CC BY
107
■ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕЖДИСЦИПЛИНАРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ siPHK В ТЕРАПИИ КАРДИОВАСКУЛЯРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ
Скоблов Михаил Юрьевич -кандидат биологических наук, доцент кафедры молекулярной и клеточной генетики МБФ ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, ведущий научный сотрудник и руководитель группы функциональной геномики лаборатории генетической эпидемиологии ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» (Москва)
E-mail: [email protected]
Статья подготовлена по докладу, представленному на 4-м Российско-швейцарском научном форуме (сентябрь 2014 г., Москва, Россия)
Ключевые слова:
ген-направленная терапия, РНК-интерференция, малые интерферирующие РНК (siTHK), терапия сердечно-сосудистых заболеваний
А.Ю. Филатова1, М.Ю. Скоблов1
1 ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», Москва
2 ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова»
Минздрава России, Москва
РНК-интерференция - широко-распространенный и эффективный способ целевого подавления экспрессии генов с использованием малых некодирующих РНК. Применение данного механизма для ген-направленной терапии является перспективным инструментом по лечению различного рода заболеваний. И хотя на сегодняшний день в клинической практике не существует препаратов, действие которых основано на механизме РНК-интерференции, в литературе описано большое количество исследований, доказывающих эффективность данного вида терапии in vivo на модельных животных. Существует 3 основных стратегии ген-направленной терапии, основанной на РНК-интерференции: внедрение в клетку экзогенной siPHK для подавления экспрессии целевых генов, увеличение экспрессии существующей в клетке полезной микроРНК и применение блокаторов микроРНК с целью подавления экспрессии эндогенных патогенных микроРНК. В настоящее время основной проблемой внедрения технологии РНК-интерференции в клинику является вопрос доставки малых молекул РНК в целевые клетки. Данный обзор посвящен описанию механизма действия и использования ген-направленной терапии, основанной на механизме РНК-интерференции, для лечения различных сердечно-сосудистых заболеваний.
Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. - 2014. - № 4. - С. 12-19.
CORRESPONDENCE
Skoblov Mikhail Yu. - MD, Associate Professor of Molecular and Cell Genetics of Pirogov Russian National Research Medical University, Leading Research and Head of Group Functional Genomics Laboratory of Genetic Epidemiology of Medical Genetic Research Center (Moscow)
E-mail: [email protected]
Keywords:
gene-directed therapy, RNA-interference, small interfering RNA (siRNAs), therapy of cardiovascular diseases
Use of siRNA in cardiovascular diseases therapy
A.Yu. Filatova1, M.Yu. Skoblov2
1 Medical Genetic Research Center, Moscow
2 Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow
RNA-inteferance (RNAi) is a widespread and effective mechanism of specific suppression of gene expression by small RNA molecules. Gene therapy based on RNAi is a promising approach for the treatment of various diseases. There are a lot of in vivo studies demonstrating the effectiveness of this type of therapy. However no RNAi-based protocols are approved for clinical use. There are three basic RNAi-based principles for the gene therapy: cell treatment with siRNA for inhibition
of target gene expression; overexpression of specific miRNA; and applying of miRNA inhibitors to suppress endogenous miRNAs. At the present time, the main challenge for RNAi-based technology is the target delivery of small RNAs into the cells. In this review we describe the mechanism of siRNA and miRNA action, different ways of their delivery and examples of RNAi-based gene therapy approaches in the context of car-dio-vascular diseases.
Clin. Experiment. Surg. Petrovsky J. - 2014. - N 4. - Р. 12-19.
В научном мире существуют обоснованные ожидания, что ген-направленная терапия в будущем способна вытеснить большинство, если не все лекарственные средства, существующие на сегодняшний день. Действительно, в возможности влиять на экспрессию целевых генов лежит колоссальный потенциал для лечения заболеваний. Одним из самых известных подходов ген-направленной терапии является использование антисмысловых технологий [49]. В основе антисмысловых технологий лежит принцип комплементарного взаимодействия препарата с РНК-мишенью целевого (таргетного) гена. Данная технология обладает очевидным преимуществом по сравнению со всеми другими - высокой специфичностью действия к выбранной мишени. Антисмысловые олиго-нуклеотиды (АСОН) и малые интерферирующие РНК (siPHK) являются самыми распространенными вариантами антисмысловой регуляции экспрессии генов.
В 1978 г. благодаря П. Замечнику и М. Сте-фенсону началась эра антисмысловой терапии в живых клетках [43]. В своем эксперименте на культуре куриных фибробластов, зараженных вирусом саркомы Рауса, авторы добавили 13-членный синтетический олигонуклеотид, комплементарный З'-концу этого вируса, что привело к подавлению инфекционного процесса и предотвращению трансформации фибробластов в клетки саркомы. Таким образом, впервые было показано, что антисмысловые олигонуклеотиды (АСОН) могут специфично ингибировать экспрессию генов. С тех пор действие различных АСОН было многократно исследовано in vitro и в экспериментах с животными, при этом были получены весьма обнадеживающие результаты.
Открытие РНК-интерференции произошло 15 лет назад, и ее дальнейшее изучение привело к революции в молекулярной генетике в частности и в биологии в целом [25]. Основным триггером активации РНК-интерференции являются малые РНК, представляющие собой двухцепочечные фрагменты РНК длиной 21-24 нуклеотидных пары. Явным преимуществом технологии РНК-интерференции оказалась ее высокая эффективность, которая примерно в 100 раз выше, чем при применении АСОН [33]. За это время механизм РНК-интерференции был хорошо изучен и стал активно применяться во многих областях для подавления экспрессии генов.
Однако повсеместного внедрения антисмысловых технологий в клинику пока еще не произошло. Несмотря на успешное использование РНК-интерференции и АСОН в фундаментальной науке для влияния на экспрессию целевых генов, успешных попыток применения их в терапии забо-
леваний пока не так много. Самой главной и пока еще не решенной проблемой является специфичная доставка антисмысловых молекул в целевые клетки in vivo.
Механизмы РНК-интерференции
РНК-интерференция - это механизм специфического посттранскрипционного подавления экспрессии гена, опосредованный малыми молекулами РНК, к которым относятся эндогенные микроРНК и экзогенные малые интерферирующие РНК (siRNA). Образование малых РНК связано с активностью белка Dicer, который расщепляет длинные двухцепочечные РНК и шпилечные структуры пре-микроРНК с образованием малых интерфириру-ющих РНК (siRNA) и зрелых микроРНК. [10]. Образующиеся зрелые молекулы малых РНК могут распознаваться и связываться с белковым комплексом RISC (RNA-induced silencing complex), в составе которого они комплементарно связываются со своими РНК-мишенями. При этом для siRNA характерна полная комплементарность мишени, что приводит к расщеплению последней примерно в середине цепи siRNA и дальнейшей деградации [32]. В то же время для молекул микроРНК чаще характерна неполная комплементарность между микроРНК и целевой последовательностью, что приводит к репрессии инициации трансляции и/или ускорению деградации РНК-мишени [37].
Помимо комплекса RISC малые РНК могут распознаваться другим белковым комплексом, RITS (RNA-induced transcriptional silencing), с помощью которого малые РНК могут подавлять экспрессию генов на уровне транскрипции путем ремоделиро-вания хроматина [41]. В клетках млекопитающих транскрипционный генный сайленсинг и последующее метилирование хроматина происходят в ответ на введение экзогенных siRNA, комплементарных генным промоторам [40, 42].
Однако оказалось, что механизм транскрипционного генного сайленсинга не всегда реализуется. В каких-то случаях выполняется противоположный по эффекту механизм РНК-опосредованной активации гена (RNA-mediated gene activation). Как было показано, siRNA, комплементарная к про-моторному участку, в точке инициации транскрипции гена может приводить к активации транскрипции гена, увеличивая ее в несколько раз [21].
Доставка малых РНК
Как уже было отмечено выше, основной проблемой внедрения технологии РНК-интерференции в клинику является вопрос доставки малых молекул РНК в целевые клетки. Существующие на сегодняш-
ний день системы доставки siPHK подразделяются на 2 большие группы - вирусные и невирусные. В случае вирусной доставки создается специальная генно-инженерная конструкция, способная экспрессировать шпилечную РНК, из которой уже клеточными ферментами транскрибированная РНК созревает до siPHK. Такая вирусная доставка siPHK чрезвычайно эффективна [16], она обеспечивает продолжительный эффект, наблюдаемый в течение нескольких месяцев. Но при этом существует ряд негативных факторов, присущий всем вирусным системам доставки: потенциальная канцероген-ность, способность индуцировать иммунный ответ, а также другие, например, высокая стоимость производства [29]. Все это заставляет исследователей больше уделять внимания системам невирусной доставки siPHK, которых на сегодняшний день описано очень много [47, 48].
Невирусная доставка siPHK в клетки-мишени получила более широкое распространение в первую очередь за счет простоты и доступности использования данной технологии в различных областях фундаментальной и прикладной науки. Определение гена-мишени, дизайн siTHK, олиго-нуклеотидный синтез в коммерческой компании, трансфекция siTHK - все это простые экспериментальные этапы, доступные каждому ученому и даже студенту. Такая возможность получения информации о функции гена за счет выключения его экспрессии (gene knockdown) оказалась финансово доступной и быстрой по времени. Основным отличием данного подхода от использования вирусной доставки является кратковременный наблюдаемый эффект - не более недели.
Существующие в настоящий момент способы невирусной доставки siРНK в клетки-мишени можно разделить на 2 основные группы: доставка siTHK без оболочки со стабилизирующими модификациями и в оболочке. Доставка siРНK без оболочки широко использовалась на ранних этапах исследований явления РН^интерференции [17, 19]. Но оказалось, что незащищенные, или безоболочечные, siРНK (naked siRNA) проявляли низкую эффективность действия на гены-мишени в первую очередь за счет нестабильности при действии цитоплазматических и внеклеточных РН^з, а также за счет низкого уровня интернализации siTHK клетками и способности запускать иммунный ответ. Поэтому были разработаны различные способы химических модификации, позволяющие повысить стабильность и липофильность таких siTHK, а также снизить их способность к иммунной стимуляции [19]. Среди наиболее распространенных модификаций хочется выделить замещение фосфодиэфирной связи на более устойчивую к действию нуклеаз фосфотиоатную [18], защита
2'-гидроксильных групп [20], использование заблокированных нуклеиновых кислот (LNA - locked nucleic acids) [23], конъюгацию siTHK с пептидами, проникающими в клетку (cell penetrating peptides - CPPs). Таких модификаций сегодня описано много, и они подробно были рассмотрены нами ранее [48].
Второй вариант доставки с оболочкой также можно разделить на 2 основные группы: оболочка, состоящая из органических материалов или из неорганических. В настоящее время неорганические носители распространены мало, большая часть исследований с их использованием проводилась in vitro. Органические носители siTHK, наоборот, хорошо изучены и широко применяются, в том числе и для исследований in vivo. Большая часть таких носителей была разработана еще в конце прошлого столетия и применялась для доставки ДHK в клетки. Позднее этот опыт был использован и в работах с siTHK. Органические системы доставки включают липидные и полимерные носители, которые в свою очередь также имеют подвиды, причем каждый из них обладает рядом преимуществ и недостатков [47].
Хочется также отметить, что вопрос разработки способов эффективной доставки siTHK до сих не решен. При выборе подходящей системы исследователь может учитывать различные параметры, отображающие свойства систем доставки: размер, поверхностный заряд, адресность, способы введения siTHK in vivo, совместимость с компонентами крови, стабильность [47].
Помимо доставки siРНK in vivo, так широко востребованной и активно разрабатываемой сегодня, существуют более простые и успешные варианты локальной доставки. Самый известный и успешный пример посвящен разработке препарата на основе siRNA для лечения возрастной макуляр-ной дегенерации (ВМД), основной причины потери зрения у пожилых. Причина ангиогенеза при влажной форме ВМД - экспрессия фактора роста эндотелия VEGF, являющегося ключевым лигандом для сигнального каскада, приводящего к образованию и росту кровеносных сосудов. В стимуляции ангиогенеза также может участвовать и рецептор VEGFR-1, находящийся на поверхности клеток эндотелия сосудов, лигандом к которому может быть как сам VEGF, так и плацентарный фактор роста (PlGF).
В разработке лекарства на основе анти-VEGF siRNA приняли участие одновременно две компании: препарат компании «Acuity Pharmaceuticals» -bevasiranib - воздействует непосредственно на мPHK фактора роста VEGF, в то время как препарат компании «siRNA Therapeutics» - Sirna-027 -взаимодействует с мPHK рецептора фактора роста
VEGFR-1, что также приводит к торможению передачи сигнала и, соответственно, предотвращает формирование новых сосудов. В сентябре 2006 г. «Acuity Pharmaceuticals» объявила о положительных результатах II фазы клинических испытаний инъекций bevasiranib, который назначали 129 пациентам в 3 различных дозах. Более чем у трети больных достигнуто улучшение остроты зрения [35]. В настоящее время препарат проходит III стадию клинических испытаний [6].
Препарат Sirna-027 фирмы «siRNA Therapeutics» в ходе I фазы испытаний у 96% из 26 больных после однократной инъекции (от 100 до 1600 мкг) показал стабилизацию показателей остроты зрения, а у 23% пациентов спустя 8 нед после инъекции произошло клинически значимое улучшение [38]. Через 3 мес после однократной инъекции у 24 из 26 пациентов (92%) острота зрения стабилизировалась, у 4 из 26 пациентов (15%) наблюдали клинически значимое улучшение визуальной активности, у 2 из 26 пациентов (8%) уменьшилась визуальная активность. По данным оптической когерентной томографии, в большинстве случаев лечение привело к значимому уменьшению толщины центральной фовеолярной зоны.
Другой пример локальной доставки находится в области трансплантологии. Проблемы предотвращения отсроченной дисфункции трансплантатов, а также острого и хронического их отторжения до сих пор остаются ключевыми препятствиями на пути к увеличению времени выживания пересаженных органов. Наиболее значимым фактором, снижающим широкое использование донорских органов, являются ишемически-реперфузионные повреждения. Для улучшения характеристик трансплантанта, минимизации ишемически-реперфузи-онных повреждений, его реабилитации используют метод аппаратной перфузии. Использование пер-фузионных технологий также создает возможность фармакологической и аппаратной реабилитации поврежденного донорского органа в ишемическом периоде (от момента остановки сердца донора до момента пуска кровотока при пересадке). Так, сегодня активно изучается эффективность действия различных вариантов siTHK, посредством их добавок в консервирующий раствор при перфузии трансплантата с целью уменьшения повреждений, обусловленных ишемией-реперфузией [26]. К настоящему моменту существует целый ряд работ, направленных на использование siTHK для консервации различных пересаживаемых органов, в том числе печени [27, 31], почек [28, 34]. Более того, один из препаратов на основе siTHK (I5NP), предназначенный для предотвращения отсроченной функции трансплантата при пересадке почки, находится на I-II фазе клинических испытаний [36].
Примеры применения терапии на основе РНК-интерференции для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы
В настоящее время учеными активно ведутся исследования с целью использования siРНК для лечения практически всего спектра существующих заболеваний: офтальмологических, инфекционных, генетических, респираторных, метаболических, опухолевых и многих других [46]. В этом обзоре мы решили остановиться на заболеваниях сердечнососудистой системы.
Существуют 2 стратегии применения терапии, основанной на РНК-интерференции. Стратегия активации РНК-интерференции включает внедрение в клетку экзогенных siРНК для подавления экспрессии какого-либо целевого транскрипта или увеличение экспрессии существующей в клетке полезной микроРНК. И как было описано выше, данное воздействие может быть как кратковременным (невирусная доставка siRNA), так и долговременным (вариант вирусной доставки). Второй стратегией является направленное подавление процессов РНК-интерференции с использованием блокаторов конкретных эндогенных микроРНК клетки, так называемые антимикроРНК (antimiRNA), или антаго-миры (antagomiR).
Хотя на сегодняшний день ни один препарат на основе РНК-интерференции не внедрен в клиническую практику, уже существует большое количество работ по применению данных препаратов на модельных животных. В случае кардиоваскулярной системы вышло много различных работ, посвященных исследованию влияния si^^ микроРНК и антимикроРНК при трансплантации сердца, инфаркте миокарда, сердечной недостаточности, мерцательной аритмии, атеросклерозе, легочной гипертензии и др. (см. таблицу) [22 с изменениями].
Данные работы проводятся пока только на модельных животных и включают различные подходы к терапии. Ниже будут рассмотрены отдельные интересные примеры терапии на основе РНК-интерференции для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы.
Как уже упоминалось выше, одним из перспективных и активно развивающихся направлений применения siРНК-терапии является трансплантация органов и клеток. С одной стороны, подавление экспрессии определенных генов обеспечивает лучшую сохранность и приживаемость органа, а с другой - изъятие органа создает оптимальные условия для применения генной терапии ex vivo, сводя к минимуму риск эктопической экспрессии препарата. Процесс ишемически-реперфузионного повреждения (ИРП) трансплантата лежит в основе первичной дисфункции и отсроченной функции пе-
Эффекты введения некоторых б1РНК, микроРНК и антимикроРНК на сердечно-сосудистую систему на модельных животных
Терапевтический агент Модельное животное Терапевтический эффект Ссылка
Трансплантация сердца
siPHK против мРНК генов TNF-a, C3 и Fas Мышь Увеличение срока выживаемости трансплантата [24]
siPHK к мРНК рецепторов CD40 и CD80 Мышь Увеличение срока выживаемости трансплантата [5]
Постинфарктное ремоделирование миокарда
LNA-антимикроРНК для miR-15 Мышь, свинья Снижение размера зоны инфаркта [7]
АнтимикроРНК для miR-24 Мышь Снижение размера зоны инфаркта, нормализация сердечной деятельности после ишемического повреждения [5]
АнтимикроРНК для miR-320 Мышь Снижение размера зоны инфаркта [14]
miR-590, miR-199a Мышь Снижение размера зоны инфаркта, активация пролиферации кардиомиоцитов [24]
Ремоделирование сердца, сердечная недостаточность, гипертрофия сердца, фиброз
siPHK против мРНК гена PLB Крыса Нормализация функциональных показателей сердца, снижение уровня гипертрофии [34]
LNA-антимикроРНК для 1т^-208а Крыса Снижение уровня ремоделирования сердца, улучшение функциональных показателей сердца [11]
антимикроРНК для miR-133 Мышь Индукция устойчивой гипертрофии сердца [1]
антимикроРНК для miR-21 Мышь Снижение уровня фиброза сердца [15]
Мерцательная аритмия
антимикроРНК для miR-328 Мышь, собака Избегание фибрилляции предсердий и ассоциированного ремоделирования предсердий [9]
Атеросклероз
miR-145 Мышь Снижение размера образующихся атеросклеротических бляшек [30]
антимикроРНК для miR-21 Крыса Снижение пролиферации гладкомышечных клеток сосудов [8]
антимикроРНК для miR-33 Зеленая мартышка Увеличение уровня ЛПВП и снижение уровня ЛПОНП [13]
LNA-антимикроРНК для miR-33 Мышь Увеличение уровня ЛПВП [12]
LNA-антимикроРНК для miR-122 Мышь Снижение уровня общего холестерина в плазме [4]
Легочная гипертензия
LNA-антимикроРНК для miR-145 Мышь Предотвращение развития легочной гипертензии [2]
ресаживаемого органа, поэтому основными мишенями siPHK-терапии при трансплантации органов являются гены, вовлеченные в ИРП. Несколько лет назад в опытах по пересадке сердца на мышах было показано, что перфузия трансплантата в течение 48 ч раствором, содержащим siРНК против мРНК генов TNF-a, C3 и Fas, приводит к значительному увеличению срока выживаемости трансплантата. При этом гистологические исследования пересаженных сердец выявили значительное снижение воспалительной инфильтрации и связанного с ней мультифокального массивного некроза миоцитов при обработке трансплантата siPHK по сравнению с контрольной группой [45].
Еще одной серьезной проблемой при трансплантации органов является отторжение трансплантата, вызванное активностью иммунной системы реципиента. Жанг и соавт. в опытах по аллотрансплантации сердца на мышах использовали векторы, экспрессирующие siPHK к рецепторам антигенпрезентирующих клеток CD40 и CD80.
Инъекция данных плазмид в хвостовую вену мышам-реципиентам до и после пересадки приводила к значительному увеличению срока выживаемости транспланата. Было показано, что 70% мышей, которые получали плазмиды, экспрессирующие Б1'РНК, демонстрировали срок выживаемости трансплантата более 100 дней, тогда как в контрольной группе максимальный срок выживаемости трансплантата составлял 16 дней [44]. Таким образом, использование технологии РНК-интерференции при трансплантации органов является сравнительно новым и перспективным подходом, хотя и требует для своего развития большого количества разных исследований и клинических испытаний.
Другим направлением применения Б1'РНК-терапии является подавление экспрессии мРНК генов, участвующих в развитии заболевания. Одним из таких генов является фосфоламбан (Р1_В); белок, кодируемый данным геном, ингибирует функцию Са-АТФазы ББИСД, что в итоге приводит к усилению сократимости миокарда. Было показано, что при сердечной недо-
статочности снижается уровень SERCA или увеличивается активность PLB. Сукау и соавт. предложили использовать миРНК против мРНК гена PLB для терапии сердечной недостаточности [39]. В своей работе авторы используют специальную векторную систему на основе аденоассоциированного вируса для доставки шпилечного предшественника siРНК PLB (shRNA PLB) в клетки миокарда. У крыс была смоделирована сердечная недостаточность, а затем проведена инъекция данного вектора и оценены результаты через 1 и 3 мес. Как было показано, такая терапия восстанавливает систолические и диастолические функциональные показатели до нормальных значений и значительно снижает уровень гипертрофии сердца, диаметр кардиомиоцитов и уровень фиброза. Таким образом, авторы делают вывод, что данная терапия сердечной недостаточности высокоэффективна, более того, авторы указывают на отсутствие побочных эффектов со стороны печени.
Вторым подходом к терапии, основанной на РНК-интерференции, является увеличение экспрессии существующих в клетке полезных ми-кроРНК. Для стабильного увеличения экспрессии микроРНК в клетках также используют векторы на основе вирусов, чаще всего аденоассоциированного вируса (AAV), хотя нередко используют и другие вирусные системы (например, лентивирусную). В работе Эулалио и соавт. инъекция AAV-вектора, экспрессирующего miR-590-3p и miR-199-3p, в периинфарктную зону взрослым мышам приводила к уменьшению зоны инфаркта примерно в 2 раза и увеличению пролиферации кардиомио-цитов в пограничной зоне инфаркта по сравнению с контрольной группой в 4 раза [24]. Кроме терапии последствий инфаркта миокарда увеличение экспрессии эндогенных микроРНК эффективно для предупреждения развития атеросклероза у мышей. Ловрен и соавт. на модельных животных показали, что введение вектора, экспрессирующего miR-145 в гладкомышечных клетках сосудов, приводит к снижению размера образующихся атеросклеро-тических бляшек на 60% [30].
Следующим подходом к терапии, основанной на РНК-интерференции, является специфическое ингибирование эндогенных патогенных микроРНК через антимикроРНК. АнтимикроРНК представляют одноцепочечные ДНК-олигонуклеотиды длиной около 22 пн, содержащие ряд химических модификаций, увеличивающих их стабильность, сродство с микроРНК-мишенью и эффективность проникновения в клетки. Данные терапевтические агенты комплементарно связываются и стерически блокируют микроРНК-мишени. Использование антимикроРНК в генной терапии позволяет целенаправленно воздействовать на эндогенную микроРНК мишень и сводить к минимуму побочные эффекты, работая по схеме «одно лекарство-одна мишень».
На сегодняшний день проводятся многочисленные испытания антимикроРНК в терапии сердечно-сосудистых заболеваний. К примеру, miR-145 является самой распространенной микроРНК, экс-прессирующейся в стенке артерий, она способна регулировать гладкомышечные клетки [3]. В опытах на мышах было показано, что использование антимикроРНК к miR-145 позволяет предотвратить развитие артериальной легочной гипертензии [2].
Ишемическое повреждение сердца в ряде случаев приводит к изменению уровня некоторых микроРНК и последующему ремоделированию кар-диомиоцитов в поврежденной области. Так, при инфаркте миокарда увеличивается уровень miR-15. Использование антимикроРНК к miR-15 успешно снижает уровень микроРНК-15 в сердечной ткани мышей, а также уменьшает зону инфаркта и препятствует ремоделированию кардиомиоцитов в ответ на ишемическое повреждение [7].
Одной из причин сердечно-сосудистых заболеваний является высокий уровень липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Одним из возможных путей снижения уровня ЛПНП является повышение уровня липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). miR-33 является ключевым регулятором биогенеза ЛПВП, снижая его уровень в плазме. На зеленых мартышках было показано, что антимикроРНК к miR-33 приводит к значительному и продолжительному увеличению уровня ЛПВП [13].
Заключение
Ген-направленная терапия, основанная на механизме РНК-интерференции, включает 3 основных подхода: внедрение в клетку экзогенной Б1'РНК для подавления экспрессии целевых генов, увеличение экспрессии существующей в клетке полезной микроРНК и применение блокаторов микроРНК с целью подавления экспрессии эндогенных патогенных микроРНК. Основной проблемой терапевтического применения малых РНК-молекул остается адресная доставка препарата. Однако в настоящее время ведется множество работ по преодолению данной проблемы. И хотя на сегодняшний день в клинической практике не применяется ни один препарат, действие которого основано на механизме РНК-интерференции, уже существует большое количество исследований, доказывающих эффективность данного вида терапии in vivo на модельных животных. Некоторые препараты уже находятся на разных стадиях клинических испытаний. Все это говорит в пользу того, что ген-направленная терапия, основанная на механизме РНК-интерференции, является перспективным направлением в разработке лекарственных препаратов для терапии большого количества различных заболеваний, в том числе заболеваний сердечно-сосудистой системы.
Литература
1. Care A., Catalucci D., Felicetti F. et al. MicroRNA-133 controls cardiac hypertrophy // Nat. Med. - 2007. - Vol. 1, N 5. - P. 613-618.
2. Caruso P., Dempsie Y., Stevens H.C. et al. A role for miR-145 in pulmonary arterial hypertension: evidence from mouse models and patient samples // Circ. Res. - 2012. -Vol. 111, N 3. - P. 290-300.
3. Cheng Y., Liu X., Yang J. et al. MicroRNA-145, a novel smooth muscle cell phenotypic marker and modulator, controls vascular neointimal lesion formation // Circ. Res. -
2009. - Vol. 105, N 2. - P. 158-166.
4. Elmen J., Lindow M., Silahtaroglu A. et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver // Nucleic Acids Res. - 2008. -Vol. 36, N 4. - P. 1153-1162.
5. Fiedler J., Jazbutyte V., Kirchmaier B.C. et al. Mi-croRNA-24 regulates vascularity after myocardial infarction // Circulation. - 2011. - Vol. 124, N 6. - P. 720-730.
6. Garba A.O., Mousa S.A. Bevasiranib for the treatment of wet, age-related macular degeneration // Ophthalmol Eye Dis. - 2010. - Vol. 2. - P. 75-83.
7. Hullinger T.G., Montgomery R.L., Seto A.G. et al. Inhibition of miR-15 protects against cardiac ischemic injury // Circ. Res. - 2012. - Vol. 110, N 1. - P. 71-81.
8. Ji R., Cheng Y., Yue J. et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation // Circ. Res. - 2007. - Vol. 100, N 11. - P. 15791588.
9. Lu Y., Zhang Y., Wang N. et al. MicroRNA-328 contributes to adverse electrical remodeling in atrial fibrillation // Circulation. - 2010. - Vol. 122, N 23. - P. 23782387.
10. Merritt W.M., Bar-Eli M., Sood A.K. The dicey role of Dicer: implications for RNAi therapy // Cancer Res. -
2010. - Vol. 70, N 7. - P. 2571-1574.
11. Montgomery R.L., Hullinger T.G., Semus H.M. et al. Therapeutic inhibition of miR-208a improves cardiac function and survival during heart failure // Circulation. -
2011. - Vol. 124, N 14. - P. 1537-1547.
12. Najafi-Shoushtari S.H., Kristo F., Li Y. et al. Mi-croRNA-33 and the SREBP host genes cooperate to control cholesterol homeostasis // Science. - 2010. - Vol. 328, N 5985. - P. 1566-1569.
13. Rayner K.J., Esau C.C., Hussain F.N. et al. Inhibition of miR-33a/b in non-human primates raises plasma HDL and lowers VLDL triglycerides // Nature. - 2011. - Vol. 478, N 7369. - P. 404-407.
14. Ren X.P., Wu J., Wang X. et al. MicroRNA-320 is involved in the regulation of cardiac ischemia/reperfusion injury by targeting heat-shock protein 20 // Circulation. -2009. - Vol. 119, N 17. - P. 2357-2366.
15. Thum T., Gross C., Fiedler J. et al. MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP ki-
nase signalling in fibroblasts // Nature. - 2008. - Vol. 456, N 7224. - P. 980-984.
16. Aigner A. Delivery systems for the direct application of siRNAs to induce RNA interference (RNAi) in vivo // J. Biomed. Biotechnol. - 2006. - Vol. 2006. - N 4. - P. 71659.
17. Akhtar S., Benter I. Toxicogenomics of non-viral drug delivery systems for RNAi: potential impact on siRNAmediated gene silencing activity and specificity // Adv. Drug Deliv Rev. - 2007. - Vol. 59, N 2-3. - P. 164-182.
18. Amarzguioui M., Hoien T., Babaie E., Prydz H. Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA // Nucleic Acids Res. - 2003. - Vol. 31, N 2. -P. 589-595.
19. Bumcrot D., Manoharan M., Koteiiansky V., Sah D.W. RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs // Nat. Chem. Biol. - 2006. - Vol. 2, N 12. -P. 711-719.
20. Chiu Y.L., Rana T.M. siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis // RNA. - 2003. - Vol. 9, N 9. -P. 1034-1048.
21. Chu Y., YueX., Younger S.T. et ai. Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter // Nucleic Acids Res. - 2010. -Vol. 38, N 21. - P. 7736-7748.
22. Condoreiii G., Latronico M.V., Cavarretta E. microR-NAs in cardiovascular diseases: current knowledge and the road ahead // J. Am. Coll. Cardiol. - 2014. - Vol. 63, N 21. -P. 2177-2187.
23. Eimen J., Thonberg H., Ljungberg K. et ai. Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality // Nucleic Acids Res. - 2005. - Vol. 33, N 1. - P. 439-447.
24. Euiaiio A., Mano M., Dai Ferro M. et ai. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration // Nature. - 2012. - Vol. 492, N 7429. - P. 376-381.
25. Fire A., Xu S., Montgomery M.K. et ai. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. - 1998. - Vol. 391, N 6669. - P. 806-811.
26. Giebova K., Reznik O.N., Reznik A.O. et ai. siRNA technology in kidney transplantation: current status and future potential // BioDrugs. - 2014. - Vol. 28, N 4. -P. 345-361.
27. Hernandez-Aiejandro R., ZhangX., Croome K.P. et ai. Reduction of liver ischemia reperfusion injury by silencing of TNF-alpha gene with shRNA // J. Surg. Res. - 2012. -Vol. 176, N 2. - P. 614-620.
28. Imamura R., Isaka Y., Sandovai R.M. et ai. Intravital two-photon microscopy assessment of renal protection efficacy of siRNA for p53 in experimental rat kidney transplantation models // Cell Transplant. - 2010. - Vol. 19, N 12. -P. 1659-1670.
29. Kim E.J., Shim G., Kim K. et ai. Hyaluronic acid complexed to biodegradable poly L-arginine for targeted
delivery of siRNAs // J. Gene Med. - 2009. - Vol. 11, N 9. -P. 791-803.
30. Lovren F., Pan Y., Quan A. et at. MicroRNA-145 targeted therapy reduces atherosclerosis // Circulation. -2012. - Vol. 126, N 11. - Suppl. 1. - P. S81-90.
31. Luo L., Lu J., Li W.C. et at. RNA interference targeting Re1B attenuates liver ischemia/reperfusion injury // J. Surg. Res. - 2012. - Vol. 178, N 2. - P. 898-906.
32. Meister G., Landthater M., Patkaniowska A. et at. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs // Mol. Cell. - 2004. - Vol. 15, N 2. -P. 185-197.
33. Miyagishi M., Hayashi M., Taira K. Comparison of the suppressive effects of antisense oligonucleotides and siRNAs directed against the same targets in mammalian cells // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. - 2003. - Vol. 13, N 1. - P. 1-7.
34. Motitoris B.A., Dagher P.C., Sandovat R.M. et at. siRNA targeted to p53 attenuates ischemic and cisplatin-in-duced acute kidney injury // J. Am. Soc. Nephrol. - 2009. -Vol. 20, N 8. - P. 1754-1764.
35. Pharmaceuticats A. Acuity Pharmaceuticals Reports Positive Initial Phase II Results For Bevasiranib (Cand5) In Wet AMD - medicalnewstoday, 2006. URL: http://www. medica1newstoday.com/re1eases/44387.php.
36. Pharmaceuticals Q. I5NP for Prophylaxis of Delayed Graft Function in Kidney Transplantation - clinical-trials.gov, 2014. URL: https://c1inica1tria1s.gov/ct2/show/ NCT00802347.
37. Pittai R.S., Bhattacharyya S.N., Artus C.G. et at. Inhibition of trans1ationa1 initiation by Let-7 MicroRNA in human ce11s // Science. - 2005. - Vo1. 309, N 5740. -P. 1573-1576.
38. Sirna Therapeutics I. Sirna Therapeutics Reports Fina1 Resu1ts From Phase 1 Study On Its RNAi-Based Therapeutic For Age-Re1ated Macu1ar Degeneration - medica1-newstoday, 2006. URL: http://www.medica1newstoday.com/ re1eases/49334.php.
39. Suckau L., Fechner H., Chematy E. et at. Long-term cardiac-targeted RNA interference for the treatment
of heart failure restores cardiac function and reduces pathological hypertrophy // Circulation. - 2009. - Vol. 119, N 9. - P. 1241-1252.
40. Ting A.H., Schuebei K.E., Herman J.G., Baylin S.B. Short double-stranded RNA induces transcriptional gene silencing in human cancer cells in the absence of DNA methylation // Nat. Genet. - 2005. - Vol. 37, N 8. -P. 906-910.
41. Wassenegger M. The role of the RNAi machinery in heterochromatin formation // Cell. - 2005. - Vol. 122, N 1. - P. 13-16.
42. Weinberg M.S., Villeneuve L.M., Ehsani A. et at. The antisense strand of small interfering RNAs directs histone methylation and transcriptional gene silencing in human cells // RNA. - 2006. - Vol. 12, N 2. -P. 256-262.
43. Zamecnik P.C., Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide // Proc. Natl Acad. Sci. USA. -1978. - Vol. 75, N 1. - P. 280-284.
44. Zhang X., Liu Y., Zhang G. et at. Synergic silencing of costimulatory molecules prevents cardiac allograft rejection // J. Transl. Med. - 2014. - Vol. 12. - P. 142.
45. Zheng X., Lian D., Wong A. et at. Novel small interfering RNA-containing solution protecting donor organs in heart transplantation // Circulation. - 2009. - Vol. 120, N 12. - P. 1099-1107.
46. Марахонов А.В., Баранова А.В., Скоблов М.Ю. РНК интерференция: фундаментальные и прикладные аспекты // Мед. генетика. - 2008. - № 10 (76). - C. 44-56.
47. Глебова К.В., Марахонов А.В., Баранова А.В., Скоблов М.Ю. Невирусные системы доставки siРHK // Молекул. биол. - 2012. - Т. 46. № 3. - C. 387-401.
48. Глебова К. В., Марахонов А. В., Баранова А. В., Скоблов М.Ю. Терапевтические siРHK и невирусные системы их доставки // Молекул. биол. - 2012. - Т. 46. № 3. - C. 371-386.
49. Скоблов М.Ю. Перспективы технологий антисмысловой терапии // Молекул. биол. - 2009. - Т. 43. № 6. -C. 1-15.
