CC BY
331
CV
со
ев
и ш u
ж ш
и
Феномен РНК-интерференции в онкологии: достижения,
проблемы и перспективы
О.Е. Андреева, М.А. Красильников
Научно-исследовательский институт канцерогенеза ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Михаил Александрович Красильников krasilnikovm1@yandex.ru
Обзор посвящен РНК-интерференции — сравнительно недавно открытому биологическому механизму негативной регуляции экспрессии генов. В основе этого механизма лежит блок трансляции и/или деградация информационной матричной РНК под действием малых некодирующих РНК, наиболее известными представителями которых являются микроРНКи короткие интерферирующие РНК. В обзоре рассматрены молекулярные процессы образования малых РНК, механизм действия и возможность их использования в качестве противоопухолевых терапевтических препаратов. Особое внимание отведено проблеме доставки малых РНК in vivo, в том числе с помощью липосом и экзосом, и перспективам использования таких препаратов в клинической практике.
Ключевые слова: РНК-интерференция, злокачественная опухоль, микроРНК, короткие интерферирующие РНК, РНК-доставка, липосома, экзосома
DOI: 10.17650/2313-805X-2016-3-3-08—15
The phenomenon of RNA interference in oncology: advances, problems and perspectives
O.E. Andreeva, M.A. Krasil'nikov
Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia;
24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115478, Russia
Review describes the phenomenon of RNA interference — the recently discovered biological mechanism of the negative regulation of gene expression. The mechanism is based on the block of the translation and/or degradation of messenger RNA under short non-coding RNA, among them: microRNA and small interfering RNA. The paper reviews the molecular processes of the formation of small RNA, the mechanism of their action and the feasibility of small RNA implementation in the anti-tumor therapy. Specially, we analyze the approaches to in vivo delivery of small RNA, in particular — the liposome and exosome constructs, and perspectives of the involvement of such constructs in the cancer treatment.
Key words: RNA interference, malignant tumor, microRNA, small interfering RNA, RNA delivery, liposome, exosome
РНК-интерференция: общие представления
РНК-интерференция — естественный биологический процесс подавления экспрессии определенных генов, в основе которого лежит блок трансляции и/или деградация информационной матричной РНК (мРНК) под действием так называемых малых некодирующих РНК. Явление РНК-интерференции было впервые описано А. Fire и С. С. Mello, получившими впоследствии за это открытие Нобелевскую премию [1]. Авторы на примере Caenorhabditis elegans продемонстрировали способность коротких двуцепочечных РНК вызывать подавление экспрессии гомологичных генов. В дальнейших исследованиях установлен и хорошо изучен механизм этого явления, основанного на процес-синге малых РНК с образованием коротких 21-23-нук-леотидных двуцепочечных РНК и последующим их связыванием с гомологичными участками мРНК [2, 3].
В семействе малых некодирующих РНК выделяют несколько групп, к основным из которых относят микроРНК (miРНК) и короткие интерферирующие РНК
(б1РНК). Оба вида обладают сходной структурой и являются ингибиторами экспрессии генов, основные различия между ними заключаются в механизме образования и степени гомологии к таргетным мРНК [4]. Предшественниками ш1РНК считаются первичные (primary) ш1РНК (рг1-ш1РНК) эндогенного происхождения, транскрибируемые с соответствующих генов, кодирующих miРНК [5]. Pri-miРНК под действием внутриядерного ферментативного комплекса Drosha расщепляются до 70-100-нуклеотидных фрагментов (pre-miРНК), которые транспортируются в цитоплазму и подвергаются дальнейшему процессингу в ферментативной системе Dicer до образования miРНК [6]. Зрелые miРНК представляют собой 21-23-нук-леотидные последовательности, которые не полностью комплементарны таргетным мРНК и благодаря этому способны инактивировать одновременно несколько различных мРНК [7]. В отличие от miРНК к предшественникам siРНК относятся короткие дву-цепочечные РНК ^РНК) как эндогенного, так и эк-
зогенного (вирусного) происхождения, причем siРНК обладают полной комплементарностью к таргетным мРНК и, соответственно, являются высокоспецифическими ингибиторами синтеза белка.
Процессинг pre-miРНК и dsРНК с образованием соответственно miРНК и siРНК регулируется одной и той же ферментативной системой, включающей рибо-нуклеазный комплекс Dicer [8, 9]. Затем зрелые miРНК и siРНК связываются РНК-индуцируемым блокирующим комплексом RISC (RNA-Induced Silencing Complex), в котором переходят в одноцепочечное состояние с последующей деградацией одной из цепей, тогда как вторая цепь в комплексе с эндонуклеазой Argonaute 2, входящей в состав RISC, взаимодействует с комплементарными участками информационной мРНК, приводя к деградации последней и/или блоку трансляции (см. рисунок) [10].
Малые РНК и направленная регуляция экспрессии генов
В 2001 г. впервые были описаны эффекты транс-фекции малых РНК в эукариотические клетки [4]. Дальнейшие исследования по таргетной доставке нано-частиц, несущих siРНК в человеческие клетки путем
систематических инъекции, послужили мощным толчком для развития новых подходов с применением РНК-интерференции в клинической практике [11].
Пристальное внимание к РНК-интерференции, как к перспективному инструменту направленного воздействия на экспрессию генов, объясняется следующими факторами:
♦ специфичность действия;
♦ незначительные побочные эффекты;
♦ легкость синтеза препаратов РНК.
Правильно подобранные последовательности РНК
могут избирательно ингибировать экспрессию генов, связанных с теми или иными нарушениями, такими как гиперэкспрессия онкогенов или мутации онко-супрессоров [12]. В настоящее время более 20 препаратов на основе малых РНК находятся на стадии клинических испытаний [12, 13].
Широкое использование РНК-препаратов в клинической практике ограничивается рядом факторов.
В физиологических условиях РНК нестабильна. Эффективное действие miРНК/siРНК предполагает их доставку к опухоли через кровеносное русло, однако при внутривенном введении молекулы деградируют
CV
CS
и ш u
Лтг
IIIIIII IIIIIIIII II
Pre-miPHK
miPHK
I IIIIII.....
f \ RISC
siPHK mPHKI
s > RISC
Ago2
к
Ago2
RISC
miPHK мРНК
Деградация мРНК
Блок трансляции
X ш
и
Схема образования в клетках siPHKи miPHK. Предшественники малых РНК, dsPHKиpre-miPHK, поступают врибонуклеазный комплекс Dicer, в котором подвергаются процессингу с образованием коротких двуцепочечных РНК, siPHK и miPHK соответственно. Зрелые siPHK и miPHK связываются PHK-индуцируемым блокирующим комплексом RISC, в котором переходят в одноцепочечное состояние с последующей деградацией одной из цепей. Другая цепь в комплексе с эндонуклеазой Argonaute 2 взаимодействует с комплементарными участками информационной мPHK, приводя к деградации последней и/или блоку трансляции
CV
со
ев
и ш u
ж ш
и
под действием сывороточных нуклеаз, экскретируют-ся почками, поглощаются фагоцитами и агрегируют с белками сыворотки [14]. Нуклеазная активность в сыворотке крови и тканях является, по сути, первым барьером при доставке малых РНК. Основная нукле-аза плазмы — З'-экзонуклеаза, однако разрывы меж-нуклеотидных связей могут происходить не только на З'-конце, но и в середине молекулы РНК. Период полураспада ш1РНК/б1РНК в кровеносном русле составляет от нескольких минут до 1 ч [15].
Также необходимо отметить роль почек в выведении РНК из организма: in vivo продемонстрировано преимущественное поглощение РНК именно почками [16]. Дополнительный барьер для доставки ш1РНК/б1РНК in vivo — поглощение ретикулоэндоцитарной системой, в первую очередь фагоцитирующими клетками, в том числе циркулирующими моноцитами и тканевыми макрофагами [17], основными физиологическими функциями которых являются очистка от инородных патогенов, удаление клеточного дебриса и утилизация апоптотических клеток [18]. Наибольшее количество тканевых макрофагов представлено в печени (купфе-ровские клетки) и селезенке — органах с высоким уровнем васкуляризации, пропускающих через себя большой объем крови [19].
Попадая в клетки-мишени, РНК, находящиеся в свободном состоянии, быстро деградируют. Они накапливаются в ранних эндосомах, последовательно сливающихся с сортировочными эндосомами, содержимое которых, в свою очередь, направляется в поздние эндосомы [20]. При этом уровень рН эндосомального компартмента значительно снижен (pH 5,0—6,2) по сравнению с нейтральным рН (pH 7,4) цитозольного компартмента и межклеточного пространства [21]. Затем эндосомы направляются в лизосомы, в которых их содержимое еще сильнее окисляется (pH 4,5) и деградирует после связывания нуклеазами [22].
Свободная двуцепочечная РНК обладает гидрофильными и анионными свойствами и в свободном виде не может проникнуть в клетку. Для пересечения мембраны необходима упаковка РНК, связывание ее с каким-либо носителем [23].
Несмотря на эти ограничения, терапевтический потенциал малых РНК велик, однако на пути успешного применения препаратов ш1РНК/б1РНК в клинической практике стоит проблема их специфической доставки в опухолевые клетки.
Доставка малых РНК в опухолевые клетки: химическая модификация и искусственные носители
Для системного введения РНК in vivo необходимо обеспечить [14]:
♦ стабильность в сыворотке крови;
♦ неиммуногенность;
♦ незначительность связывания белками плазмы и нетрансформированными клетками;
♦ возможность избежать фильтрации почками;
♦ проникновение к клеткам опухоли через стенки
сосудов;
♦ попадание в клетку и освобождение из эндосом;
♦ отсутствие токсичности.
Модификации РНК.. Модификации молекул miРНК/ siРНК, позволяющие защитить их от действия нуклеаз, увеличивают их физиологическую стабильность [24]. К таким модификациям относятся группы 2-О-метил и 2-диокси-2-флюоро, а также тиофосфатные линкеры [10, 25]. Несмотря на способность таких модификаций повышать стабильность miРНК/siРНК и увеличивать иммунологическую толерантность, этого оказывается недостаточно для обеспечения свободного прохождения РНК через отрицательно заряженную плазматическую мембрану [26].
Упаковка РНК в наноконтейнеры из катионных полимеров позволяет решить проблему заряда для транспортировки РНК через клеточную мембрану, однако основным ограничением их использования является иммуногенность полимеров [27]. Основной путь выведения наночастиц из крови происходит посредством адсорбции на них иммунореактивных белков (оп-сонизации) и последующего поглощения системой мононуклеарных фагоцитов [19]. Стратегия снижения связывания наночастиц белками плазмы заключается в использовании разветвленных полимеров полиэти-ленгликоля, покрывающих поверхность наноконтейне-ра с РНК [21]. Полиэтиленгликоль значительно увеличивает продолжительность их циркуляции в крови, защищая от взаимодействия с клетками иммунной системы и белками плазмы.
In vivo малые РНК выводятся через печень, селезенку и легкие, однако основной путь их экскреции связан с почками [28]. Размер поры гломерул, через которые происходит фильтрация, составляет около 8 нм. Молекулы меньше 50 kDa, в том числе miРНК и siРНК массой 13 kDa, проходят в канал и экскретируются с мочой [19]. Синтетические материалы, связывающие РНК и образующие наночастицы большего диаметра, используют для защиты РНК от гломерулярной фильтрации в почках, повышая биодоступность для таргетных органов [29]. Многие разработанные системы основаны на применении частиц размером более 20 нм [16].
Синтетические наноконтейнеры, липосомы, трех-блочные полимеры. В последнее время активно разрабатываются системы, в которых носителями miРНК и siРНК являются везикулы, мицеллы, липосомы и неорганические гибридные частицы [30—32]. Основанием для разработки таких систем считается эффект повышенной проницаемости и накопления: наночастицы размером от десятков до сотен нанометров накапливаются преимущественно в опухолевых, а в не в нормальных тканях благодаря аномальной структуре кровеносных сосудов, возникающих de novo при неоваскуляризации [33].
Липосомы — синтетические частицы с липидной мембраной, которые могут поглощать как гидрофобные, так и гидрофильные молекулы [34]. РНК в составе
липосом попадает в клетку путем эндоцитоза, поэтому для повышения избирательности липосом используют включение в их состав таргетных лигандов [35, 36]. Связываясь с рецепторами, экспонированными на мембранах таргетных клеток, такие частицы поглощаются по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза [25]. Однако адсорбция белков плазмы на поверхности этих частиц может препятствовать связыванию лиганда и рецептора [37]. В других системах используются пептиды, проникающие через мембрану (cell penetrating peptides) [38], благодаря которым наночастицы могут проникать в клетку не только по механизму эндоцитоза, но и независимым от него образом [39]. Некоторые системы используют чувствительные к рН материалы, меняющие конформацию при снижении уровня рН и обеспечивающие таким образом высвобождение РНК из эндосом [40].
В синтетических липосомах присутствуют, как правило, гидрофобные молекулы, которые образуют внутреннюю стенку мицеллы, и гидрофильные молекулы, формирующие оболочку [31]. Гидрофильные участки содержат катионы и связывают отрицательно заряженные молекулы ДНК и РНК [40].
Полимеры для производства липосом организованы по блочному принципу. Примером могут служить трехблочные полимеры типа ABC, которые содержат:
♦ гидрофильный блок (полиэтиленгликоль);
♦ гидрофобное ядро: поли(капролактон), поли(п-бутил акрилат) и др.;
♦ катионный блок: поли(2-аминоэтилэтиленфосфат) и полиэтиленимин (PEI) [41]. Наноконтейнеры имеют тенденцию накапливаться в печени, легких, селезенке и почках, что, помимо неизбежных токсических эффектов, существенно ограничивает их использование в других тканях [14].
Доставка малых РНК в опухолевые клетки: экзосомы
Общие представления об экзосомах. Клетки эукари-от являются источниками мембранных везикул — окруженных мембраной фрагментов цитоплазмы, секре-тируемых во внеклеточное пространство. Везикулы могут формироваться в эндолизосомальном компарт-менте или на плазматической мембране клетки. Среди различных видов секретируемых мембранных везикул выделяются экзосомы — везикулы диаметром 40—100 нм, которые покидают клетку при слиянии внутриклеточных мультивезикулярных комплексов (эндосом) с плазматической мембраной клетки. Экзосомы играют особую роль в межклеточной коммуникации, позволяя осуществлять горизонтальную передачу от клетки к клетке не только мембранных компонентов, но и цитоплаз-матического содержимого, в том числе белков и нуклеиновых кислот. Экзосомы в большом количестве присутствуют в крови, моче и других биологических жидкостях и вовлечены в различные физиологические и патологические процессы, что позволяет использовать их в качестве биомаркеров для диагностики некоторых заболеваний.
Все экзосомы вне зависимости от вида родительских клеток содержат белки, связанные с мембранным транспортом и реорганизацией мембраны (Rab GTPases, аннексины, флотиллин), белки, участвующие в биогенезе мультивезикулярных телец (Alix и TSG101), белки теплового шока (hsp70 и 90), интегрины и тетра-спанины (CD9, CD63, CD81 и CD82) [39]. Некоторые из этих белков специфичны для экзосом и могут использоваться в качестве экзосомальных маркеров (например, Alix, флотиллин, TSG101, CD63). Еще одна особенность экзосом — высокое содержание липидов, характерных для липидных рафтов (холестерин, сфин-голипиды, керамиды и гликофосфолипиды).
Почти все типы клеток могут секретировать экзо-сомы, и большинство работ, опубликованных за последнее время, указывает на их исключительную роль как в поддержании нормальных физиологических реакций, так и в патогенезе.
Интересным свойством экзосом с точки зрения генной терапии является их способность осуществлять горизонтальный перенос генетического материала. В 2006 г. было показано, что везикулы эмбриональных стволовых клеток содержат мРНК плюрипотентных белков, участвующих в созревании предшественников гематопоэтических клеток (HSPCs) [42]. Затем в микровезикулах, секретируемых опухолевыми клетками, были обнаружены опухолевые маркеры и мРНК, которые in vitro могут передаваться моноцитам [43]. В других работах описана способность микровезикул, секретируемых клетками-предшественниками эндотелиоцитов, активировать ангиогенные программы в эндотелиоцитах посредством селективного переноса мРНК [44]. Отмечено, что экзосомы, продуцируемые клетками глио-бластомы, также осуществляют перенос мРНК, которые меняют синтез белка de novo в реципиентных клетках [45]. В работе Н. Valadi и соавт. впервые было показано, что в микровезикулах и экзосомах содержится не только мРНК, но и miРНК [46]. Получены свидетельства участия экзосом в переносе функциональных miРНК, причем донорами экзосом могут быть различные типы клеток, в том числе эмбриональные стволовые клетки [47]. Продемонстрирована способность экзосом доставлять miРНК к мезенхимальным стволовым клеткам и стволовым клеткам печени [48], а также к Т-лимфо-цитам, причем последние участвуют в однонаправленном переносе miРНК к антигенпрезентующим клеткам посредством секреции экзосом [49].
В целом имеющиеся на сегодняшний день данные свидетельствуют о возможности использования микровезикул и экзосом — основных межклеточных переносчиков РНК естественного происхождения — в качестве эффективных средств доставки в клетки противоопухолевых агентов — как генно-инженерных конструкций, так и химиопрепаратов.
Структурные особенности экзосом опухолевых клеток. Структура и состав экзосом могут сильно варьировать в зависимости от вида клеток-продуцентов,
CV
ев
и ш u
X ш
и
CV
со
ев
и ш u
х ш
и
и в этом плане опухолевые клетки не являются исключением. Так, в работе [50] исследованы различия в адгезии и поглощении экзосом, продуцируемых опухолевыми клетками (линии PC3, MCF-7, MDA-MB-231, SK-Mel-5, H460) и иммортализованными нетрансфор-мированными клетками (16HBE, WPMY-1, ARPE-19). Анализ связывания экзосом с клетками родительских линий и другими, в том числе иммортализованными, показал, что опухолевые клетки в целом гораздо активнее поглощают экзосомы. При этом нельзя достоверно утверждать, что они поглощают «свои» экзосомы, полученные от той же клеточной линии, с большей специфичностью, чем экзосомы от других источников, поскольку увеличивается и неспецифическое поглощение экзосом по причине активного эндоцитоза. Анализ физических свойств экзосом, полученных из культу-ральной среды линий PC3, MCF-7 и MDA-MB-231, не выявил различий, следовательно, различная эффективность их поглощения клетками может определяться биологическими свойствами липидных и/или белковых компонентов экзосом.
Мембрана экзосом обогащена холестерином, сфингомиелином и анионными фосфолипидами, в том числе фосфатидилсерином, что придает экзосомам прочность и стабилизирует их структуру. Помимо ли-пидного состава к важным компонентам для связывания с поверхностью клетки относятся белки экзосом, основными представителями которых являются белки адгезии, тетраспанины, белки ICAM (intercellular adhesion molecule).
Адгезивные белки, особенно интегрины, содержатся в экзосомах в большом количестве и служат рецепторами клеточной адгезии. Представители другой группы белков, тетраспанины, предположительно отвечают за выбор таргетных клеток и взаимодействие с ними [51]. Белки ICAM также способствуют связыванию экзосом с поверхностью реципиентных клеток [52]. Необходимо отметить, что опухолевые клетки гораздо активнее поглощают экзосомы, чем синтетические липосомы или липосомы, сформированные из экзосомных липидов [27], что указывает на важность белков экзосом для реализации их биологической активности.
Экзосомы как средства доставки малых РНК. Ключевая проблема в использовании экзосом для доставки РНК — загрузка РНК-препаратов в экзосомы. Для этого применяются несколько подходов, в том числе электро-порация, химическая трансфекция и химическая модификация экзосом.
Электропорация. При использовании электропо-рации эффективность упаковки РНК в экзосомы не зависит от последовательности РНК, и, собственно, эффективность трансфекции определяется правильным выбором параметров, условий и оборудования. Основной проблемой данного подхода является неправильная оценка эффективности фактической загрузки РНК в экзосомы, вызванная денатурацией РНК. Так, в ра-
боте [53] показано, что электропорация приводит к агрегации siРНК, поэтому эффективность загрузки siРНК, определяемая измерением флюоресценции, неадекватна и заметно завышена (фактическое содержание siРНК в экзосомах не превышало 0,05 %).
Химическая трансфекция. Для загрузки РНК в эк-зосомы используют также липидные трансфекционные реагенты, такие как Hiperfekt и Lipofectamin 2000. Существенное ограничение этого метода — невозможность полного отделения от экзосом несвязавшегося трансфекционного комплекса РНК, что значительно затрудняет интерпретацию получаемых данных, во всяком случае при экспериментальных исследованиях [54].
Химическая модификация экзосом. Основной подход подразумевает предварительную трансфекцию донорских клеток векторными конструкциями в целях обогащения экзосом соответствующим белком [55]. Впервые возможность использования модифицированных экзосом для таргетной доставки siРНК продемонстрирована в экспериментах на дендритных клетках [56, 57]. Незрелые дендритные клетки были трансфициро-ваны плазмидой для экспрессии химерного белка эк-зосом Lamp2b, слитого с RVG (rabies viral glycoprotein) — пептидом, специфично экспрессирующимся в мозге. Экзосомы, несущие RVG, были получены из культур таких клеток и загружены siРНК GAPDH с помощью электропорации. Доставка таргетных RVG-экзосом in vivo путем инъекции в хвостовую вену привела к значительному подавлению GAPDH в нескольких областях мозга у мышей [58].
В других исследованиях экзосомы применяли для системной доставки экзогенных miРНК [59]. Так, трансфекция моноцитов miРНК-150 приводила к усилению продукции экзосом, обогащенных miРНК-150, которые использовали для доставки последней в реципи-ентные клетки [59]. Аналогичный подход был применен для обогащения экзосом miРНК-143 [60]. Успешные эксперименты были проведены по доставке с помощью модифицированных экзосом siРНК и dsРНК [61].
Экзосомы и малые РНК: перспективы клинического применения
На сегодняшний день исследования экзосом в качестве средств доставки РНК находятся преимущественно на стадии экспериментальных разработок, но работы в этом направлении ведутся чрезвычайно активно. В первую очередь, это поиск оптимального варианта экзосом, содержимое которых было бы достаточно нейтральным и не провоцировало рост опухоли [62, 63]. С этой точки зрения среди потенциальных кандидатов на роль доноров экзосом следует отметить иммортализованные мезенхимальные стволовые клетки, которые потенциально могут быть использованы в качестве средств доставки РНК [64].
Для повышения специфичности экзосом разрабатываются конструкции, содержащие fusion-белки, в которых сигнальные пептиды или антитела к опухо-
левым антигенам фиксированы с поверхностными белками экзосом [51]. Отдельный интерес представляет использование экзосом в качестве носителей не только б1РНК, но и других типов малых РНК, в том числе ш1РНК [65], ингибиторов ш1РНК [66], плазмид для экспрессии бИРНК [55]. Среди успешно разработанных экспериментальных систем доставки малых РНК с помощью экзосом можно отметить эффективную доставку б1РНК МАРК1 в моноциты и лимфоциты [67], б1РНК RAD-51 (белок из семейства ферментов репарации) [68], c-Myc [69], TGF-01 [70], PLK-1 (pololike kinase 1) [71], а также доставку некоторых miРНК и/или их ингибиторов [72, 73]. Работы в этом направлении ведутся, и можно рассчитывать, что в ближайшее время они перейдут в фазу клинических исследований.
Заключение
Малые РНК miРНК и siРНК, являясь по природе высокоспецифичными ингибиторами синтеза белков, нашли широкое применение в экспериментальных исследованиях, в первую очередь как инструмент, позволяющий избирательно блокировать синтез определенных молекул и тем самым оценить их вклад в те или иные внутриклеточные процессы. На этом же основано и применение малых РНК в клинической практике как таргетных препаратов, направленных на подавление экспрессии определенных белков, ассоциированных с развитием данного заболевания.
Несмотря на большой потенциал использования miРНК и siРНК в терапевтических целях, лишь несколько препаратов проходят клинические испытания. Основные причины этого — низкая стабильность малых РНК в организме и отсутствие специфических средств доставки РНК к клеткам-мишеням. Средства доставки, которые используются сегодня, в том числе описанные выше наночастицы и липосомы, отличаются высокой токсичностью, слабой избирательностью и низкой эффективностью при проникновении в клетки. Именно из-за этого активно разрабатываются препараты siРНК наружного применения, главным образом для лечения заболеваний глаз и кожных болезней, при которых вопросы специфической доставки частично снимаются [74]. Что касается терапии онкологических заболеваний (гепатоцеллюлярной карциномы, множественной миеломы, неходжкинской лимфомы, мела-номы и некоторых других), то в настоящее время проходят клинические испытания несколько препаратов на основе siРНК [75]. Одно из новых направлений —
комбинация siРНК с тРНК. Если siРНК высокоизбирательны в отношении подавления синтеза определенного белка, то тРНК обычно регулируют экспрессию целого набора генов, включая нужный белок. Поэтому комбинация этих 2 видов РНК, как ожидается, может существенно усилить эффективность действия препарата.
Безусловно, основной прогресс в разработке препаратов miРНК и siРНК можно ожидать только при существенном совершенствовании средств доставки. С этой точки зрения наибольший интерес исследователей привлекают экзосомы как естественные средства доставки, постоянно циркулирующие в крови и свободно проникающие в клетки-мишени. К основным преимуществам экзосом относятся длительное сохранение в неповрежденном виде содержимого экзосом, способность легко инкорпорировать внутрь клеток-реципиентов, низкие иммуногенность и токсичность. Главный недостаток экзосом — отсутствие избирательности доставки, и сегодня усилия исследователей направлены именно на разработку модифицированных экзосом, несущих на своей мембране белки, узнающие клетки-мишени [75].
В заключение следует отметить, что, несмотря на специфичность действия малых РНК и их способность избирательно блокировать активность отдельных генов белков, нельзя ожидать, что такие препараты будут абсолютно эффективны в лечении онкологических заболеваний, даже если они будут успешно блокировать экспрессию ключевых онкобелков. Причина этого — быстро развивающаяся резистентность опухолей к препаратам, обусловленная реаранжировкой внутриклеточных сигнальных путей и стимуляцией тех из них, которые идут в обход заблокированных белков. Один из подходов к увеличению эффективности тар-гетных соединений — использование комбинации препаратов с разнонаправленным действием, блокирующих одновременно несколько сигнальных путей в клетке. Дальнейшие исследования малых РНК и разработка современных средств доставки должны привести к созданию новых противоопухолевых препаратов, которые будут отличаться большей эффективностью и продолжительностью действия.
Работа поддержана Российским научным фондом, проект № 14-15-00362 (раздел исследований экзосом) и Российским фондом фундаментальных исследований, проект № 16-04-00347.
CV
ев
и ш u
X ш
и
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
CV
со
es
и ш u
X ш
и
1. Fire A., Xu S., Montgomery M.K. et al. Potent and specific genetic interference
by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998;391(6669):806-11.
2. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 2000;404(6775):293-6.
3. Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A., Bartel D.P. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage
of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 2000;101(1):25-33.
4. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001;411(6836):494-8.
5. Carthew R.W., Sontheimer E.J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 2009;136(4):642-55.
6. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 2004;116(2):281-97.
7. Ohshima K., Inoue K., Fujiwara A. et al. Let-7 microRNA family is selectively secreted into the extracellular environment via exosomes in a metastatic gastric cancer cell line. PLoS One 2010;5(10):e13247.
8. Nykanen A., Haley B., Zamore P.D. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 2001;107(3):309-21.
9. Whitehead K.A., Langer R., Anderson D.G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov 2009;8(2):129-38.
10. Dominska M., Dykxhoorn D.M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. J Cell Sci 2010;123
(Pt 8):1183-9.
11. Davis M.E., Zuckerman J.E., Choi C.H. et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature 2010;464(7291):1067-70.
12. Burnett J.C., Rossi J.J., Tiemann K. Current progress of siRNA/shRNA therapeutics in clinical trials. Biotechnol J 2011;6(9):1130-46.
13. Oh Y.K., Park T.G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev 2009;61(10):850-62.
14. Alexis F., Pridgen E., Molnar L.K., Farokhzad O.C. Factors affecting
the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Mol Pharm 2008;5(4):505-15.
15. Layzer J.M., McCaffrey A.P., Tanner A.K. et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. RNA 2004;10(5):766-71.
16. Castanotto D., Rossi J.J. The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics. Nature 2009;457(7228):426-33.
17. Mosser D.M., Edwards J.P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol 2008;8(12):958-69.
18. Taylor R.C., Cullen S.P.,
Martin S.J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9(3):231-41.
19. van de Water F.M., Boerman O.C., Wouterse A.C. et al. Intravenously administered short interfering RNA accumulates in the kidney and selectively suppresses gene function in renal proximal tubules. Drug Metab Dispos 2006;34(8):1393-7.
20. Stoorvogel W., Strous G.J., Geuze H.J. et al. Late endosomes derive from early endosomes by maturation. Cell 1991;65(3):417-27.
21. Martina M.S., Nicolas V., Wilhelm C. et al. The in vitro kinetics of the interactions between PEG-ylated magnetic-fluid-loaded liposomes and macrophages. Biomaterials 2007;28(28):4143-53.
22. Ohkuma S., Poole B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH
in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci USA 1978;75(7):3327-31.
23. Nguyen K.T., Zhao Y. Engineered Hybrid Nanoparticles for On-Demand Diagnostics and Therapeutics. Acc Chem Res 2015; 48(12):3016-25.
24. Deleavey G.F., Damha M.J. Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing. Chem Biol 2012;19(8):937-54.
25. Yu B., Zhao X., Lee L.J., Lee R.J. Targeted delivery systems for oligonucleotide therapeutics. AAPS J 2009;11(1):195-203.
26. Xu C.-F., Wang J. Delivery systems for siRNA drug development in cancer therapy. Asian J Pharm Sci 2015;10(1):1-12.
27. Smyth T.J., Redzic J.S., Graner M.W., Anchordoquy T.J. Examination
of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochim Biophys Acta 2014;1838(11):2954-65.
28. Rappaport J., Hanss B., Kopp J.B. et al. Transport of phosphorothioate oligonucleotides in kidney: implications for molecular therapy. Kidney Int 1995;47(5):1462-9.
29. Pan Q., Ramakrishnaiah V., Henry S. et al. Hepatic cell-to-cell transmission of small silencing RNA can extend the therapeutic reach of RNA interference (RNAi).
Gut 2012;61(9):1330-9.
30. Rider M.A., Hurwitz S.N.,
Meckes D.G. Jr. ExtraPEG: a polyethylene glycol-based method for enrichment of extracellular vesicles. Sci Rep 2016;6:23978.
31. Love K.T., Mahon K.P., Levins C.G. et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proc Natl Acad Sci USA 2010;107(5):1864-9.
32. Lee H., Lytton-Jean A.K., Chen Y. et al. Molecularly self-assembled nucleic acid
nanoparticles for targeted in vivo siRNA delivery. Nat Nanotechnol 2012;7(6):389-93.
33. Akinc A., Querbes W., De S. et al. Targeted delivery of RNAi therapeutics with endogenous and exogenous ligand-based mechanisms. Mol Ther 2010;18(7):1357-64.
34. Haque M.E., Mcintosh T. J., Lentz B.R. Influence of lipid composition on physical properties and peg-mediated fusion of curved and uncurved model membrane vesicles "Nature's own" fusogenic lipid bilayer. Biochemistry 2001;40(14):4340-8.
35. Ohkuma S., Poole B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH
in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci USA 1978;75(7):3327-31.
36. Nguyen K.T., Zhao Y. Engineered hybrid nanoparticles for on-demand diagnostics and therapeutics. Acc Chem Res 2015;48(12):3016-25.
37. Salvati A., Pitek A.S., Monopoli M.P.
et al. Transferrin-functionalized nanoparticles lose their targeting capabilities when a biomolecule corona adsorbs on the surface. Nat Nanotechnol 2013;8(2):137-43.
38. Bolhassani A. Potential efficacy of cell-penetrating peptides for nucleic acid and drug delivery in cancer. Biochim Biophys Acta 2011;1816(2):232-46.
39. Campbell I.D., Humphries M.J. Integrin structure, activation, and interactions. Cold Spring Harb Perspect Biol 2011;3(3).
40. Semple S.C., Akinc A., Chen J. et al. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol 2010;28(2):172-6.
41. Batrakova E.V., Kabanov A.V. Pluronic block copolymers: evolution of drug delivery concept from inert nanocarriers to biological response modifiers. J Control Release 2008;130(2):98-106.
42. Ratajczak J., Miekus K., Kucia M. et al. Embryonic stem cell-derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors: evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery. Leukemia 2006;20(5): 847-56.
43. Baj-Krzyworzeka M., Szatanek R., Weglarczyk K. et al. Tumour-derived microvesicles carry several surface determinants and mRNA of tumour cells and transfer some of these determinants
to monocytes. Cancer Immunol Immunother 2006;55(7):808-18.
44. Deregibus M.C., Cantaluppi V., Calogero R. et al. Endothelial progenitor cell derived microvesicles activate
an angiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA. Blood 2007;110(7):2440-8.
45. Skog J., Wurdinger T., van Rijn S. et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology 2008;10(12):1470-6.
46. Valadi H., Ekstrom K., Bossios A. et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology 2007;9(6):654-9.
47. Yuan A., Farber E.L., Rapoport A.L. et al. Transfer of microRNAs by embryonic stem cell microvesicles. PLoS One 2009;4(3):e4722.
48. Collino F., Deregibus M.C., Bruno S.
et al. Microvesicles derived from adult human bone marrow and tissue specific mesenchymal stem cells shuttle selected pattern of miRNAs. PLoS One 2010;5(7):e11803.
49. Mittelbrunn M., Gutierrez-Vazquez C., Villarroya-Beltri C. et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun 2011;2:282.
50. Smyth T.J., Redzic J.S., Graner M.W., Anchordoquy T.J. Examination
of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochim Biophys Acta 2014;1838(11):2954-65.
51. Hemler M.E. Targeting of tetraspanin proteins — potential benefits and strategies. Nat Rev Drug Discov 2008;7(9):747-58.
52. Segura E., Nicco C., Lombard B. et al. ICAM-1 on exosomes from mature dendritic cells is critical for efficient naive T-cell priming. Blood 2005;106(1):216-23.
53. Kooijmans S.A., Stremersch S., Braeckmans K. et al. Electroporation-induced siRNA precipitation obscures the efficiency of siRNA loading into extracellular vesicles. J Control Release 2013;172(1):229-38.
54. Shtam T.A., Kovalev R.A., Varfolomeeva E.Y. et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Commun Signal 2013;11:88.
55. Andaloussi S.E., Lehto T., Mager I. et al. Design of a peptide-based vector, PepFect6, for efficient delivery of siRNA in cell culture and systemically in vivo. Nucleic Acids Res 2011;39(9):3972-87.
56. Munich S., Sobo-Vujanovic A., Buchser W.J. et al. Dendritic cell exosomes
directly kill tumor cells and activate natural killer cells via TNF superfamily ligands. Oncoimmunology 2012;1(7): 1074-83.
57. Mittelbrunn M., Gutierrez-Vazquez C., Villarroya-Beltri C. et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun 2011;2:282.
58. Alvarez-Erviti L., Seow Y., Yin H. et al. Delivery of siRNA to the mouse brain
by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol 2011;29(4):341-5.
59. Zhang Y., Liu D., Chen X. et al. Secreted monocytic miR-150 enhances targeted endothelial cell migration. Mol Cell 2010;39(1):133-44.
60. Akao Y., Iio A., Itoh T. et al. Microvesicle-mediated RNA molecule delivery system using monocytes/macrophages. Mol Ther 2011;19(2):395-99.
61. Ohno S., Takanashi M., Sudo K. et al. Systemically injected exosomes targeted to EGFR deliver antitumor microRNA to breast cancer cells. Mol Ther 2013;21(1):185-91.
62. Thery C., Boussac M., Veron P. et al. Proteomic analysis of dendritic cell-derived exosomes: a secreted subcellular compartment distinct from apoptotic vesicles. J Immunol 2001;166(12):7309-18.
63. Wubbolts R., Leckie R.S., Veenhuizen P.T. et al. Proteomic and biochemical analyses
of human B cell-derived exosomes. Potential implications for their function and multivesicular body formation. J Biol Chem 2003;278(13):10963-72.
64. Olson S.D., Kambal A., Pollock K. et al. Examination of mesenchymal stem cellmediated RNAi transfer to Huntington's disease affected neuronal cells for reduction of huntingtin. Mol Cell Neurosci 2012;49(3):271-81.
65. Pegtel D.M., Cosmopoulos K., Thorley-Lawson D.A. et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proc Natl Acad Sci USA 2010;107(14):6328-33.
66. Wang J.J., Wang Z.Y., Chen R. et al. Macrophage-secreted exosomes delivering miRNA-21 inhibitor can regulate BGC-823 cell proliferation. Asian Pac J Cancer Prev 2015;16(10):4203-9.
67. Wahlgren J., De L. Karlson T., Brisslert M. et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Res 2012;40(17):e130.
68. Shtam T.A., Kovalev R.A., Varfolomeeva E.Y. et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Commun Signal 2013;11:88.
69. Lunavat T. R., Jang S.C., Nilsson L. et al. RNAi delivery by exosome-mimetic nanovesicles — Implications for targeting c-Myc in cancer. Biomaterials 2016;102:231-8.
70. Zhang Y., Li L., Yu J. et al. Microvesicle-mediated delivery of transforming growth factor beta1 siRNA for the suppression
of tumor growth in mice. Biomaterials 2014;35(14):4390-400.
71. Greco K.A., Franzen C.A., Foreman K.E. et al. PLK-1 Silencing in bladder cancer
by siRNA delivered with exosomes. Urology 2016;91:241.
72. Momen-Heravi F., Bala S., Kodys K. et al. Exosomes derived from alcohol-treated hepatocytes horizontally transfer liver specific miRNA-122 and sensitize monocytes to LPS. Sci Rep 2015;5:9991.
73. Wang J.J., Wang Z.Y., Chen R. et al. Macrophage-secreted exosomes delivering miRNA-21 inhibitor can regulate BGC-823 cell proliferation. Asian Pac J Cancer Prev 2015;16(10):4203-9.
74. Zhuang X., Xiang X., Grizzle W. et al. Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region
to the brain. Mol Ther 2011;19(10):1769-79.
75. Ha D., Yang N., Nadithe V. Exosomes as therapeutic drug carriers and delivery vehicles across biological membranes: current perspectives and future challenges. Acta Pharm Sin B 2016;6(4):287-96.
cv
CS
и ш u
X ш
и
