойкой утраты зрения, многообразие клинических проявлений определяют медико-социальную значимость аденовирусных заболеваний глаз. Аденовирусные инфекции представляют опасность для людей с заболеваниями иммунной системы [6]. Известно, что к развитию ожирения у детей, а также неалкогольной жировой болезни печени у взрослых приводит заражение аденовирусом типа 36 группы D человека (HAdV D36) [7].
Недостаточная эффективность современных методов лечения аденовирусной инфекции [8] обусловливает необходимость поиска и разработки лекарственных средств, избирательно воздействующих на возбудителей данного заболевания.
Потенциальными мишенями для терапевтических препаратов могут быть ранние гены аденовирусов человека, такие, как ген ДНК-полимеразы Е2В и ген Е1А, участвующие в репликации вирусной ДНК
[9-11].
Продукты гена Е1А стимулируют переход клеток из фазы G0 в фазу S клеточного цикла. Взаимодействие продуктов гена Е1А с белком ре-тинобластомы (pRb) приводит к активации фактора транскрипции Е2F1, запускающего экспрессию генов, необходимых для прохождения S-фазы клеточного цикла. Это позволяет аденовирусу эффективно использовать аппарат репликации ДНК инфицированной клетки для репликации собственного генома. Одна из функций фактора транскрипции Е2F1 - трансактивация белка р14/ARF, сопровождаемая индукцией р53-зависимого апоптоза. В ходе вирусной инфекции белок Е1В 55 кДа инактивирует р53, не давая ему запустить апоптоз в клетке до завершения цикла репликации аденовируса [12, 13].
Использование малых интерферирующих РНК ^РНК) - коротких дуплексов длиной 21-23 п.н. с выступающими 2-3 нуклеотидами на З'-концах, способных подавлять экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, позволяет изучать функциональную активность генов [14, 15]. Показана возможность использования интерферирующих РНК для подавления экспрессии различных генов-мишеней, в том числе вирусных генов [16-18]. Для доставки интерферирующих РНК в клетки используются рекомбинантные лентивирусные векторы, кодирующие малые шпилечные РНК (shРНК) - предшественники малых интерферирующих РНК [19-21].
Мы считаем, что этот подход можно применить для подавления экспрессии ранних генов Е1А и Е2В [10, 11] HAdV, которые вызывают поражения глаз и дыхательных путей.
В представленной работе приведены результаты ингибирования экспрессии гена Е1А аденовирусов типов D8, D19, D36 и D37 группы D человека при по-
мощи siPHK и shPHK, а также репликации HAdV D8 и D37 при сочетанном подавлении экспрессии E1A и E2B с использованием shPHK.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культуры клеток
В работе использовали перевиваемые клетки эмбриона почки человека HEK293 [22], перевиваемые клетки аденокарциномы легкого человека А549 (DSMZ ACC107; Brauschweig, Germany), перевиваемые клетки немелкоклеточного рака легкого человека Н1299 [23], а также первичные клетки лимба человека (Limb) [24, 25]. Клетки линий НЕК293, А549 и Н1299, а также клетки модельных линий А549 Е1А и Н1299 Е1А выращивали на среде DMEM (Life Technologies, Великобритания), содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Life Technologies), 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед./мл соответственно при температуре 37оС в атмосфере 5% СО2. Первичные клетки лимба человека культивировали на среде DMEM/F12 (Life Technologies), содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Life Technologies),
4 hM L-глутамина, 1 hM пирувата натрия, 10 мМ HEPES, 0.4 мкМ инсулина, 10 нМ дексаметазо-на, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед./мл соответственно при температуре 37оС в атмосфере 5% СО2.
Лентивирусные векторы
Рекомбинантные лентивирусные векторы были сконструированы с помощью стандартных методов генной инженерии [26, 27]. Для получения лентиви-русных вирионов ДНК рекомбинантных векторов котрансфицировали в клетки линии HEK293 методом Са-фосфатной трансфекции совместно с плазми-дами, направляющими синтез всех лентивирусных белков, необходимых для создания инфекционных лентивирусных частиц. Сбор инфекционных псевдо-лентивирусных частиц проводили в течение 2 дней с интервалом 12 ч. Титрование проводили на клетках линий А549 и Н1299. Вирусные стоки с титрами
5 х 105-5 х 106 использовали для проведения дальнейших исследований.
Модельные линии клеток
Модельные клетки, в которых экспрессируется ген Е1А аденовируса типа 36 человека (E1A-D36), получены с помощью трансдукции клеток линий А549 и Н1299 псевдолентивирусными частицами Е1А-LeGO-iGT на основе LeGO-iGT-Puro-opt, несущими экспрессирующую кассету «промотор - ген Е1А аде-
новируса типа 36 человека - IRES - маркерный ген dTomato - ген устойчивости к пуромицину.
Для получения клеток модельной линии Н1299 shElA клетки исходной линии Н1299 трансдуци-ровали лентивирусными частицами, содержащими последовательность, кодирующую shElA, маркерный ген Cerulean и ген устойчивости к антибиотику бластицидину (BSD). Через 48 ч после трансдукции клетки помещали в селективную среду с антибиотиком бластицидином (5 мкг/мл). Селекцию продолжали в течение 10 дней. Затем клетки Н1299 shElA анализировали на проточном цитофлуориметре.
Модельные линии Limb shE2B, Limb shElA и Limb shE2B/shE1A получали, трансдуцируя первичные клетки лимба человека псевдолентивирусными частицами, кодирующими shE2B [10, 11] или shElA.
siPHK
Для подавления экспрессии гена Е1А HAdV 8, 19, 36 и 37 в компании «СИНТОЛ» (Россия) были синтезированы siPHK, направленные против разных районов мРНК целевого гена. Были синтезированы siPHK длиной 21 п.н.: siE1A-1 (смысловая цепь 5'-GGAGGACUUUGUGAAUACAUU-3', антисмысловая цепь 5'-UGUAUUCACAAAGUCCUCCUU-3'); siE1A-2 (смысловая цепь 5'-GAG-GCUGUGAAUUUAAUAUUU-3', антисмысловая цепь 5'-AUAUUAAAUUCACAGCCUCUU-3') и siE1A-3 (смысловая цепь 5'-GCUCU-GUGUUACAUGAAAUUU-3', антисмысловая цепь 5'-AUUUCAUGUAACACAGAGCUU-3'). Эти siPHK гомологичны последовательностям гена Е1А HAdV типов D8, D19, D36 и D37. В качестве контроля использовали siScr, не имеющие гомологии с известными вирусными мРНК, а также мРНК человека, мыши и крысы (смысловая цепь 5'-CAAGUCUCGUAUGUAGUGGUU-3', антисмысловая цепь 5'-CCACUACAUACGAGACUUGUU-3'). siPHK конструировали с помощью программы Whitehead Institute siRNA Selection Program [28].
Трансфекция siPHK
Клетки в фазе экспоненциального роста высевали на 24-луночные планшеты по 3 х 104 клеток/лунку за 1 сутки до эксперимента и трансфицировали siPHK в концентрации 200 нМ с помощью Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent (Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя.
shPHK
Ыами были сконструированы лентивирусные векторы shE1A-LeGO-Cer/BSD и shScr-LeGO-Cer/BSD, кодирующие shPHK: shElA, которая соответствует
siE1A-1 (смысловая цепь 5'-p-aacgATATTAAATT-CACAGCCTCcttcctgcaaGAGGCTGTGAATTTA-ATATtttttc-3', антисмысловая цепь 5'-p-tcgagaaa-aaATATTAAATTCACAGCCTCttgcaggaagGAGG-CTGTGAATTTAATATcgtt-3'), и контрольную shScr (смысловая цепь 5'-p-gatccgCCACTACATACGA-GACTTcttcctgtcaCAAGTCTCGTATGTAGTGGtt-tttg-3', антисмысловая цепь 5'-p-aattcaaaaaCCA-CTACATACGAGACTTGtgacaggaagCAAGTCTCG-TATGTAGTGGcg-3'). В настоящей работе мы использовали также лентивирусные векторы shE2B-LeGO-G, кодирующие shPHK, направленную против мPHK гена ДHK-полимеразы Е2В HAdV D8, D19, D36 и D37, и shScr-LeGO-G, описанные ранее [10, 11].
Проточная цитофлуориметрия
Уровень флуоресценции клеток измеряли на проточном цитофлуориметре Epics 4XL (Beckman Coulter, США). Сбор и учет данных производили с помощью программного обеспечения WinMDI, версия 2.8.
ПЦР в реальном времени
Суммарную PHK из клеточных культур выделяли с помощью TRIzol® reagent (Life Technologies) согласно протоколу производителя. Полученную мPHK использовали для построения первых цепей ^HK c помощью набора ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega, США). Для идентификации в полученной суммарной кДHK нуклео-тидных последовательностей E1A-D36 проводили ПЦP в реальном времени с праймерами, специфичными к данному гену: смысловая последовательность 5'-GCATCCAGAGCCATTTGAGC-3'; антисмысловая последовательность 5'-TTA-GGGTCGTCATCATGGGC-3'. Значения, полученные для каждого образца, нормировали на экспрессию гена «домашнего хозяйства» ß-актина. Уровень экспрессии гена ß-актина определяли с использованием праймеров: смыслового -5'-ATGGATGATGATATCGCCGC-3' и антисмыслового - 5'-CTTCTGACCCATGCCCAC-3'. П^ в реальном времени проводили в 96-луночных планшетах на приборе MiniOpticon (Bio-Rad, США) с использованием реагента iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя. Продукты ПЦP анализировали с помощью программного обеспечения прибора MiniOpticon (Bio-Rad).
Определение количества копий генома аденовируса человека
HAdV D8 (ATCC® VR-1085AS/RB™ATCC® VR-1085AS/RB™) и HAdV D37 (ATCC® VR-929™) были приобретены в American-Type-Culture-Collection
(ATCC). Для оценки репликации аденовирусов группы D человека через 6 дней после инфекции клетки, зараженные HAdV D8 и D37, собирали, выделяли суммарную ДНК с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Германия) согласно рекомендациям производителя. Количественную ПЦР проводили согласно [29] на приборе Rotor Gene Q cycler (QIAGEN) с использованием реагента TaqMan® Universal PCR Master Mix (Life Technologies). Продукты ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения прибора Rotor Gene Q cycler (QIAGEN).
Статистическая обработка данных
Все данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение (СО). Статистическую значимость определяли с использованием непарного двустороннего t-теста и программного обеспечения GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, США). Значение p < 0.05 считали статистически значимым.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение линий модельных клеток, экспрессирующих ген Е1А HAdV D36
Для определения функциональной активности синтетических siPHK и лентивирусных векторов, направляющих в трансдуцированных клетках синтез shPHK, необходимо было получить модельные линии клеток А549 Е1А и Н1299 Е1А, в которых экс-прессируется ген Е1А аденовируса типа 36 человека (E1A-D36).
Известно, что экспрессия Е1А в клетках вызывает индукцию р53-зависимого апоптоза [30]. Продукты экспрессии Е1А способствуют переходу покоящейся клетки в S-фазу и нарушению механизмов, контролирующих синтез ДНК. Это увеличивает вероятность возникновения повреждений ДНК в процессе репликации. В ответ на сильное повреждение ДНК белок р53 запускает каскад реакций, приводящих к апоптозу. Поэтому сначала клетки А549 и Н1299 трансфициро-вали siPHK, комплементарными различным участкам мРНК гена Е1А, а также контрольной siScr. Через 24 ч проводили трансдукцию этих клеток псевдолентиви-русными частицами (рис. 1А), содержащими экспрес-сирующую кассету «промотор - целевой ген E1A-D36 - IRES - ген флуоресцентного белка dTomato - ген устойчивости к пуромицину». Маркерный ген, кодирующий флуоресцентный белок dTomato, и целевой ген Е1А разделены последовательностью IRES (внутренний сайт посадки рибосомы). IRES позволяет синтезировать несколько белков с одной мРНК в эукариотических клетках. Таким образом, целевой и маркерный гены экспрессируются с сопоставимой
эффективностью [31]. Это позволяет косвенно оценить уровень экспрессии гена Е1А, измеряя флуоресценцию белка dTomato с помощью метода проточной ци-тофлуориметрии.
Эффективность экспрессии внесенных генов оценивали методами проточной цитофлуориметрии (по флуоресценции маркерного белка Tomato), а также ПЦР в реальном времени. Результаты оценки эффективности трансдукции и последующей экспрессии трансгенов с помощью проточной цитофлуори-метрии приведены на рис. 1Б,В.
Количество клеток модельных линий А549 Е1А и Н1299 Е1А, в которых регистрировали флуоресценцию белка dTomato, составляло 44 и 85% всей популяции клеток соответственно по сравнению с контролем - нетрансдуцированными клетками линий А549 и Н1299.
Приведенные результаты свидетельствуют о том, что в полученных модельных трансгенных клетках А549 Е1А и Н1299 Е1А с высокой эффективностью экспрессируются внесенный целевой ген и маркерный ген dTomato в составе кассеты «промотор - ген E1A-D36 - IRES - маркерный ген dTomato - ген устойчивости к пуромицину».
Согласно полученным данным, в модельных линиях А549 Е1А и Н1299 Е1А количество флуоресцирующих клеток значительно различается. Причины гетерогенности линий клеток А549 Е1А и Н1299 Е1А по уровню экспрессии dTomato могут быть связаны с индивидуальными свойствами клеток. В геном трансгенных клеток интегрируется разное количество молекул лентивирусного провируса. Вирусная ДНК встраивается в разные участки генома, что может обеспечивать различную эффективность экспрессии трансгенов. Несмотря на сходство морфологии и происхождения клеток А549 и Н1299, одной из причин могут быть различия этих двух линий. Как известно, экспрессия гена Е1А приводит к р53-зависимому апоптозу. Клетки линии Н1299 дефицитны по белку р53. Следовательно, вероятность развития апоптоза в клетках Н1299 Е1А гораздо ниже, чем в клетках А549 Е1А. Можно предположить, что клетки линии А549 трансдуцируют-ся с той же эффективностью, что и клетки Н1299, но в большинстве трансдуцированных клеток А549 Е1А происходит р53-зависимый апоптоз, что позволяет регистрировать флуоресценцию dTomato в меньшем количестве клеток А549 Е1А, чем в клетках модельной линии Н1299 Е1А.
Подавление экспрессии гена Е1А^36 под действием siРНК
Структура экспрессирующей кассеты «промотор -ген E1A-D36 - IRES - маркерный ген dTomato - ген устойчивости к пуромицину» позволяет быстро
оценить ингибирующую активность siPHK и лен-тивирусных векторов, направляющих синтез shPHK - предшественников соответствующих siPHK. Деградация общей для обоих генов мРНК под действием интерферирующих РНК, комплементарных мРНК E1A-D36, приводит к прекращению образования в клетке как продуктов этого гена, так и флуоресцентного белка dTomato, что количественно можно оценить методом проточной цитофлуориметрии.
Поскольку экспрессия гена Е1А приводит к индукции апоптоза, эксперимент выполняли следующим образом: siPHK, комплементарные различным районам мРНК E1A-D36, трансфицировали в клетки линий А549 и Н1299; через 24 ч проводили трансдук-цию этих клеток псевдолентивирусными частицами, содержащими экспрессирующую кассету «промотор SFFV - ген E1A-D36 - IRES - ген флуоресцентного белка dTomato - ген устойчивости к пуромицину». Через 48 и 96 ч после трансдукции эффективность действия siPHK оценивали методами проточной ци-тофлуориметрии и ПЦР в реальном времени.
В результате действия siPHK, комплементарных мРНК E1A-D36, значительно снижался уровень экспрессии dTomato (рис. 2). В популяции клеток А549 Е1А, трансфицированных siE1A-1, siE1A-2 и siE1A-3, средняя интенсивность флуоресценции (MFI) dTomato через 48 ч снизилась на 25, 49 и 53% соответственно по сравнению с контролем, а через 96 ч - на 55, 61 и 58%. В качестве контроля использо-
вали клетки линии А549 Е1А, трансфицированные siScr. Определение биологической активности siРНК показало, что уже через 48 ч MFI репортерного белка dTomato в популяции модельных клеток Н1299 Е1А сократилась на 18, 60 и 17% под действием siE1A-1, siE1A-2 и siE1A-3 соответственно по сравнению с контролем, а через 96 ч - на 18, 44 и 56%. Контролем служили клетки линии Н1299 Е1А, трансфицированные siScr. Все представленные результаты получены в ходе трех независимых экспериментов ^ < 0.05).
Результаты, полученные методом проточной ци-тофлуориметрии, хорошо согласуются с данными ПЦР в реальном времени. Влияние siРНК на уровень экспрессии мРНК Е1А-D36 в клетках модельных линий оценивали через 48 и 96 ч после трансдукции псевдолентивирусными частицами, кодирующими целевой ген (рис. 3). В клетках линии А549 Е1А через 48 ч после трансдукции под действием siE1A-1, siE1A-2 и siE1A-3 регистрировали снижение уровня экспрессии мРНК Е1А-D36 на 58, 83 и 63% соответственно по сравнению с контролем, а через 96 ч -на 69, 88 и 72%. В клетках модельной линии Н1299 Е1А через 48 ч после трансдукции уровень мРНК Е1А-D36 уменьшался на 28, 71 и 46% при использовании siE1A-1, siE1A-2 и siE1A-3 соответственно по сравнению с контролем, а через 96 ч - на 50, 69 и 47%.
Снижение средней интенсивности флуоресценции маркерного белка dTomato происходит медленнее
Рис. 1. Модельные линии клеток. А - схема лентивирусного вектора, несущего целевой ген E1A-D36 и ген маркерного флуоресцентного белка dTomato, разделенные последовательностью IRES. Вектор сконструирован на основе вектора LeGO-iGT-Puro-opt. SIN-LTR - самоинактивирующийся (содержащий делецию промоторной области) длинный концевой повтор; ^ - сигнал упаковки; RRE - элемент, реагирующий на rev; cPPT - последовательность, богатая пуринами; SFFV - промотор вируса некроза селезенки; E1A-D36 — ген Е1А HAdV D36; IRES - внутренний сайт посадки рибосомы; dTomato - ген флуоресцентного белка dTomato; 2A - 2А-пептид тешовируса свиней; wPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков. Б - оценка эффективности экспрессии маркерного гена dTomato в клетках модельной линии А549 Е1А методом проточной цитофлуориметрии. В - анализ экспрессии маркерного гена dTomato в клетках модельной линии Н1299 Е1А с помощью проточной цитофлуориметрии
П siScr О siE1A-2 □ siE1A-1 □ siE1A-3
AS49 E1А 48 ч А549 Е1А 96 ч
Рис. 2. Ингибирующая активность siРНК, комплементарных мРНК гена E1А-D36. Действие siРНК, направленных против E1А-D36, привело к значительному снижению средней интенсивности флуоресценции ^1) dTomato в клетках А549 Е1А и Н1299 Е1А. Величина MFI dTomato в контрольных образцах принята за 1. Все приведенные данные получены в ходе трех независимых экспериментов. Различия между опытными и контрольными образцами статистически значимы во всех случаях (*р < 0.05, **р < 0.01, ***р < 0.001)
Рис. 3. Эффективность подавления экспрессии гена E1А-D36 с помощью siРНК. Уровень экспрессии целевого гена Е1А в клетках модельных линий А549 Е1А и Н1299 Е1А оценивали методом ПЦР в реальном времени. Величина уровня экспрессии мРНК E1А-D36 в контрольных образцах принята за 1. Все представленные данные получены в ходе трех независимых экспериментов. Различия между опытными и контрольными образцами статистически значимы во всех случаях (*р < 0.05, **р < 0.01, ***р < 0.001)
и менее эффективно, чем подавление экспрессии целевого гена на уровне мРНК. Эти данные можно объяснить тем, что флуоресцентный белок достаточно стабилен, и время его полужизни составляет около 72 ч.
Согласно данным проточной цитофлуориметрии и ПЦР в реальном времени, наиболее эффективно на экспрессию гена Е1А-D36 действует siЕ1А-2. Ингибирующая активность siРНК определяется группой факторов. К ним относятся вторичная структура мРНК-мишени, уникальность последовательности siРНК, стабильность и термодинамическая асимметрия дуплексов siРНК. Известно, что вторичная структура мРНК-мишени или связанные с ней белки могут затруднять доступ siРНК [15, 32].
Подавление экспрессии гена Е1А^36 с помощью лентивирусного вектора, кодирующего shРНК
Нами сконструированы лентивирусные векторы, кодирующие shРНК, соответствующие siE1A-2 (с самым высоким уровнем подавления экспрессии E1A-D36) и контрольной siScr. Лентивирусные векторы могут обеспечить интеграцию последовательности, кодирующей shРНК, в геном клетки, в результате чего будет достигнуто долговременное подавление экспрессии гена-мишени. Основой для таких генетических конструкций послужил лентивирусный вектор LeGO-Cerulean/BSD (рис. 4А), несущий
ген маркерного белка Cerulean и ген устойчивости к антибиотику бластицидину. В качестве контроля, иллюстрирующего отсутствие неспецифического действия shPHK, использовали вектор shScr-LeGO-Cerulean/BSD, несущий шпилечную структуру, не имеющую гомологии с известными вирусными мРНК, а также мРНК крысы, мыши и человека.
Такие лентивирусные векторы были введены в геном клеток Н1299 с помощью трансдукции. Через 10 дней селекции клеток Н1299 shElA и Н1299 shScr на бластицидине эффективность трансдукции оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии по флуоресценции репортерного белка Cerulean. Количество флуоресцирующих клеток составило 92-98% от общего числа клеток в популяции по сравнению с контролем (нетрансдуцированные клетки линии Н1299).
Затем клетки модельной линии Н1299 shElA трансдуцировали псевдолентивирусными частицами ElA-LeGO-iGT. Биологическую активность shElA оценивали через 3, 6 и 10 дней после трансдукции с помощью ПЦР в реальном времени в ходе трех независимых экспериментов (p < 0.05). Уровень экспрессии целевого гена Е1А под действием shElA снизился на 57, 77 и 80% через 3, 6 и l0 дней соответственно по сравнению с контролем (рис. 4В).
Нами показано, что лентивирусные векторы, кодирующие shPHK, существенно подавляют экспрес-
о*
*
•у
SIN-LTR - RRE ■ сРРТ — Ü6 -shEIA ■■ SFFV Cerulean • BSD --wPRE-SIN-LTR
о*
o*
s/
SIN-LTR^ "ф • RRE ■ cPPT - U6 j>hE2B ■■ SFFV eGFP -wPRE-SIN-LTR
В
.0 cn
£9
m <■
О »i
¥ ' s i
.0 с
Ф
H X
и
0
1
1.5!
1.0
a shScr □ shEIA
■b
JI И I г
3 дня 6 дней
1.5-1
□ shScr-LeGO-G □ shScr-LeGO-Cer □ shScr-Cer/-G D shE28-LeGO-G ■ SbEIA-LeGOCer d shE2B/shE1A
10 дней
HAdV D8
HAdV D37
Рис. 4. Ингибирующая активность shPHK, направленных против мРНК ранних генов аденовирусов группы D человека. А - схема лентивирусного вектора LeGO-Cerulean/BSD, несущего шпилечную структуру shEIA, специфичную в отношении гена Е1А HAdV D8, D19, D36 и D37. Б - схема лентивирусного вектора LeGO-G, несущего шпилечную структуру shE2B, специфичную в отношении гена Е2В HAdV D8, D19, D36 и D37. SIN-LTR - са-моинактивирующийся (содержащий делецию промоторной области) длинный концевой повтор; ^ - сигнал упаковки; RRE - элемент, реагирующий на rev; cPPT - последовательность, богатая пуринами; U6 - промотор U6; SFFV - промотор вируса некроза селезенки; E1A-D36 — ген Е1А HAdV D36; IRES - внутренний сайт посадки рибосомы; Cerulean - ген флуоресцентного белка Cerulean; eGFP - ген флуоресцентного белка eGFP; BSD — ген устойчивости к антибиотику бластицидину; wPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков. В - уровень экспрессии гена E1A-D36 в клетках Н1299, экспрессирующих shEIA, через 3, 6 и 10 дней после внесения трансгена E1A-D36. Величина уровня экспрессии мРНК E1A-D36 в контрольных образцах принята за 1. Все представленные данные получены в ходе трех независимых экспериментов. Различия между опытными и контрольными образцами статистически значимы во всех случаях (**p < 0.01). Г - подавление репликации HAdV D8 и D37 в первичных клетках лимба человека с помощью shPHK. Количество копий генома аденовируса оценено методом количественной ПЦР. Количество копий генома аденовируса в контрольных образцах принято за 1. Все представленные данные получены в ходе трех независимых экспериментов. Различия между опытными и контрольными образцами статистически значимы во всех случаях (*p < 0.05, ****p < 0.0001)
сию целевого гена Е1А-D36. Необходимо добавить, что в модельных клетках в течение 10 дней сохраняется стабильное блокирование экспрессии Е1А-D36, опосредованное экспрессирующими shPHK лентиви-русными частицами. Это свидетельствует о высокой эффективности сконструированных нами лентиви-русных векторов.
Подавление репликации аденовирусов группы D человека с помощью shPHK в первичных клетках лимба роговицы глаза человека
Мы оценили способность shPHK, направленных против мРНК ранних генов Е1А и Е2В HAdV, подавлять
репликацию вирусов. Первичные клетки лимба человека (Limb) трансдуцировали лентивирусными векторами shE2B-LeGO-G (рис. 4Б) и shElA-LeGO-Cerulean/BSD, кодирующими shE2B и shElA соответственно. В качестве контроля использовали клетки Limb, трансдуцированные псевдолентивирусными частицами, несущими shScr, последовательность которой не имеет гомологии с известными вирусными мPHK и мPHK мыши, крысы и человека.
Kлетки полученных линий заражали HAdV D8 и HAdV D37, вызывающими эпидемический кера-токонъюнктивит, с множественностью инфекции 20 ФОЕ/клетку. Kлетки культивировали в течение
6 дней после заражения: этого времени достаточно для завершения полного цикла репликации аденовируса человека. Через 6 дней после инфекции эффективность действия shPHK оценивали методом количественной ПЦР по количеству копий генома HAdV D8 и HAdV D37. Мы наблюдали значительное подавление репликации аденовирусов человека в первичных клетках Limb. Количество копий генома HAdV D8 и HAdV D37 снижалось на 59 и 58% под действием shE2B, на 37 и 30% под действием shElA, а также на 73 и 60% под действием одновременно shE2B и shElA соответственно по сравнению с контролем (рис. 4Г).
Мы предполагаем, что в результате подавления экспрессии ранних генов аденовируса группы D человека цикл репликации аденовируса останавливается на ранней стадии. Это объясняет существенное снижение количества копий генома аденовирусов. Тем не менее нам не удалось добиться полного подавления вирусной репликации. Это можно связать с высоким значением множественности инфекции (20 ФОЕ/клетку), временем анализа образцов - 6 дней после инфекции, тогда как максимальный эффект подавления экспрессии целевых генов с помощью shPHK наблюдается на 9-10 день (рис. 4В) [10, 11], а также невысокой эффективностью трансдукции первичных клеток лимба человека (50-70% флуоресцирующих клеток в популяции по данным флуоресцентной микроскопии).
В ходе эксперимента мы использовали первичные клетки лимба человека, входящие в состав роговицы глаза человека, которая поражается при эпидемическом кератоконъюнктивите. Также мы использовали HAdV D8 и D37, основных возбудителей данного заболевания. Таким образом, нам удалось разработать модельную систему аденовирусной офтальмологиче-
ской инфекции in vitro, и с высокой эффективностью применить shPHK, направленные против ранних генов аденовирусов группы D человека, в качестве предполагаемых терапевтических агентов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нами разработан подход к эффективному подавлению репликации аденовирусов группы D человека с помощью РНК-интерференции. С целью оценки ин-гибирующей активности siPHK, специфичных в отношении гена E1A HAdV D8, Dl9, D36 и D37, а также лентивирусных векторов, направляющих в клетках синтез аналогичной shPHK, мы получили модельные линии клеток, геном которых содержит экспресси-рующую кассету «промотор - ген Е1А-D36 - IRES -маркерный ген dTomato - ген устойчивости к пуро-мицину». Такие модельные линии клеток позволяют быстро определять эффективность действия интерферирующих РНК, комплементарных различным участкам мРНК целевого гена.
Показана высокая эффективность таких векторов при подавлении репликации аденовирусов типов 8 и 37 группы D человека в первичных клетках лимба человека. Сочетанное действие shElA и shE2B приводило к снижению числа копий генома аденовирусов в среднем на 70%.
Мы надеемся, что результаты нашего исследования будут полезны для разработки и создания современных лекарственных средств, высокоэффективных при заболеваниях человека, вызываемых аденовирусами. •
Работа поддержана РФФИ
(грант № 14-04-00821 А), а также программой Президиума РАН «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gonzalez-Lopez J.J., Morcillo-Laiz R., Munoz-Negrete F.J. // Arch. Soc. Esp. Oftalmol. 20l3. V. 88. № 3. P. l08-ll5.
2. Alexeev V.N., Martynova E.B., Zhukova E.A. // Clin. Ophtalmol. Russian Med. J. 2005. V. 4. P. l46-l49.
3. Meyer-Rusenberg B., Loderstadt U., Richard G., Kaulfers P.M., Gesser C. // Dtsch Arztebl. Int. 20ll. V. l08. № 27. P. 475-480.
4. Langley J.M. // Pediatrics in Rev. 2005. V. 26. № 7. P. 244-249.
5. Maychuk Y.F. // Russian Ophthalmol. J. 2008. V. 3. P. l8-25.
6. Myers G.D., Krance R.A., Weiss H., Kuehnle I., Demmler G., Heslop H.E., Bollard C.M. // Bone Marrow Transplant. 2005. V. 36. № ll. P. l00l-l008.
7. Trovato G.M., Martines G.F., Pirri C., Trovato F.M., Castro A., Garozzo A., Catalano D. // J. Clin. Gastroenterol. 20l2. V. 46. № 6. P. e46-54.
8. Skevaki C., Galani I., Pararas M., Giannopoulou K., Tsakris A. // Drugs. 20ll. V. 7l. № 3. P. 33l-347.
9. Kneidinger D., Ibrisimovic M., Lion T., Klein R. // Antiviral Res. 2012. V. 94. № 3. P. 195-207.
10. Nikitenko N.A., Speiseder T., Groitl P., Spirin P.V., Prokofjeva M.M., Lebedev T.D., Rubtsov P.M., Lam E., Riecken K., Fehse B., et al. // Biochimie. 2015. V. 113. P. 10-16. doi:10.1016/j. biochi.2015.03.010
11. Nikitenko N.A., Speiseder T., Groitl P., Spirin P.V., Prokofjeva M.M., Lebedev T.D., Rubtsov P.M., Lam E., Riecken K., Fehse B., et al. // Biochimie. 2015. doi:10.1016/j.biochi.2015.05.008
12. Isobe T., Hattori T., Kitagawa K., Uchida C., Kotake Y., Kosugi I., Oda T., Kitagawa M. // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. № 41. P. 27766-27779.
13. Yousef A.F., Fonseca G.J., Pelka P., Ablack J.N., Walsh C., Dick F.A., Bazett-Jones D.P., Shaw G.S., Mymryk J.S. // Oncogene. 2010. V. 29. № 33. P. 4693-4704.
14. Bantounas I., Phylactou L.A., Uney J.B. // J. Mol. Endocrinol. 2004. V. 33. № 3. P. 545-557.
15. Vilgelm A.E., Chumakov S.P., Prassolov V.S. // Mol. Biol. 2006. V. 40. № 3. P. 339-354.
16. Spirin P.V., Baskaran D., Orlova N.N., Rulina A.V., Nikitenko N.A., Rubtsov P.M., Chumakov P.M., Prassolov V.S., Chernolovskaya E.L., Zenkova M.A., et al. // Mol. Biol. 2010. V. 44. № 5. P. 776-786.
17. Spirin P.V., Nikitenko N.A., Lebedev T.D., Rubtsov P.M., Prassolov V.S., Stocking C. // Mol. Biol. 2011. V. 45. № 6. P. 950-958.
18. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T. // Nature. 2001. V. 411. № 6836. P. 494-498.
19. Lebedev T.D., Spirin P.V., Prassolov V.S. // Acta Naturae. 2013. V. 5. № 2. P. 7-18.
20. Singer O.,Verma I.M. // Curr. Gene Ther. 2008. V. 8. № 6. P. 483-488.
21. Manjunath N., Wu H., Subramanya S., Shankar P. // Adv. Drug Deliv Rev. 2009. V. 61. № 9. P. 732-745.
22. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C., Nairn R. // J. Gen. Virol. 1977. V. 36. № 1. P. 59-74.
23. Mitsudomi T., Steinberg S.M., Nau M.M., Carbone D., D'Amico D., Bodner S., Oie H.K., Linnoila R.I., Mulshine J.L., Minna J.D., et al. // Oncogene. 1992. V. 7. № 1. P. 171-180.
24. Borzenok S.A., Onishchenko N.A., Tonaeva K.D., Komakh Y.A., Kovshun Y.V., Strusova N.A. // Russian J. Transplantol. Artificial Organs. 2014. V. 16. № 1. P. 12-20.
25. Borzenok S.A., Onischenko N.A., Tonaeva K.D., Komakh Y.A., Suskova V.S., Suskov S.I., Didenko L.V., Shevlyagina N.V., Kost E.A. // Russian J. Transplantol. Artificial Organs. 2012. V. 14. № 2. P. 78-85.
26. Weber K., Bartsch U., Stocking C., Fehse B. // Mol. Ther. 2008. V. 16. № 4. P. 698-706.
27. Weber K., Mock U., Petrowitz B., Bartsch U., Fehse B. // Gene Ther. 2010. V. 17. № 4. P. 511-520.
28. Yuan B., Latek R., Hossbach M., Tuschl T., Lewitter F. // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. Web Server issue. P. W130-134.
29. Heim A., Ebnet C., Harste G., Pring-Akerblom P. // J. Med. Virol. 2003. V. 70. № 2. P. 228-239.
30. Debbas M., White E. // Genes Dev. 1993. V. 7. № 4. P. 546-554.
31. Zhou Y., Aran J., Gottesman M.M., Pastan I. // Hum. Gene Ther. 1998. V. 9. № 3. P. 287-293.
32. Nikitenko N.A., Prassolov V.S. // Acta Naturae. 2013. V. 5. № 3. P. 35-53.
