CC BY
242
CV
CS
и ш U
X ш
и
Экзосомы и передача (эпи)генетической информации
опухолевыми клетками
Е.М. Чевкина, А.М. Щербаков, А.Ю. Журавская, С.Е. Семина, А.В. Комельков, М.А. Красильников
Научно-исследовательский институт канцерогенеза ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина»
Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Михаил Александрович Красильников krasilnikovm@main.crc.umos.ru
В обзоре рассматриваются современные представления об экзосомах — везикулах, образующихся внутри клеток и секретируемых в окружающую среду. Они формируются на плазматической мембране клеток и представляют собой сферические структуры, ограниченные своей мембраной и содержащие различные биомолекулы, включая нуклеиновые кислоты, белки, липиды и проч. Обнаруженные в последние годы свойства экзосом перемещаться между клетками, проходить в кровяное русло, достигая самых различных тканей, и в итоге проникать внутрь клеток-реципиентов обеспечили пристальное внимание исследователей к изучению их биологических функций. Установлено, что экзосомы, проникая в клетки-реципиенты, могут вызывать в них целый каскад изменений на геномном (за счет интеграции ДНК) и эпигеномном (за счет изменения экспрессии/содержания белков, микроРНК и проч.) уровнях. Безусловно, одним из самых интересных и значимых достижений в изучении экзосом явилось установление возможности горизонтальной передачи информации от клетки к клетке с их участием — факт, неоднократно продемонстрированный исследователями на разных моделях. В обзоре приводятся современные данные об основных характеристиках и свойствах экзосом; о роли экзосом в развитии злокачественных новообразований, в частности — об их участии в опухолевой трансформации, метастазировании, формировании лекарственной устойчивости. Заключительный раздел обзора посвящен одному из наиболее стремительно развивающихся направлений в этой области — использованию экзосом в клинической практике, в том числе для избирательной доставки противоопухолевых препаратов в опухоль.
Ключевые слова: экзосомы, злокачественные опухоли, микроРНК, опухолевая трансформация, метастазирование, лекарственная устойчивость, гормональная устойчивость, доставка лекарственных препаратов
DOI: 10.17 650/2313-805X-2015-2-3-8-20
Exosomes and transfer of (epi)genetic information by tumor cells
E.M. Tchevkina, A.M. Shcherbakov, A. Yu. Zhuravskaya, S.E. Semina, A. V. Komel'kov, M.A. Krasil'nikov
Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia;
24 Kashirskoe shosse, Moscow, 115478, Russia
In this review, we will introduce the current knowledge about exosomes — vesicles that are generated in the cells and released into the extracellular space. Exosomes are forming in the cell plasma membrane and represent the spherical shapes restricted by their membrane and contained the various biomolecules including nucleic acids, proteins, lipids etc. The intent interest to exosomes is based on their ability to horizontal transfer between the cells, to permeate into vascular system reaching the different tissues and to incorporate into the recipient cells. It was shown that exosome incorporation into the cells lead to remarkable changes in the recipient cells both in genomic level (via the integration of exosomal DNA into the host DNA) and in epigenomic level (via the modulation of the content and/or activity of the signaling proteins, microRNA etc.). Undoubtedly, one of the most interesting and perspective achievements in the exosome study is the demonstration of exosome ability to provide the horizontal transfer of the genetic information from cell to cell — the fact supported in the different studies with the various cell models. Here, we will discuss the recent data regarding the main characteristics and properties of exosomes, the role of exosomes in the tumo-rigenesis including neoplastic transformation, metastasis, multi-drug resistance. The final part of the review involves the most growing area in the exosome study — the possible usage of exosomes in the cancer treatment, in particular — as the specific drug delivery system.
Key words: exosomes, malignant tumors, microRNA, neoplastic transformation, metastasis, multi-drug resistance, hormonal resistance, drug delivery
Введение
Впервые термин «экзосомы» был использован в начале 80-х годов прошлого века для обозначения мембранных везикул, продуцируемых неопластическими клетками [1]. Довольно быстро такие образования были обнаружены для многих типов клеток, как нормальных, так и опухолевых [2], а в качестве основной
функции экзосом рассматривалось быстрое удаление из клеток некоторых белков, преимущественно мем-браносвязанных [3]. Однако вскоре обнаружилась принципиальная особенность экзосом: благодаря своей уникальной структуре, во многом напоминающей миниатюрную копию клетки (в первую очередь за счет плазматической мембраны (ПМ) — фрагмента кле-
точной мембраны, надежно изолирующей экзосомы от внешней среды), содержимое экзосом могло достаточно долго сохраняться в неповрежденном виде. При этом состав экзосом оказался довольно разнообразным и включал практически все классы биомолекул клеток: белки, ДНК, РНК, липиды, низкомолекулярные соединения [4]. А тот факт, что экзосомы могут перемещаться между клетками, проникать в кровяное русло и достигать самых различных тканей, заставил исследователей обратить пристальное внимание на их биологические функции.
Было установлено, что экзосомы могут легко абсорбироваться на поверхности клеток и в итоге проникать внутрь клеток-реципиентов. Собственно, все современные исследования экзосом можно условно разделить на 2 направления, так или иначе связанных с этой их способностью. Во-первых, это изучение состава экзосом и влияния определенных их компонентов на те или иные свойства клеток-реципиентов, начиная от скорости деления и до опухолевой трансформации. И во-вторых, исследование возможностей экзосом как биологического средства доставки лекарственных препаратов, к тому же имеющего некоторое сродство к опухолевым клеткам.
Безусловно, одним из самых интересных и значимых достижений в изучении экзосом явилось установление возможности горизонтальной передачи информации от клетки к клетке с их участием — факт, неоднократно продемонстрированный учеными на разных моделях. Исследования показали, что экзосомы могут транспортировать в клетки-реципиенты различные биомолекулы, в том числе белки, РНК, ДНК, вирусные частицы, вызывая целый каскад изменений в клетках на геномном (за счет интеграции ДНК)
и эпигеномном (за счет изменения экспрессии/содержания белков, микроРНК и проч.) уровнях [5]. И конечно, проблема злокачественных опухолей: какие экзосомы продуцируют опухолевые клетки, что за информация переносится этими экзосомами, могут ли они участвовать в опухолевой трансформации, влияют ли на метастазирование, распространение лекарственной устойчивости и проч.?
В настоящем обзоре представлены современные достижения в исследовании экзосом опухолевых клеток, обсуждаются новые представления о механизме опухолевой трансформации и прогрессии с участием экзосом, оцениваются перспективы применения эк-зосом в клинической практике.
Общие представления об экзосомах
Межклеточная коммуникация является необходимым условием функционирования многоклеточного организма и может осуществляться как непосредственно с помощью межклеточных контактов, так и посредством передачи секретируемых молекул с помощью экзоцитоза. В последние 2 десятилетия был обнаружен и стал активно изучаться третий механизм межклеточной коммуникации — передача молекул с помощью так называемых экстраклеточных везикул. Везикулы представляют собой покрытые мембранным бислоем сферические структуры, обогащенные различными биомолекулами, включая все известные на сегодняшний день типы РНК, различные белки и липиды [6]. Биофизически эти структуры соответствуют фрагментам цитоплазмы, окруженным липидным бислоем с наружными доменами трансмембранных белков, обращенными во внешнюю среду (рис. 1). Для определения таких структур за время, прошедшее с момен-
N
ев
и ш и
ж ш
и
CV
es
и ш U
ж ш
и
та их открытия, использовались различные термины: «микровезикулы», «эктосомы», «мембранные фрагменты», «микрочастицы», «секретируемые везикулы» и проч. [7—10]. Термин «экзосомы» изначально употреблялся для обозначения везикулярных частиц размером от 40 до 1000 нм (позднее — до 100 нм), секретируемых культивируемыми клетками [11]. Однако происхождение этих частиц оставалось неясным. Позднее классический путь образования экзосом с формированием мультивезикулярных эндосом (МВЭ) был показан на процессе дифференцировки ретикулоцитов [6, 12], а спустя еще 10 лет аналогичный процесс был обнаружен в дендритных клетках и В-лимфоцитах [13, 14]. В дальнейшем выброс экзосом был показан и для ряда других типов нормальных клеток, включая Т-клетки, тромбоциты, тучные клетки, нейроны, олигодендроциты, клетки эпителия кишечника [4, 15].
Секретируемые клетками микровезикулярные частицы делятся на 2 класса, различающихся по механизму секреции: 1) микровезикулы, «отпочковывающиеся» непосредственно от ПМ и обладающие в среднем более крупным размером (100—1000 нм), и 2) экзо-сомы, секретируемые из клеток посредством слияния с ПМ МВЭ (иногда объединяемых в одно понятие с поздними эндосомами), в составе которых находятся будущие экзосомы (называемые также интралюми-нальными везикулами (ИЛВ)). МВЭ, в свою очередь, являются результатом слияния ранних эндосом (а также везикулярных структур, отпочковывающихся от транс-Гольджи-сети). Таким образом, очевидно, что механизм секреции экзосом является результатом везикулярного транспорта и напрямую связан с эндоцитозом.
Вкратце, первичные эндосомальные структуры с эндоцитируемым содержимым, образующиеся на ПМ посредством клатрин-зависимого, клатрин-независи-мого, кавеолин-зависимого, а также других форм эн-доцитоза, транспортируются к ранним эндосомам [16] (согласно другим данным, все эти структуры считаются ранними эндосомами). Ранние эндосомы располагаются преимущественно на периферии клеток и часто обладают тубулярной структурой (как и везикулы, отпочковывающиеся от транс-Гольджи-сети). Поздние, или мультивезикулярные, эндосомы образуются из ранних, и в течение этого процесса происходит уменьшение рН, изменение состава белков и слияние с другими везикулами и эндосомами. Поздние эндо-сомы располагаются проксимально к ядру и обладают сферической формой. Некоторые специалисты выделяют этап формирования МВЭ из поздних эндосом, при этом основным отличием МВЭ считают способность образовывать собственные ИЛВ посредством инвагинации собственных мембранных участков и от-почковывания внутрь дочерних везикул [17]. Поздние эндосомы в дальнейшем либо сливаются с лизосома-ми, либо транспортируются к ПМ, где в результате слияния внешней мембраны МВЭ с ПМ происходит высвобождение экзосом во внеклеточную среду (рис. 2).
Клеточные белки. мРНК, микроРНК в цитоплазме
о -о
^ Экзосомы
Сформированные цитоплазматической мембраной везикулы
Рис. 2. Образование и созревание экзосом
Важно отметить, что многие типы клеток секрети-руют как экзосомы, так и микровезикулы. Это показано для тромбоцитов [18], эндотелиальных клеток [19], клеток рака молочной железы (РМЖ) [20] и др. Кроме того, существуют везикулы, соответствующие по размеру экзосомам, но образующиеся путем непосредственного отпочковывания от ПМ [21]. Более того, ряд работ указывают на то, что секретируемые экзосомы/ микровезикулы, полученные от опухолевых клеток как in vivo, так и in vitro, обладают сходными размером, морфологией (по данным электронной микроскопии), плотностью (при ультрацентрифугировании в градиенте сахарозы), а также демонстрируют наличие как общих эндосомальных маркеров, так и маркеров ПМ [22]. Большинство исследований указывают и на то, что четкое разделение этих 2 классов везикул не только мало осуществимо технически, но и не имеет практического смысла для понимания их функций и биологического значения, поскольку они совместно и одинаковым образом воздействуют на клетки-мишени.
На сегодняшний день уже понятно, что состав содержимого экзосом не является случайным и не соответствует составу белков ПМ клеток-продуцентов, но представляет собой «микрокарты», соответствующие накоплению определенных клеточных маркеров [23]. Как осуществляется сортинг белков и других компонентов внутрь экзосом — один из важнейших вопросов, пока не имеющий однозначного ответа.
Поскольку эти структуры имеют общее эндосо-мальное происхождение, то вне зависимости от типа
продуцирующих их клеток они содержат ряд белков, участвующих в формировании МВЭ, таких как комплекс ESCRT (endosomal sorting complex responsible for transport) (TSG101, Alix) [24]. Другими маркерами, служащими для идентификации экзосом, являются тетраспанины (CD63, CD81 и CD9), а также белки теплового шока (HSP60, HSP70 и HSP90) [25]. Есть и маркеры экзосом, секретируемых определенными типами клеток, например белки главного комплекса гистосовместимости MHC-I и -II в экзосомах, продуцируемых антигенпрезентирующими клетками, или интегрин CD41a в экзосомах, секретируемых тромбоцитами.
Экзосомы обнаружены в большинстве тканей и практически во всех биологических жидкостях, включая кровь, грудное молоко, слюну [26], цереброспинальную жидкость, сперму, мочу [27]. В число экзосомальных белков входят малые гуанозинтрифосфатазы (ГТФазы) семейства Rab, участвующие в формировании экзосом и слиянии их с другими мембранными структурами [28], аннексины I, II, V и VI, регулирующие динамику мембран-цитоскелетных взаимодействий, а также различные молекулы адгезии и цитоскелета [29].
Механизм взаимодействия экзосом с клетками-реципиентами до конца не ясен. Исследователи рассматривают несколько вариантов такого механизма, в том числе: 1) лиганд-рецепторные взаимодействия;
2) встраивание экзосомальной мембраны в клеточную;
3) фагоцитоз экзосом клетками-реципиентами [30]. Так, описано взаимодействие изолированных экзосом В-кле-ток с фолликулярными дендритными клетками [31], с CD8+ и CD4+ T-клетками, приводящее к заметному усилению иммунного ответа [32]. Показано, что экзо-сомы, полученные из инфицированных клеток, содержат патогенные антигены, модулирующие иммунный ответ. В частности, экзосомы эндотелиальных клеток, инфицированных цитомегаловирусом, способны индуцировать специфический иммунный ответ. Экзосомы инфицированных вирусом иммунодефицита человека 1-го типа макрофагов специфически связываются с T-клетками, что обеспечивает распространение инфекции и супрессию иммунного ответа [33].
Продемонстрировано участие экзосом в функционировании эпителиальных и нервных тканей. Так, экзосомы, секретируемые клетками эпителия кишечника, участвуют в регуляции противовоспалительных процессов [34]. Экзосомы эпителиальных клеток бронхов, содержащие повышенное количество цитокинов, в случае бронхиальной астмы обеспечивают распространение противовоспалительного эффекта по всем тканям дыхательной системы [35]. Нейроны, олиго-дендроглиальные клетки и микроглия секретируют везикулы, которые мигрируют к определенным клеткам-мишеням. Показано участие экзосом в формировании миелина, играющего ключевую роль в функционировании и выживании нейронов [36]. Продемонстрировано, что ряд патогенных белков, вызывающих наруше-
ния центральной нервной системы, такие как прионы, супероксиддисмутаза и а-синуклеин, обнаруживаются в составе экзосом и могут переноситься от клетки к клетке; наличие таких экзосом в плазме крови может использоваться в качестве маркера ранних стадий дегенеративных заболеваний [37]. Экзосомы, продуцируемые мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), участвуют в устранении повреждений и регенерации тканей [38].
Экзосомы опухолевых клеток
Исследования показали, что опухолевые клетки продуцируют экзосомы в значительно большем количестве, чем нормальные клетки. Продуцируемые клетками опухолей экзосомы обнаруживаются практически во всех биологических жидкостях организма, включая сыворотку крови, мочу, сперму, асцитные и плевральные жидкости. За счет наличия на своих мембранах адгезионных рецепторов и лигандов, специфичных для различных типов клеток и тканей, эк-зосомы «прицельно» взаимодействуют с определенными типами клеток, доставляя в последние биологические молекулы самого широкого спектра действия, в том числе факторы роста, цитокины, рецепторы, биоактивные липиды и различные виды РНК. Секреция экзосом показана для подавляющего большинства злокачественных опухолей и, по-видимому, является характерной чертой неопластической трансформации клеток.
Посредством переноса огромного количества информационных молекул экзосомы осуществляют важнейшие функции при формировании первичных опухолей и опухолевой прогрессии, включая реорганизацию микроокружения и стромальных клеток [39, 40], увеличение инвазивной способности клеток [41], усиление ангиогенеза и экспрессии клетками проангиоген-ных факторов [42], формирование множественной лекарственной устойчивости, активацию онкогенных и антиапоптотических сигнальных путей, а также избавление от проапоптотических факторов или доставку проапоптотических факторов к клеткам, задействованным в процессах противоопухолевого иммунитета [43] (рис. 3).
Огромный фактический материал накоплен в отношении роли экзосом в подавлении противоопухолевого иммунитета, включая угнетение функций Т-лим-фоцитов и натуральных киллеров ^К-клеток), а также подавление дифференцировки антигенпрезентирую-щих клеток. Кроме того, опухолевые экзосомы увеличивают количество и усиливают активность иммуно-супрессорных клеток, способствуют активному переносу различного рода вирусов, включая вирусы, ассоциированные с канцерогенезом. Ряд данных свидетельствуют о том, что опухолевые клетки посредством секреции экзосом избавляются от химиопрепаратов (в частности, доксорубицина), и этот процесс лежит в основе приобретения малигнизированными клетка-
CV
ев
и ш u
X ш
и
CV
es
и ш U
X ш
и
Распространение
—-А гипоксического ответа Перепрограммирование клеток
Регуляция кл еточной
адгезии ЭКЗОСОМЫ в опухоли и микроокружении
«Перенос» лекарственной
Перенос молекул от клетки к клетке Регуляция образования преметастатических ниш устойчивости
Рис. 3. Эффекты экзосом в опухолевой ткани и микроокружении опухоли
ми устойчивости к противоопухолевой терапии [44, 45]. Отдельный пул данных касается способности экзосом изменять важнейшие функции опухолевых клеток (пролиферации, дифференцировки, выживания и др.) с помощью эпигенетических механизмов регуляции транскрипции генов посредством переноса информационных и малых РНК [46]. Эти данные во многом объясняют и феномен генетической нестабильности, лежащий в основе селекции наиболее ма-лигнизированных клеток [47, 48]. Известно также, что экзосомы, секретируемые эмбриональными стволовыми клетками, способны эпигенетически перепрограммировать различные клетки-мишени [49]. Более того, имеются данные, указывающие на то, что экзосомы способны «передавать» клеткам-мишеням способность к метастазированию [50, 51].
Исследование состава переносимых экзосомами белков свидетельствует о том, что спектр этих белков неслучаен и напрямую зависит от типа продуцирующей их опухоли, что может быть использовано для определения маркеров конкретных заболеваний. Однако это требует дальнейших масштабных исследований.
Молекулярные механизмы, обеспечивающие различные этапы биогенеза и секреции экзосом, на сегодняшний день остаются малопонятными. Это касается формирования МВЭ, отбора содержимого ИЛВ, определения дальнейшей «судьбы» МВЭ (слияние с лизо-сомальным компартментом (для большинства из них) или транспорт к ПМ для последующей секреции экзосом), механизмов экзоцитоза и акцептирования экзосом клетками-мишенями (которое также может происходить как за счет непосредственного слияния мембран, так и посредством эндоцитоза) и других процессов. Известно, что формирование МВЭ зависит от убиквитин-связывающих белков. Механизмы сортировки белков включают различные виды их убикви-тинирования: моноубиквитинирование служит сигналом для эндоцитоза и включения в состав МВЭ, в то время как полиубиквитинирование является сигналом для деградации в протеасомах. Предполагается, что олигоубиквитинирование также может служить сортировочным сигналом для включения в МВЭ, что
может повышать эффективность отбора [52]. Комплексы ESCRT-0, -I, -II и -III при помощи VPS-27 (vacuolar protein sorting 27) распознают моноубикви-тинированные белки и обеспечивают их включение в МВЭ. Это происходит за счет привлечения белком VPS-27 комплексов ESCRT и TSG101, что приводит к активации белка AIP/Alix [53]. Этот мультибелковый комплекс инициирует сортинг белков и заключение их в отпочковывающиеся внутрь МВЭ везикулы [54].
Экзосомы и микроокружение опухоли
Как уже отмечалось, одной из главных функций экзосом и других микровезикул является обеспечение межклеточной коммуникации — как с соседними клетками, так и с клетками, находящимися на удаленном расстоянии. В частности, посредством экзосом клетки опухоли влияют на клеточное микроокружение, что приводит к «созреванию» опухолевой стромы и последующей стимуляции роста опухоли [55]. В состав стромы входят клетки различного типа: опухоль-ассо-циированные фибробласты (ОАФ), эндотелиальные клетки, перициты, макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки и МСК [56].
ОАФ представляют собой миофибробласты, которые образовались в результате дифференцировки клеток различного типа (резидентных фибробластов, эпителиальных и эндотелиальных клеток, перицитов, циркулирующих фиброцитов и МСК) [57], причем главным активатором данного процесса является TGF-pi [58]. Установлено, что экзосомы, продуцируемые клетками опухоли, содержащие TGF-P и р-гликан, запускают дифференцировку нормальных фибробла-стов в миофибробласты [59]. В дальнейшем мио-фибробласты стимулируют эпителиально-мезенхималь-ный переход опухолевых клеток, способствуют росту опухоли и клеточной инвазии и в целом формируют благоприятную среду для прогрессии опухоли [57].
Особую роль экзосом в формировании стромы доказывает и тот факт, что опухоли с дефицитом экзосом не способны к росту, связанному со стимуляцией микроокружением, в тестах in vivo [58]. Установлено, что предотвратить дифференцировку миофибробластов можно путем нокдауна малой ГТФазы Rab27 — одного из регуляторов секреции экзосом [58].
Под действием экзосом клеток опухоли миофи-бробласты также могут формироваться из МСК жировой ткани (adipose tissue derived mesenchymal stem cells). Обработка МСК опухолевыми экзосомами приводит к возникновению у них характеристик, типичных для опухоль-ассоциированных миофибробластов (в частности, к продукции a-актина гладкой мускулатуры), а также стимулирует экспрессию белков SDF-1, VEGF, CCL5 и TGF-P [60, 61]. Для экзосом клеток опухоли желудка показана способность индуцировать дифференцировку МСК пуповины [62].
Таким образом, можно говорить о процессе ре-моделирования стромы (качественном изменении со-
става стромы) под действием экзосом, продуцируемых клетками опухоли.
ОАФ также способны воздействовать на клетки опухоли посредством экзосом. Экзосомы, секретиру-емые ОАФ, участвуют в доставке таких биоактивных молекул, как HGF, IL-6, PDGF, простагландины, проте-азы и микроРНК [55, 63]. Показано, что ОАФ секрети-руют экзосомы, стимулирующие образование протрузий клетками РМЖ, а также подвижность и метастатическую активность этих клеток с участием сигнального пути Wnt-PCP (planar cell polarity) [64].
Интересным представляется тот факт, что стимулировать опухолевые клетки могут и микровезикулы тромбоцитов, не относящихся к клеткам микроокружения опухоли. Микровезикулы тромбоцитов переносят тромбоцитарный интегрин CD4, активируют ERK1/2 и серин-треониновые протеинкиназы, усиливают экспрессию MT1-MMP, MMP-9, VEGF, IL-8 и HGF и стимулируют пролиферацию и инвазию клеток [49].
Экзосомы, трансформация и туморогенез
Согласно ряду данных, экзосомы злокачественных клеток способны инициировать процесс опухолевой трансформации нормальных клеток. Это демонстрирует возможность клональной экспансии опухоли посредством перепрограммирования нормальных клеток при помощи экзосом. Так, экзосомы, продуцируемые клетками рака предстательной железы, стимулируют трансформацию стволовых клеток жировой ткани [65]. Процесс сопряжен с переносом экзосомами мРНК HRAS и KRAS, онкомикроРНК miR-125b, miR-130b и miR-155, малых ГТФаз. Экзосомы клеток РМЖ способны вызывать опухолевую трансформацию нормальных клеток эпителия, развивающуюся с участием пре-микроРНК (pre-miRNAs), ассоциированных с белками комплекса RISC (RNA-induced silencing complex) [66]. Кроме того, оказалось, что инъекция мышам экзосом, выделенных из сыворотки крови больных РМЖ, вместе с нетуморогенными эпителиальными клетками приводит к формированию у них опухолей [67].
Микровезикулы клеточных линий РМЖ и глио-бластомы способны формировать фенотип, характерный для трансформированных клеток, у фибробластов и клеток эпителия благодаря совместному действию тканевой трансаминазы и фибронектина [68]. При этом для поддержания трансформированного фенотипа клеткам-реципиентам необходимо постоянное присутствие микровезикул, секретируемых опухолевыми клетками.
Установлено, что экзосомы, секретируемые опухолевыми клетками, содержат онкогенные белки, ответственные за трансформацию клеток, — K-Ras, H-Ras и N-Ras, EGFR, киназы семейства Src и интегрины [69]. Примечательно, что в то же время в экзосомах обнаруживается опухолевый супрессор PTEN, сохра-
няющий свою функциональную активность и приводящий к снижению уровня фосфорилирования Akt [70].
Роль экзосом в формировании преметастатических ниш
Согласно общепринятой концепции, метастазиро-ванию опухолевых клеток предшествует образование так называемых преметастатических ниш, обеспечивающих формирование вторичного очага роста метастазов [71]. Оказалось, что экзосомы и микровезикулы способны изменять внеклеточный матрикс и доставлять онкогенные факторы во вторичные очаги опухолевого роста [51, 72, 73]. В частности, экзосомы, секретируемые клетками высокометастазирующих линий меланомы, усиливают рост и метастазирование первичной опухоли [73]. При этом экзосомы клеток ме-ланомы при внутривенном введении преимущественно распределяются в «сторожевые» лимфатические узлы, подготавливая условия для миграции и роста опухолевых клеток. Данный эффект опосредуется ре-цепторной тирозинкиназой MET, играющей важную роль в миграции, инвазии и ангиогенезе.
Экзосомальная микроРНК miR-105, секретируе-мая клетками опухоли, также играет важную роль на ранней стадии формирования преметастатических ниш. МикроРНК miR-105 разрушает васкулярно-эн-дотелиальный барьер и увеличивает проницаемость сосудов и капилляров легких, печени и головного мозга, позволяя клеткам первичной опухоли проникать в кровоток и колонизировать определенные дистальные органы [74]. В формировании стромы преметастатиче-ских ниш участвуют также экзосомальные микроРНК miR-494 и miR-542-3p, мишенью для которых служат лимфатические узлы и легочный эпителий [75]. На формирование преметастатических ниш влияют и экзо-сомы, секретируемые клетками опухолевой стромы и окружающей ткани [76, 77], поддерживая тем самым постоянно высокий уровень метастатической активности опухолевых клеток.
Отдельный интерес представляет исследование образования экзосом в условиях гипоксии — фактора, постоянно сопровождающего рост и прогрессию злокачественных опухолей. Гипоксия стимулирует «перестройку» ряда сигнальных путей в клетках опухоли и ее микроокружения [78, 79], которая ведет к появлению более агрессивного фенотипа злокачественных клеток и формированию устойчивости к радио-и химиотерапии. Экзосомы, являясь элементом межклеточной коммуникации, также участвуют в адаптации опухоли к гипоксическим условиям.
Вопрос, изменяются ли синтез экзосом клетками и содержимое экзосом при гипоксии, активно обсуждается в литературе последние 5 лет [80—86]. Хорошо известно, что программа клеточной реакции на гипоксию активируется через универсальный механизм — стабилизацию транскрипционных факторов HIF. Оказалось, что и продукция экзосом не является
CV
CS
и ш U
ж ш
и
CV
CS
и ш U
ж ш
и
исключением — снижение уровня кислорода до 1 % вызывает небольшое HIF-la-зависимое увеличение (в 1,3—1,4 раза) количества экзосом в культуральной среде от клеток РМЖ линий MCF-7 и MDA-MB-231. Более глубокая (до 0,1 % кислорода) гипоксия приводит к значительному накоплению экзосом в среде: их количество возрастает в 2 раза по сравнению с нор-моксией [87]. Используя химический стабилизатор HIF-1a (диметилоксалилглицин) и малые интерферирующие РНК HIF-1a, авторы доказали прямое участие HIF-1a в усилении продукции экзосом при гипоксии [87]. Так как экзосомы представляют собой фактор межклеточной коммуникации, их содержимое при гипоксии меняется и перестраивается вслед за изменениями внутриклеточных молекулярных путей. Показано, что в «гипоксических» экзосомах опухолевых клеток накапливается ряд специфических молекул; снижение уровня кислорода в опухоли ведет к увеличению содержания в экзосомах гипоксической микроРНК miR-210 [87], miR-135b [88], фермента, регулирующего дезаминирование (LOXL2) [85], кавео-лина-1 (CAV-1) [81], тромбопластина (TF) [86], тетра-спанинов (CD63 и CD81), белков теплового шока (HSP90 и HSP70), аннексина II [82]. Интересный факт обнаружили недавно M. Aga и соавт. Оказалось, что основной регулятор ответа клетки на гипоксию, HIF- 1a, также переносится экзосомами, распространяя среди клеток «волну» ответа на кислородное голодание [89]. Список гипоксических молекул, переносимых экзосомами, активно пополняется в настоящее время. Экзосомы, содержащие такие молекулы, попадают в соседние клетки опухоли и микроокружения и дополнительно активируют в них сигнальные пути. В частности показано, что экзосомы, секретируемые опухолевыми клетками в состоянии гипоксии, стимулируют образование сосудов (неоангиогенез) [40, 90]. Помимо этого, совсем недавно доказана роль гипоксических эк-зосом в повышении инвазивности опухоли: экзосомы, секретированные в условиях гипоксии и перенесенные к клеткам в нормоксии, снижают в них экспрессию молекул межклеточной адгезии [82].
Дальнейшее исследование экзосом, продуцируемых опухолевыми клетками, поможет более точно установить особенности их влияния как на клетки самой опухоли, так и на процессы, происходящие в опухолевом микроокружении.
Экзосомы и лекарственная устойчивость опухолей
Как известно, одной из характерных особенностей опухолевых клеток является способность быстро адаптироваться к окружающим условиям, в том числе и к токсическому действию внешних факторов, будь то гипоксия, облучение, цитотоксические препараты и др. Столь эффективная адаптация опухолевых клеток, приводящая в итоге к развитию лекарственной, гормональной, радио- и других вариантов резистент-
ности опухолей, основана как на действии специфических систем защиты — репарации ДНК, выведения ксенобиотиков (АВС-транспортеры), функционирующих на фоне угнетенного апоптоза, так и на способности к быстрой перестройке внутриклеточных сигнальных путей в тех случаях, когда активность отдельных сигнальных молекул заблокирована в результате действия специфических цитотоксических препаратов.
Исследования последних лет показали, что в развитии практически любого варианта резистентности опухолей могут принимать участие экзосомы, выступающие в роли переносчиков биомолекул от клетки к клетке. Речь идет о горизонтальном пути распространения резистентности, когда экзосомы, продуцируемые резистентными клетками, достигают клеток-реципиентов, модулируя у них соответствующие изменения лекарственной или другой устойчивости. Принципиальная возможность горизонтального пути развития лекарственной резистентности продемонстрирована в экспериментах по ко-культивированию чувствительных и резистентных клеток: так, на примере клеток РМЖ показано, что ко-культивирования чувствительных и доксорубицин-устойчивых клеток в течение 6 сут достаточно для того, чтобы чувствительные клетки приобрели относительно высокий уровень лекарственной устойчивости [91]. Обнаружено, что экзосомы принимают участие в распространении такой резистентности в первую очередь благодаря их способности инкапсулировать собственно АВС-транс-портеры, в частности Р-гликопротеин, кодируемый геном множественной лекарственной устойчивости MDR1, и переносить их в клетки-реципиенты. Подобный эффект был убедительно продемонстрирован в экспериментах на линиях клеток РМЖ и рака предстательной железы: оказалось, что экзосомы, полученные от опухолевых клеток с высоким уровнем лекарственной устойчивости, отличаются высоким содержанием Р-гликопротеина, который они могут транспортировать в клетки-реципиенты [91, 92]. Но не только АВС-транспортеры являются объектами экзосомального трафика белков. Среди соединений, находящихся в составе опухолевых экзосом, были идентифицированы белки различных сигнальных каскадов, в том числе и тирозинкиназные рецепторы ростовых факторов. Оказалось, что продукция опухолевыми клетками экзосом, содержащих, в частности, HER-2/neu, оказывается достаточной для блокирования действия трастузумаба — таргетного препарата на основе моноклональных антител к HER-2/neu. В этом случае экзосомы, несущие на своей поверхности HER-2/neu, непосредственно связывают трастузумаб, снижая его эффективную концентрацию и предотвращая его взаимодействие с опухолевыми клетками [93].
Следует отметить, что состав белков экзосом необычайно разнообразен, причем экзосомы, продуцируемые опухолевыми клетками, отличает высокое содержание
белков, в той или иной степени ассоциированных с опухолевым ростом. Анализ протеома экзосом опухолевых клеток выявил присутствие в них ключевых сигнальных белков, в частности белков семейств Ras, Src, MAPK и проч. [94—96]. Проникновение таких белков в клетки-реципиенты стимулирует соответствующие сигнальные каскады, в том числе антиапоп-тотические, приводя тем самым к повышению общего уровня лекарственной устойчивости клеток.
Другой путь, горизонтального (от клетки к клетке) распространения лекарственной резистентности основан на передаче специфических микроРНК с участием экзосом. Сегодня микроРНК рассматриваются в качестве универсальных регуляторов экспрессии генов, не менее значимых, чем классические транскрипционные факторы, и неудивительно, что микроРНК достаточно быстро попали в сферу интересов исследователей экзосом. Оказалось, что микроРНК необычайно широко представлены в экзосомах — по разным данным, в их составе обнаруживается не менее 600 видов микроРНК [97, 98]. Среди них удалось идентифицировать микроРНК, ассоциированные с развитием лекарственной устойчивости и обнаруживаемые в экзо-сомах резистентных клеток. Так, в экзосомах резистентных клеток РМЖ существенно возрастает содержание микроРНК miR-100, miR-222 и miR-30a; продемонстрировано, что такие экзосомы успешно переносят микроРНК в клетки-реципиенты [98]. Вопрос о механизме развития лекарственной устойчивости под действием микроРНК остается во многом открытым. Известные сегодня немногочисленные работы на эту тему отводят центральную роль изменениям ключевых сигнальных каскадов под действием микроРНК, в том числе ответственных за регуляцию пролиферации (МАРК-сигналинг, циклинзависимая регуляция, PTEN и проч.) [98].
Сравнительно недавно продемонстрировано, что не только лекарственная, но и гормональная резистентность опухолей, в первую очередь — опухолей молочной железы, может распространяться горизонтальным путем с участием экзосомальной микроРНК. Исследователи анализировали трансфер miR-221/222, участие которых в развитии резистентности к тамоксифену достоверно установлено, в том числе показана их способность подавлять экспрессию рецептора эстрогенов [99]. Обнаружено, что тамоксифен-резистентные клетки РМЖ продуцируют экзосомы с повышенным содержанием miR-221/222, продемонстрирована способность таких экзосом проникать внутрь клеток-реципиентов и приводить к снижению гормональной зависимости этих клеток [100]. В наших экспериментах показано, что ко-культивирование чувствительных и резистентных к тамоксифену клеток РМЖ приводит к развитию устойчивости в чувствительных клетках, продемонстрировано участие в этом процессе экзо-сом, продуцируемых резистентными клетками. Примечательно, что вызванная подобным образом рези-
стентность сохраняется длительное время и после разъединения клеточных культур [101].
В целом, суммируя приведенные данные, можно заключить, что межклеточные взаимодействия, в том числе реализуемые с участием экзосом, могут играть решающую роль в развитии, а главное — в распространении резистентности по всей массе опухоли, во многом определяя столь быструю адаптацию злокачественных опухолей к действию цитотоксических факторов.
Экзосомы: от эксперимента к клинической практике
Развитие современных методов поиска лекарственных средств позволило за последние годы достичь определенных успехов в формировании арсенала противоопухолевых препаратов. С одной стороны, широкомасштабный скрининг химических библиотек предоставляет ряд перспективных молекул-кандидатов для доклинических исследований. С другой — применение в клинике практически всех разрабатываемых препаратов обнаруживает существенные проблемы, снижающие эффективность терапии. Общая и орга-носпецифическая токсичность, короткое время жизни молекул-кандидатов, развитие резистентности, острые психогенные реакции и лекарственная (медикаментозная) аллергия часто являются причиной неудачи в доклинических исследованиях в онкологии [102— 104]. Одним из способов преодоления таких трудностей, как полагают, является разработка нетоксичных средств лекарственной доставки. Какими же свойствами должно обладать «идеальное» средство доставки препарата? Это прежде всего низкая токсичность, большее время жизни в организме, чем у переносимой молекулы, и достаточная иммунологическая совместимость с пациентом. Биологические свойства экзосом, описанные выше, делают их вполне востребованными для исследования и разработки новых средств доставки противоопухолевых препаратов. Стоит подчеркнуть, что важными конкурентными преимуществами экзосом для клинической практики являются их аутологичность (происхождение от пациента, получающего лечение) и возможность ex vivo манипуляций с экзосомами больного [105]. В частности, ауто-логичность экзосом позволит в будущем преодолеть ряд побочных эффектов, возникающих при использовании в терапии липосом (синтетических везикул) [106].
Существует 3 основных метода «упаковки» лекарственных средств в экзосомы человека [105, 107, 108]. Первый способ основан на культивировании in vitro клеток пациента (например, полученных из асцита) в целях наработки нативных экзосом. Выделенные таким методом экзосомы затем инкубируют с препаратом для его проникновения внутрь и «загрузки». Для пассивного проникновения препарата в экзосомы необходимо, чтобы он обладал липофильными свойствами. Второй метод заключается в инкубации препарата непосредственно с клетками пациента ex vivo. Клетки, обработанные лекарственным средством, на-
cv
es
и ш u
X ш
и
CV
CS
и ш U
ж ш
и
чинают «запаковывать» его в экзосомы и секретиро-вать в культуральную среду. Среду собирают и выделяют из нее экзосомы, содержащие лекарственное средство. Третий метод состоит в трансфекции клеток пациента in vitro и позволяет включить в экзосомы необходимые последовательности ДНК, РНК и синтезированные белки [109, 110]. Использование описанных методов не нарушает аутологичности экзосом, что в будущем будет способствовать созданию лекарственных средств, не вызывающих аллергических и острых токсических реакций у пациента [105, 110].
Возможность проникновения (инкорпорирования, «загрузки») противоопухолевых средств в экзосомы продемонстрирована для нескольких классов химических соединений [105, 111]. К сожалению, даже для липофильных молекул, обладающих большим сродством к мембране экзосом, наблюдается не очень высокая степень инкорпорирования. Эффективность заполнения экзосом препаратом можно повысить с помощью различных методов: при дополнительном использовании электропорации доксорубицин проникает приблизительно в 20 % экзосом дендритных клеток [111]. Наиболее эффективным способом «упаковки» доксорубицина оказалась обработка клеток линии MCF-7 препаратом в условиях гипертермии (42 °С) в течение 1 ч [112]. Известно, что применение еще одного противоопухолевого средства, паклитаксела, ограничено высокой частотой реакций повышенной чувствительности к препарату. Инкорпорирование паклитаксела в средства доставки, в частности в экзосомы, может снизить частоту таких реакций. Обнаружено, что мезенхимальные клетки, культивируемые in vitro, способны интегрировать паклитаксел в экзо-сомы [113, 114]. Паклитаксел в экзосомах, выделенных мезенхимальными клетками, продемонстрировал высокую токсичность на клеточной линии рака поджелудочной железы человека CFPAC-1.
Некоторые противовоспалительные средства также поддаются введению в экзосомы, например курку-мин. Куркумин (полифенол природного происхождения) обладает не только противовоспалительным, но и про-апоптотическим, противоокислительным, противо-амилоидным и даже антидепрессивным действием. В работе D. Sun и соавт. продемонстрировано проникновение куркумина в экзосомы при комнатной температуре. Куркумин, интегрированный в экзосомы, обладает улучшенными фармакологическими характеристиками: повышаются его биологическая доступность и растворимость, увеличивается стабильность препарата [115]. В перспективе такие экзосомы с кур-кумином могут быть использованы в сопровождающей терапии в онкологии.
В целом разработка новых средств доставки противоопухолевых препаратов в экзосомах пока находится в доклинической стадии. Только отдельные проекты переходят к I фазе клинических исследований. Более интенсивно развивается другое «экзосомное»
направление в онкологии — иммунотерапия. Первые эксперименты с экзосомами из асцита пациентов оказались достаточно успешными, и результаты I фазы исследования применения экзосом из асцита в комбинации с GM-CSF в иммунотерапии у больных раком толстой кишки были опубликованы в 2008 г. Продемонстрирована безопасность такой терапии, а также выявлено увеличение специфического иммунного противоопухолевого ответа у больных [116]. В другом исследовании B. Escudier и соавт. [117] провели вакцинирование 15 больных метастатической меланомой экзосомами из аутологичных дендритных клеток. Авторами продемонстрирована возможность дополнительной загрузки пептидов (MHC) в экзосомы для усиления специфического противоопухолевого ответа. Иммунотерапия экзосомами показывает хорошую переносимость и низкую частоту побочных эффектов.
Несмотря на то, что исследования экзосом в лабораториях ведутся с середины 1980-х годов, до клинической стадии доходит очень небольшое число проектов. Поиск по базе ClinicalTrials.gov в сентябре 2015 г. выявил всего 15 исследований по запросу "exosomes and cancer". В исследовании NCT02507583 оценивается возможность иммунизации больных глиомой с помощью экзосом, секретируемых гибнущими опухолевыми клетками. Клетки, полученные при хирургическом вмешательстве, обрабатывают специфической олигонуклеотидной последовательностью IGF-1R/ AS ODN, затем помещают в капсулу и имплантируют больному. IGF-1R/AS ODN вызывает снижение экспрессии рецепторов IGF-1, что ведет к запуску апоптоза в опухолевых клетках. При гибели клетки продолжают секретировать экзосомы, содержащие опухолевые антигены. Экзосомы и апоптозные тельца (мембранные везикулы, образующиеся при апоптозе) постепенно попадают из капсулы-имплантата в организм больного и усиливают противоопухолевый иммунный ответ.
В настоящее время рассматривается возможность использования не только аутологичных экзосом как средства доставки препаратов, но и экзосом растительного происхождения. Ранее была показана достаточно высокая эффективность уже упомянутого выше фитоэстрогена куркумина при раке толстой кишки [118, 119]. Однако эффективность этого препарата ограничена низкой биодоступностью: даже прием высоких доз (8—12 г в день) не приводил к достаточному накоплению куркумина в тканях [118, 120]. В исследовании I фазы NCT01294072 (проводится в James Graham Brown Cancer Center) оценивается увеличение биодоступности куркумина с помощью создания конъюгатов препарата с растительными экзосомами. Будет проведено сравнение 3 групп больных раком толстой кишки: в 1-ю войдут пациенты, получающие куркумин, во 2-ю — конъюгат куркумина и растительных экзосом, а в 3-ю — больные, не получающие препараты (контрольная группа). Авторы исследования
ожидают, что применение созданных таблетирован-ных форм конъюгатов куркумина с экзосомами позволит повысить концентрацию препарата в тканях. В декабре 2015 г. станут известны первые результаты этого исследования. Растительные экзосомы находят применение в онкологии не только как средства доставки, но и как препараты для проведения сопровождающей терапии. В исследовании NCT01668849 рассматривается возможность использования экзосом, выделенных из винограда, для снижения побочных эффектов комбинированной радио- и химиотерапии при опухолях головы и шеи.
В целом применение экзосом в доклинической и клинической онкологии развивается в 4 направлениях (рис. 4). Наиболее успешным можно считать иммунотерапию — в этой области завершены несколько клинических исследований I фазы, получены достоверные сведения об увеличении иммунного ответа при вакцинации экзосомами [116, 117, 121]. Доставке таргетных препаратов с помощью экзосом также уделяется много внимания, однако большинство проектов пока не дошло до стадии клинических исследований. Одна из причин такой ситуации — не очень высокая эффективность «загрузки» лекарственных средств в экзосомы. Постепенно приобретают популярность исследования экзосом в качестве средств доставки в опухоль специфических нуклеиновых кислот (малых интерферирующих РНК, микроРНК).
Доставка средств таргетной терапии в орган-мишень
Иммунотерапия
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ
ЭКЗОСОМ В ОНКОЛОГИИ
Доставка интерферирующих РНК в опухоль
Диагностические системы
Рис. 4. Перспективы применения экзосом в клинической практике
Кроме того, отдельно стоит упомянуть возможность диагностических процедур с анализом экзосом онкологического больного, а также прогностического мо-ниторирования. С одной стороны, накапливаются сведения о корреляциях белкового/ДНК/РНК-профиля экзосом (например, из асцита) и опухолевых клеток. С другой, пока нет четкого представления о том, какой выигрыш даст профилирование экзосом для клинико-лабораторных исследований [122]. Таким образом, исследования экзосом открывают ряд новых и уникальных возможностей в онкологии, и дальнейшие шаги помогут внедрить некоторые из экспериментальных разработок в клиническую практику.
CV
CS
и ш U
Работы авторов по тематике обзора поддержаны Российским научным фондом (проект № 14-15-00362) и Российским фондом фундаментальных исследований (проекты № 14-04-31119 (раздел об исследованиях в гипоксии) и № 14-04-01706).
х ш
и
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Trams E.G., Lauter C.J., Salem N. Jr, Heine U. Exfoliation of membrane ecto-enzymes in the form of micro-vesicles. Biochim Biophys Acta 1981;645(1):63-70.
2. Keller S., Sanderson M.P., Stoeck A., Altevogt P. Exosomes: from biogenesis and secretion to biological function. Immunol Lett 2006;107(2):102-8.
3. Harding C., Heuser J., Stahl P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. J Cell Biol 1983;97(2):329-39.
4. Simons M., Raposo G. Exosomes — vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol 2009;21(4):575-81.
5. Ogorevc E., Kralj-Iglic V., Veranic P. The role of extracellular vesicles in pheno-typic cancer transformation. Radiol Oncol 2013;47(3):197-205.
6. Bellingham S.A., Guo B.B.,
Coleman B.M., Hill A.F. Exosomes: vehicles for the transfer of toxic proteins associated
with neurodegenerative diseases? Front Physiol 2012;3:124.
7. Holme P.A., Solum N.O., Brosstad F. et al. Demonstration of platelet-derived microvesicles in blood from patients with activated coagulation and fibrinolysis using
a filtration technique and western blotting. Thromb Haemost 1994;72(5):666-71.
8. Hess C., Sadallah S., Hefti A. et al. Ectosomes released by human neutrophils are specialized functional units. J Immunol 1999;163(8):4564-73.
9. Cocucci E., Racchetti G., Meldolesi J. Shedding microvesicles: artefacts no more. Trends Cell Biol 2009;19(2):43-51.
10. Gyorgy B., Szab T.G., Pasztoi M. et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci 2011;68(16):2667-88.
11. Harding C., Heuser J., Stahl P. Endocytosis and intracellular processing of transferrin and colloidal gold-transferrin in rat reticulocytes: demonstration
of a pathway for receptor shedding. Eur J Cell Biol 1984;35(2):256-63.
12. Pan B.T., Teng K., Wu C. et al. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. J Cell Biol 1985;101(3):942-8.
13. Zitvogel L., Regnault A., Lozier A. et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nat Med 1998;4(5):594-600.
14. Raposo G., Nijman H.W., Stoorvogel W. et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. J Exp Med 1996;183(3):1161-72.
15. Thery C., Ostrowski M., Segura E. Membrane vesicles as conveyors
of immune responses. Nat Rev Immunol 2009;9(8):581-93.
16. Piper R.C., Katzmann D.J. Biogenesis and function of multivesicular bodies. Annu Rev Cell Dev Biol 2007;23:519-47.
17. Taylor D.D., Gercel-Taylor C. Exosomes/ microvesicles: mediators of cancer-associated
CV
CS
и ш U
ж ш
и
immunosuppressive microenvironments. Semin Immunopathol 2011;33(5):441—54.
18. Heijnen H.F., Schiel A.E., Fijnheer R. et al. Activated platelets release two types of membrane vesicles: microvesicles by surface shedding and exosomes derived from exocytosis of multivesicular bodies and alpha-granules. Blood 1999;94(11):3791—9.
19. Deregibus M.C., Cantaluppi V., Calogero R. et al. Endothelial progenitor cell derived microvesicles activate an angiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA. Blood 2007;110(7):2440-8.
20. Muralidharan-Chari V., Clancy J., Plou C. et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Curr Biol 2009;19(22):1875-85.
21. Booth A.M., Fang Y., Fallon J.K. et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol 2006;172(6):923-35.
22. Kesimer M., Scull M., Brighton B. et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. FASEB J 2009;23(6):1858-68.
23. Mathivanan S., Ji H., Simpson R.J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J Proteomics 2010;73(10):1907-20.
24. Mathivanan S., Lim J.W., Tauro B.J. et al. Proteomics analysis of A33 immuno-affinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics 2010;9(2):197-208.
25. Graner M.W., Alzate O., Dechkovskaia A.M. et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J 2009;23(5):1541-57.
26. Lasser C., Alikhani V.S., Ekström K. et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J Transl Med 2011;9:9.
27. Street J.M., Barran P.E., Mackay C.L. et al. Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. J Transl Med 2012;10:5.
28. Pfeffer S.R. Two Rabs for exosome release. Nat Cell Biol 2010;12(1):3-4.
29. Choi D.S., Kim D.K., Kim Y.K., Gho Y.S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes. Proteomics 2013;13(10-11):1554-71.
30. Thery C., Zitvogel L., Amigorena S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol 2002;2(8):569-79.
31. Denzer K., van Eijk M., Kleijmeer M.J. et al. Follicular dendritic cells carry MHC class II-expressing microvesicles at their surface. J Immunol 2000;165(3):1259-65.
32. Robbins P.D., Morelli A.E. Regulation of immune responses by extracellular vesicles. Nat Rev Immunol 2014;14(3):195-208.
33. Garrus J.E., von Schwedler U.K., Pornillos O.W. et al. Tsg101 and the vacuolar protein sorting pathway are essential
for HIV-1 budding. Cell 2001;107(1):55-65.
34. van Niel G., Raposo G., Candalh C. et al. Intestinal epithelial cells secrete exosome-like vesicles. Gastroenterology 2001;121(2):337-49.
35. Prado N., Marazuela E.G., Segura E. et al. Exosomes from bronchoalveolar fluid of tolerized mice prevent allergic reaction. J Immunol 2008;181(2):1519-25.
36. Bakhti M., Winter C., Simons M. Inhibition of myelin membrane sheath formation by oligodendrocyte-derived exosome-like vesicles. J Biol Chem 2011;286(1):787-96.
37. Kujala P., Raymond C.R., Romeijn M. et al. Prion uptake in the gut: identification of the first uptake and replication sites. PLoS Pathog 2011;7(12):e1002449.
38. Lee R.H., Pulin A.A., Seo M.J. et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell 2009;5(1):54-63.
39. Marhaba R., Klingbeil P., Nuebel T. et al. CD44 and EpCAM: cancer-initiating cell markers. Curr Mol Med 2008;8(8):784-804.
40. Park J.E., Tan H.S., Datta A. et al. Hypoxic tumor cell modulates its microenvironment to enhance angiogenic and metastatic potential by secretion of proteins and exosomes. Mol Cell Proteomics 2010;9(6):1085-99.
41. Graves L.E., Ariztia E.V., Navari J. R.
et al. Proinvasive properties of ovarian cancer ascites-derived membrane vesicles. Cancer Res 2004;64(19):7045-9.
42. Al-Nedawi K., Meehan B., Kerbel R.S. et al. Endothelial expression of autocrine VEGF upon the uptake of tumor-derived microvesicles containing oncogenic EGFR. Proc Natl Acad Sci USA 2009;106(10):3794-9.
43. Ichim T.E., Zhong Z., Kaushal S. et al. Exosomes as a tumor immune escape mechanism: possible therapeutic implications. J Transl Med 2008;6:37.
44. Safaei R., Larson B.J., Cheng T.C. et al. Abnormal lysosomal trafficking and enhanced exosomal export of cisplatin in drug-resistant human ovarian carcinoma cells. Mol Cancer Ther 2005;4(10):1595-604.
45. Shedden K., Xie X.T., Chandaroy P. et al. Expulsion of small molecules in vesicles shed by cancer cells: association with gene expression and chemosensitivity profiles. Cancer Res 2003;63(15):4331-7.
46. Skog, J., Würdinger T., van Rijn S. et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol 2008;10(12):1470-6.
47. Viswanathan M., Sangiliyandi G., Vinod S.S. et al. Genomic instability and tumor-specific alterations in oral squamous cell carcinomas assessed by inter-(simple sequence repeat) PCR. Clin Cancer Res 2003;9(3):1057-62.
48. Camussi G., Deregibus M.C.,
Tetta C. Paracrine/endocrine mechanism of stem cells on kidney repair: role
of microvesicle-mediated transfer of genetic information. Curr Opin Nephrol Hypertens 2010;19(1):7-12.
49. Janowska-Wieczorek A., Wysoczynski M., Kijowski J. et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. Int J Cancer 2005;113(5):752-60.
50. Hao S., Ye Z., Li F. et al. Epigenetic transfer of metastatic activity by uptake of highly metastatic B16 melanoma cell-released exosomes. Exp Oncol 2006;28(2):126-31.
51. Jung T., Castellana D., Klingbeil P. et al. CD44v6 dependence of premetastatic niche preparation by exosomes. Neoplasia 2009;11(10):1093-105.
52. Qu J.L., Qu X.J., Qu J.L. et al. The role of cbl family of ubiquitin ligases in gastric cancer exosome-induced apoptosis of Jurkat T cells. Acta Oncol 2009;48(8):1173-80.
53. Wollert T., Hurley J.H. Molecular mechanism of multivesicular body biogenesis by ESCRT complexes. Nature 2010;464(7290):864-9.
54. Katzmann D.J., Stefan C.J., Babst M., Emr S.D. Vps27 recruits ESCRT machinery to endosomes during MVB sorting. J Cell Biol 2003;162(3):413-23.
55. Roma-Rodrigues C., Fernandes A.R., Baptista P.V. Exosome in tumour microenvironment: overview of the crosstalk between normal and cancer cells. Biomed Res Int 2014;2014:179486.
56. van Zijl F., Krupitza G., Mikulits W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res 2011;728(1-2):23-34.
57. Otranto M., Sarrazy V., Bonté F. et al. The role of the myofibroblast in tumor stroma remodeling. Cell Adh Migr 2012;6(3):203-19.
58. Webber J.P., Spary L.K., Sanders A.J. et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene 2015;34(3):290-302.
59. Webber J., Steadman R., Mason M.D. et al. Cancer exosomes trigger fibroblast
to myofibroblast differentiation. Cancer Res 2010;70(23):9621-30.
60. Cho J.A., Park H., Lim E.H. et al. Exosomes from ovarian cancer cells induce adipose tissue-derived mesenchymal stem cells to acquire the physical and functional characteristics of tumor-supporting myofibroblasts. Gynecol Oncol 2011;123(2):379-86.
61. Cho J.A., Park H., Lim E.H.,
Lee K.W. Exosomes from breast cancer cells can convert adipose tissue-derived mesenchymal stem cells into myofibroblast-like cells. Int J Oncol 2012;40(1):130-8.
62. Gu J., Qian H., Shen L. et al. Gastric cancer exosomes trigger differentiation
of umbilical cord derived mesenchymal stem cells to carcinoma-associated fibroblasts through TGF-ß/Smad pathway. PLoS One 2012;7(12):e52465.
63. Thuma F., Zoller M. Outsmart tumor exosomes to steal the cancer initiating cell its niche. Semin Cancer Biol 2014;28: 39-50.
64. Luga V., Wrana J.L. Tumor-stroma interaction: Revealing fibroblast-secreted exosomes as potent regulators of Wnt-planar cell polarity signaling in cancer metastasis. Cancer Res 2013;73(23):6843-7.
65. Abd Elmageed Z.Y., Yang Y., Thomas R. et al. Neoplastic reprogramming of patient-derived adipose stem cells by prostate cancer cell-associated exosomes. Stem Cells 2014;32(4):983-97.
66. Melo S.A., Sugimoto H., O,Connell J.T. et al. Cancer exosomes perform cell-independent microRNA biogenesis and promote tumorigenesis. Cancer Cell 2014;26(5):707-21.
67. Zhang X., Yuan X., Shi H. et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. J Hematol Oncol 2015;8:83.
68. Antonyak M.A., Li B., Boroughs L.K. et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(12):4852-7.
69. Ji H., Greening D.W., Barnes T.W. et al. Proteome profiling of exosomes derived from human primary and metastatic colorectal cancer cells reveal differential expression
of key metastatic factors and signal transduction components. Proteomics 2013;13(10-11):1672-86.
70. Putz U., Howitt J., Doan A. et al.
The tumor suppressor PTEN is exported in exosomes and has phosphatase activity in recipient cells. Sci Signal 2012;5(243):ra70.
71. Psaila B., Lyden D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer 2009;9(4):285-93.
72. Peinado H., Lavotshkin S., Lyden D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol 2011;21(2):139-46.
73. Peinado H., Aleckovic M., Lavotshkin S. et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med 2012;18(6):883-91.
74. Zhou W., Fong M.Y., Min Y. et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell 2014;25(4):501-15.
75. Rana S., Malinowska K.,
Zoller M. Exosomal tumor microRNA modulates premetastatic organ cells. Neoplasia 2013;15(3):281-95.
76. Luga V., Zhang L., Viloria-Petit A.M.
et al. Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration. Cell 2012;151(7):1542-56.
77. Ono M., Kosaka N., Tominaga N. et al. Exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells contain a microRNA that promotes
dormancy in metastatic breast cancer cells. Sci Signal 2014;7(332):ra63.
78. Schonenberger M.J., Kovacs W.J. Hypoxia signaling pathways: modulators
of oxygen-related organelles. Front Cell Dev Biol 2015;3:42.
79. Zimna A., Kurpisz M. Hypoxia-inducible factor-1 in physiological and pathophysio-logical angiogenesis: applications and therapies. Biomed Res Int 2015;2015:549412.
80. Yang Y., Yang X., Yang Y. et al. Exosomes: a promising factor involved in cancer hypoxic microenvironments. Curr Med Chem 2015. [Epub ahead of print].
81. Vered M., Lehtonen M., Hotakainen L. et al. Caveolin-1 accumulation in the tongue cancer tumor microenvironment is significantly associated with poor prognosis:
an in-vivo and in-vitro study. BMC Cancer 2015;15:25.
82. Ramteke A., Ting H., Agarwal C. et al. Exosomes secreted under hypoxia enhance invasiveness and stemness of prostate cancer cells by targeting adherens junction molecules. Mol Carcinog 2015;54(7):554-65.
83. Chiarini F., Lonetti A., Evangelisti C. et al. Advances in understanding the acute lymphoblastic leukemia bone marrow microenvironment: From biology
to therapeutic targeting. Biochim Biophys Acta 2015. [Epub ahead of print].
84. Belting M., Christianson H.C. Role of exosomes and microvesicles in hypoxia-associated tumour development and cardiovascular disease. J Intern Med 2015;278(3):251-63.
85. Yoon J.H., Kim J., Kim K.L. et al. Proteomic analysis of hypoxia-induced U373MG glioma secretome reveals novel hypoxia-dependent migration factors. Proteomics 2014;14(12):1494-502.
86. Svensson K.J., Kucharzewska P., Christianson H.C. et al. Hypoxia triggers
a proangiogenic pathway involving cancer cell microvesicles and PAR-2-mediated heparin-binding EGF signaling in endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(32):13147-52.
87. King H.W., Michael M.Z., Gleadle J.M. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer 2012;12:421.
88. Umezu T., Tadokoro H., Azuma K. et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood 2014;124(25):3748-57.
89. Aga M., Bentz G.L., Raffa S. et al. Exosomal HIF1a supports invasive potential of nasopharyngeal carcinoma-associated LMP1-positive exosomes. Oncogene 2014;33(37):4613-22.
90. Tadokoro H., Umezu T., Ohyashiki K. et al. Exosomes derived from hypoxic leukemia cells enhance tube formation inendothelial cells. J Biol Chem 2013;288(48):34343-51.
91. Pasquier J., Galas L., Boulangé-Lecomte C. et al. Different
modalities of intercellular membrane exchanges mediate cell-to-cell p-glycoprotein transfers in MCF-7 breast cancer cells. J Biol Chem 2012;287(10):7374-87.
92. Corcoran C., Rani S., O,Brien K. et al. Docetaxel-resistance in prostate cancer: evaluating associated phenotypic changes and potential for resistance transfer via exosomes. PLoS One 2012;7(12):e50999.
93. Ciravolo V., Huber V., Ghedini G.C. et al. Potential role of HER2-overexpressing exosomes in countering trastuzumab-based therapy. J Cell Physiol 2012;227(2):658-67.
94. Dutta S., Reamtong O., Panvongsa W. et al. Proteomics profiling of cholangio-carcinoma exosomes: A potential role
of oncogenic protein transferring in cancer progression. Biochim Biophys Acta 2015;1852(9):1989-99.
95. Keerthikumar S., Gangoda L., Liem M. et al. Proteogenomic analysis reveals exosomes are more oncogenic than ectosomes. Oncotarget 2015;6(17):15375-96.
96. Demory Beckler M., Higginbotham J.N., Franklin J.L. et al. Proteomic analysis of exosomes from mutant KRAS colon cancer cells identifies intercellular transfer of mutant KRAS. Mol Cell Proteomics 2013;12(2):343-55.
97. Villagrasa A., Âlvarez P.J., Osuna A. et al. Exosomes derived from breast cancer cells, small trojan horses? J Mammary Gland Biol Neoplasia 2014;19(3-4):303-13.
98. Chen W.X., Liu X.M., Lv M.M. et al. Exosomes from drug-resistant breast cancer cells transmit chemoresistance
by a horizontal transfer of microRNAs. PLoS One 2014;9(4):e95240.
99. Zhao J.J., Lin J., Yang H. et al. MicroRNA-221/222 negatively regulates estrogen receptor alpha and is associated with tamoxifen resistance in breast cancer. J Biol Chem 2008;283(45):31079-86.
100. Wei Y., Lai X., Yu S. et al. Exosomal miR-221/222 enhances tamoxifen resistance in recipient ER-positive breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 2014;147(2):423-31.
101. Семина С.Е., Багров Д.В., Красильников М.А. Межклеточные взаимодействия и развитие гормональной резистентности клеток рака молочной железы. Успехи молекулярной онкологии 2015;2(2):50-5. [Semina S.E., Bagrov D.V., Krasü'nikov M.A. Intercellular interactions and progression of hormonal resistance
of breast cancer cells. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2015;2(2):50-5. (In Russ.)].
102. Zhang W., Meng Y., Liu N. et al. Insights into chemoresistance of prostate cancer. Int J Biol Sci 2015;11(10):1160-70.
103. Hong S., Tan M., Wang S. et al. Efficacy and safety of angiogenesis inhibitors
in advanced non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis. J Cancer Res Clin Oncol 2015;141(5):909-21.
104. Fakhoury M. Drug delivery approaches for the treatment of glioblastoma multiforme. Artif Cells Nanomed Biotechnol 2015:1-9.
cv
CS
и ш u
X ш
и
CV
CS
и ш U
105. Batrakova E.V., Kim M.S. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. J Control Release 2015. [Epub ahead of print].
106. Tila D., Ghasemi S., Yazdani-Arazi S.N. et al. Functional liposomes in the cancer-targeted drug delivery. J Biomater Appl 2015;30(1):3-16.
107. Urbanelli L., Buratta S., Sagini K. et al. Exosome-based strategies for diagnosis and therapy. Recent Pat CNS Drug Discov 2015;10(1):10-27.
108. Guo L., Guo N. Exosomes: Potent regulators of tumor malignancy and potential bio-tools in clinical application. Crit Rev Oncol Hematol 2015;95(3):346-58.
109. Lasser C. Exosomes in diagnostic and therapeutic applications: biomarker, vaccine and RNA interference delivery vehicle. Exp Opin Biol Ther 2015;15(1):103-17.
110. Gyorgy B., Hung M.E., Breakefield X.O., Leonard J.N. Therapeutic applications of extracellular vesicles: clinical promise and open questions. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2015;55:439-64.
111. Tian Y., Li S., Song J. et al.
A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials 2014;35(7):2383-90.
112. Yang Y., Chen Y., Zhang F. et al. Increased anti-tumour activity by exosomes derived from doxorubicin-treated tumour cells via heat stress. Int J Hyperthermia 2015;31(5):498-506.
113. Pascucci L., Coccè V., Bonomi A. et al. Paclitaxel is incorporated by mesenchymal stromal cells and released in exosomes that inhibit in vitro tumor growth: a new approach for drug delivery. J Control Release 2014;192:262-70.
114. Duchi S., Dambruoso P., Martella E. et al. Thiophene-based compounds
as fluorescent tags to study mesenchymal stem cell uptake and release of taxanes. Bioconjug Chem 2014;25(4):649-55.
115. Sun D., Zhuang X., Xiang X. et al.
A novel nanoparticle drug delivery system: the anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Mol Ther 2010;18(9):1606-14.
116. Dai S., Wei D., Wu Z. et al.
Phase I clinical trial of autologous ascites-derived exosomes combined with GM-CSF for colorectal cancer. Mol Ther 2008; 16(4):782-90.
117. Escudier B., Dorval T., Chaput N. et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-
exosomes: results of the first phase I clinical trial. J Transl Med 2005;3(1):10.
118. Núñez-Sánchez M.A., González-Sarrías A., Romo-Vaquero M. et al. Dietary phenolics against colorectal cancer — from promising preclinical results to poor translation into clinical trials: Pitfalls and future needs. Mol Nutr Food Res 2015;59(7):1274-91.
119. Bandyopadhyay D. Farmer
to pharmacist: curcumin as an anti-invasive and antimetastatic agent for the treatment of cancer. Front Chem 2014;2:113.
120. Shehzad A., Wahid F., Lee Y.S. Curcumin in cancer chemoprevention: molecular targets, pharmacokinetics, bioavailability, and clinical trials. Arch Pharm(Weinheim) 2010;343(9): 489-99.
121. Pitt J.M., Charrier M., Viaud S. et al. Dendritic cell-derived exosomes as immunotherapies in the fight against cancer. J Immunol 2014;193(3):1006-11.
122. Shender V.O., Pavlyukov M.S., Ziganshin R.H. et al. Proteome-metabolome profiling of ovarian cancer ascites reveals novel components involved in intercellular communication. Mol Cell Proteomics 2014;13(12):3558-71.
X ш
и
