CC BY
46
ORIGINAL ARTICLE
12. Мишланов В.Ю., Суханов С.Г., Сандаков П.Я., Ронзин А.В., Владимирский В.Е., Сыромятникова Л.И. и др. Дефензины-альфа, пептиды и белки, синтезируемые и высвобождаемые ней-трофилами при атеросклерозе разной локализации. Клиническая лабораторная диагностика. 2014; 5: 13—7.
REFERENCES
1. Sizyakina L.P., Andreeva I.I. Discordant parameters of the adaptive and innate immune response in replacement therapy in patients with X-linked agammaglobulinemia. Immunologiya. 2014; 35(2): 89— 91. (in Russian)
2. Lebedeva O.P., Pakhomov S.P., Kalutskiiy P.V., Karpov P.A., Churnosov M.I., Popov V.N. Toll-like receptors of innate immunity in the development of obstetric and gynecological pathology. Immunopatologiya, Allergologiya, Infektologiya. 2012; 1: 19—26. (in Russian)
3. Nozadze D.N., Rogacheva A.V., Kaznacheeva E.I., Sergienko I.V. Monocytes in the development and destabilization of the atherosclerotic plaque. Ateroskleroz i dislipidemii. 2012; 3: 25—36. (in Russian)
4. Sushkina I.F., Shlyk S.V., Sizyakina L.P., Antonova E.A., Dorofeeva N.P. Evaluation of inflammatory markers in patients with acute myocardial infarction in the background disorders of carbohydrate metabolism. Citokiny i vospalenie. 2014; 13(3): 133—4. (in Russian)
5. Efros L.A., Samorodskaya I.V. Factors influencing the long-term survival after coronary bypass surgery. Sibirskii meditsinskii zhurnal. 2013; 28(2): 7—14. (in Russian)
6. Mullick A.E., Soldau K., Kiosses W.B., Bell T.A., Tobias P.S., Curtiss L.K. Increased endothelial expression of Toll-like receptor 2 at sites of disturbed blood flow exacerbates early atherogenic events. J. Exp. Med. 2008; 205: 373—83.
7. Seimon T.A., Nadolski M.J., Liao X., Magallon J., Nguyen M., Feric N.T. et al. Atherogenic lipids and lipoproteins trigger CD36-TLR2-dependent apoptosis in macrophages undergoing endoplasmic reticulum stress. CellMeTable. 2010; 12: 467—82.
8. Michelsen. K.S., Wong M.H., Shah P.K., Zhang W., Yano J., Doherty T.M. et al. Lack of Toll-like receptor 4 or myeloid differentiation factor 88 reduces atherosclerosis and alters plaque phenotype in mice deficient in apolipoprotein E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101: 10679—84.
9. Falck-Hansen M., Kassiteridi C., Monaco C. Toll-Like Receptors in Atherosclerosis. Int. J. Mol. Sci. 2013; 14: 14008—23. Doi: 10.3390/ ijms140714008.
10. Abakushina E.V., Kuz'mina E.G., Kovalenko E.I. Main features and functions of the human NK-cells. Immunologiya. 2012; 4: 220—4. (in Russian)
11. Khaitov R.M., Pinegin B.V. Change immunity in surgical interventions. Annaly khirurgicheskoy gepatologii. 1998; 3(2): 100—10. (in Russian)
12. Mishlanov V.Yu., Sukhanov S.G., Sandakov P.Ya., Ronzin A.V., Vladimirskii V.E., Syromyatnikova L.I. et al. Alpha-defensin peptides and proteins synthesized and released by neutrophils in atherosclerosis different localization. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2014; 5: 13—7. (in Russian)
Поступила 12.04.17 Принята в печать 16.08.17
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 615.373:578.826.2].076.9
Лебедева Е.С.1, Багаев А.В.1, Чулкина М.М.1, Пичугин А.В.1, Лысенко А.А.2, Шмаров М.М.2, Логунов Д.Ю.2, Народицкий Б.С.2, Атауллаханов Р.И.1
МЕХАНИЗМЫ УСИЛЕНИЯ АГОНИСТАМИ TLR4 ЭКСПРЕССИИ ЦЕЛЕВОГО БЕЛКА В СОСТАВЕ АДЕНОВИРУСНОГО ВЕКТОРА В АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИХ КЛЕТКАХ
1 ГНЦ «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115478, г. Москва, Россия;
2 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ, 123098, г. Москва, Россия
Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы (rAD) — эффективные инструменты доставки вакцинных антигенов в антигенпрезентирующие клетки (АПК). Эффективность гуморальных и клеточных ответов организма на антиген, закодированный в составе зависит от эффективности его экспрессии в АПК. Ранее мы показали, что активация АПК с помощью агонистов То11-подобных рецепторов 4 (TLR4) способствует усилению экспрессии в них целевого антигена, закодированного в составе рекомбинантного аденовирусного вектора. Настоящая работа посвящена поиску механизмов, обеспечивающих усиленную экспрессию rAd в клетках-мишенях. Нами изучено влияние агонистов TLR4 на отдельные стадии жизненного цикла ^ в АПК. Установлено, что активация АПК агонистами TLR4 значительно усиливает транскрипцию мРНК белка-антигена, закодированного в составе rAd. Возрастание эффективности транскрипции целевых аденовирусных генов происходит с участием транскрипционного фактора NF-kB, имеющего сродство к промотору целевого гена. При этом агонисты TLR4 не оказывают влияния на эффективность проникновения аденовирусного вектора в АПК и на процессы трансляции целевого белка, закодированного в Кроме того, показана возможность паракринной передачи сигналов усиления экспрессии ^ от клеток, активированных агонистами TLR4, к клеткам, не подвергавшимся активации. В роли паракринных сигналов могут выступать провоспалительные цитокины, в частности, TNF-a.
Ключевые слова: агонисты То11-подобных рецепторов; генная терапия; генная иммунизация; рекомбинантные нереплицирующиеся аденовирусные векторы; экспрессия трансгенов; NF-kB; трансляция; еШ2а; ТШ-а.
Для корреспонденции: Атауллаханов Равшан Иноятович, д-р мед. наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Для цитирования: Лебедева Е.С., Багаев А.В., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Лысенко А.А., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Атауллаханов Р.И. Механизмы усиления агонистами TLR4 экспрессии целевого белка в составе аденовирусного вектора в антигенпрезентирующих клетках. Иммунология. 2017; 38(6): 295-306. DOI: http:// dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-6-295-306
LebedevaE.S.1, BagaevA.V.1, ChulkinaM.M.1, PichuginA.V.1, LysenkoA.A.2, ShmarovM.M.2, LogunovD.Yu.2, Naroditsky B.S.2, Ataullakhanov R.I.1
MECHANISMS OF TLR4 AGONISTS ENHANCE THE EXPRESSION OF TARGET PROTEIN IN THE COMPOSITION OF THE ADENOVIRAL VECTOR INTO ANTIGEN PRESENTING CELLS
1 National Research Center — Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115478, Moscow, Russia;
2 N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russia
Non-replicating recombinant adenovirus vectors (rAd) are effective tools for delivery of vaccine antigens into antigen presenting cells. The efficacy of humoral and cellular responses of an organism to the antigen encoded by rAd depends on the antigen expression in antigen presenting cells. We have previously shown that expression of target antigen encoded in rAd could be enhanced by activation of antigen presenting cells via Toll-like receptor 4 (TLR4). Here we studied TLR4 agonist-induced cellular mechanisms involved in enhancing of the target gene expression in rAd-transduced cells. We examined possible influence of TLR4-agonists on different rAd lifecycle phases in antigen presenting cells. It was shown that agonists of TLR4 significantly enhanced transgene mRNA transcription rate. TLR4-agonist induced phosphorylation of NF-kB transcription factor, which in turn activated NF-kB-sensitive transgene promoter, thus providing efficient transcription of transgene encoded in rAd. TLR4-agonists had neither effect on the rAd entry into antigen presenting cells nor target protein translation processes. Additionally, we showed the signals amplifying transgene expression could be transferred by a paracrine manner from TLR4 agonists-activated to intact cells. Pro-inflammatory cytokines, particularly TNF-a, could play their role in the paracrine enhancement of transgene expression.
Keywords: agonists of Toll-like receptors, gene therapy, gene vaccination, non-replicating recombinant adenovirus vectors, transgene expression, NF-kB, translation, elF2a, TNF-a.
For citation: Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Yu., Naroditsky B.S., Ataullakhanov R.I. Mechanisms of TLR4 agonists enhance the expression of target protein in the composition of the adenoviral vector into antigen presenting cells. Immunologiya. 2017; 38(6): 295-306. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2017-38-6-295-306
For correspondence: Ravshan I. Ataullakhanov, MD, PhD, Prof., Head of the Department of Immune Biotechnology, NRC Institute of Immunology FMBA, Russia, E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 07.08.17 Accepted 16.08.1
введение
То11-подобные рецепторы (TLR) — первичные сенсоры инфекции, играющие основополагающую роль в активации врождённых иммунных реакций [1—2] и в последующей выработке специфического адаптивного иммунитета на конкретный антиген [3—4]. TLR-лиганды широко зарекомендовали себя в качестве эффективных адъювантов вакцин на основе ДНК-векторов [5—9].
Среди вирусных векторов — рекомбинантные аденовирусные векторы (rAd), которые отличаются высокой иммуно-генностью и индукцией устойчивых реакций Т-лимфоцитов [10]. Препараты на основе rAd проходят различные фазы клинических исследований для создания вакцин против таких патогенов, как ВИЧ [11], малярийный плазмодий [12], вирус Эбола [13], гепатит С [14] и микобактерии туберкулёза [15]. Амплитуда и качество иммунных ответов на рекомби-нантные аденовирусные вакцины варьируют, зависят от типа инфекции и могут быть значительно подвержены влиянию агонистов TLR [16]. Нами создана кандидатная противогриппозная вакцина, основу которой составляют рекомбинантные аденовирсные векторы, кодирующие антиген вируса гриппа, и фармацевтический агонист TLR4 растительного происхождения — Иммуномакс (1тт) [17—20]. Использование Иммуномакса в качестве адъюванта позволяет усилить анти-генспецифичные реакции Т-клеток и повысить защитные свойства вакцины, это даёт возможность в 3—10 раз уменьшить дозу rAd, кодирующих антигены вируса гриппа, сохранив её иммуногенные и протективные свойства. Несмотря на успешное применение агонистов TLR совместно с вакцин-
ными препаратами rAd, механизмы действия конкретных TLR лигандов на качество вакцинации мало изучены.
Нами установлено, что продукция закодированного в rAd целевого белка в антигенпрезентирующих клетках (АПК) может регулироваться сигнальными каскадами, запускаемыми при активации клеток через То11-подобные рецепторы [21]. Агонисты TLR2, 4, 5, 7, 8 и 9 значительно усиливают продукцию белка в клетках, трансдуцированных rAd со вставкой гена этого белка, эффекты усиления реализуются в дендритных клетках и макрофагах, экспрессирую-щих цитоплазматический (GFP), мембранный (Ш№) или секреторный ^ЕАР) белки.
Настоящая работа посвящена исследованию молекулярных механизмов, активируемых агонистами TLR4 и лежащих в основе усиленной продукции целевого белка-антигена аденовирусного вектора в АПК клетках. При инфицировании клеток-мишеней аденовирусный вектор проходит 5 основных стадий: адсорбцию, проникновение, выход в цитоплазму, транспорт и импорт в клеточное ядро, с последующей активацией транскрипции вирусной РНК, трансляцией вирусных белков-антигенов, их протеасомным разрезанием на короткие пептиды и презентацией пептидов на поверхности клетки-мишени в комплексе с молекулами МНС I класса (рис. 1) [22]. Усиление экспрессии rAd в клетках-мишенях может затрагивать различные клеточные процессы, пересекающиеся с отдельными стадиями жизненного цикла вируса в клетке. В работе мы попытались проследить конкретные этапы аденовирусной инфекции в клетках-мишенях и действие агонистов TLR4 на каждый из них.
ORIGINAL ARTICLE
Материал и методы
Антитела и реагенты. В работе использованы следующие моноклональные антитела: Influenza A H1N1 Hemagglutinin/HA (Sino biological, 11055-RM10), Phospho-NF-кБ p65 (Ser536) (Cell Signalling, 3033S), GAPDH (Ab-cam, ab22555), Phospho-eIF2a (Ser51) (Cell Signalling, 9721S) и агонисты Toll-подобного рецептора 4: липополисахарид из E. coli серо-тип 055: B5 (LPS, Sigma, L-2880), Иммуномакс (Imm, Иммафарма). Кроме того, применяли рекомбинантный фактор некроза опухоли а (TNF-а, Sigma, T7539). В цитометрии использовали краситель ДНК — дигидрохлорид DAPI (Sigma), CellTrace™ Violet (Invitrigen, C34557).
Животные. Мышей линии BALB/c в возрасте 8—10 нед, полученных из питомника «Столбовая», содержали на стандартной диете в стандартных условиях вивария ГНЦ Института иммунологии ФМБА.
Антиген-презентирующие клетки. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM с 25 мМ HEPES, дополненной коктейлем заменимых аминокислот, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мЫ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ ß-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гента-мицина (все реактивы фирмы «ПанЭко») при 37°C в увлажнённой атмосфере с 5% С02.
Суспензии первичных клеток брюшной полости и костного мозга мышей готовили общепринятыми методами.
Перитонеальные макрофаги получали путём вымывания клеток из перитонеальной полости интактных мышей BALB/c фосфатным буферным раствором (PBS), дополненным 1% глюкозы, 10 мИ HEPES и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Клетки осаждали центрифугированием, суспензировали в ПС, культивировали в течение 18—20 ч при 37°C в атмосфере 5% C02. Затем не прилипшие к пластику клетки удаляли, промывая культуральной средой и PBS («ПанЭко»). Более 90% оставшихся на пластике адгезионных клеток были представлены макрофагами.
Дендритные клетки получали in vitro дифференцировкой клеток костного мозга мышей BALB/c в присутствии гра-нулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF, granulocyte-macrophage colony stimulating factor). Костный мозг вымывали из бедренных и больших берцовых костей мыши, эритроциты удаляли осмотическим лизисом, ядросодержащие клетки дважды отмывали PBS, после чего культивировали в полной среде с добавлением 10 нг/мл GM-CSF (Sigma) в течение 7 дней, как описано в [23]. К окончанию этого срока неадгезионные клетки содержали 70—75% дендритных клеток. Адгезионная часть культуры была на 95% представлена макрофагами. Для получения макрофагов сначала осторожно удаляли неадгезионные клетки, оставшийся монослой адгезионных клеток промывали (PBS, 0,5% BSA), выдерживали в растворе Версена («ПанЭко») в течение 1 ч при 37°C, после чего макрофаги смывали (PBS, 0,5% PBS).
Культуры трансформированных клеточных линий.
Линии клеток Raw 264.7, HEK-293-TLR4/MD2, HEK-293 -TLR3 и HEK-293-null (InvivoGen) поддерживали in vitro в полной среде в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Для мониторинга активности NF-kB клетки HEK-293-TLR4/MD2 и HEK-293-null дополнительно транс-дуцировали лентивирусным вектором (Cleveland BioLabs), несущим репортёрный ген ß-галактозидазы под контролем NF-KB-зависимого промотора.
нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в работе
№ Ген Название праймера 5'—> 3' последовательность
1 gfp EGFP-F GACCACTACCAGCAGAACAC
EGFP-R CTTGTACAGCTCGTCCATGC
EGFP-TP FAM-AGCACCCAGTCCGCCCTGAGCA-RTQ
2 seap SEAP-F CTGGGCGATGGGATGGGGGT
SEAP-R GTTGCCCTTGACCCCGCACA
SEAP-TP FAM-GGGCAGAAGAAGGACAAACTGGGG-RTQ
З b-actin b-actin-F AGAGGGAAATCGTGCGTGAC
b-actin-R CAATAGTGATGACCTGGCCGT
b-actin-TP FAM-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-RTQ
4 gapdh GAPDH-F TTCACCACCATGGAGAAGGC
GAPDH-R GGCATGGACTGTGGTCATGA
GAPDH-TP FAM-TGCATCCTGCACCACCAACTGCTTAG-RTQ
5 tnfa TNF-F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA
TNF-RV TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC
TNF-TP FAM-CACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGA-RTQ
6 h1n1 H1-F CTGGATGGATTCTGGGCAAC
H1-R CAGGGTAGCATGTGCCGTTG
H1-TP FAM —TGTGAATCCCTGAGCACCGCCT-RTQ
Рекомбинантные аденовирусные векторы, кодирующие белковые антигены. Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы rAd-H1N1, rAd-SEAP, rAd-GFP со вставкой генов гемагглютинина вируса гриппа НШ1 (H1N1), секреторной эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP) или зелёного флуоресцентного белка (GFP) получали на основе плазмиды pShuttle-CMV со-
Рис. 1. Механизм синтеза и презентации антигена, закодированного в аденовирусном векторе.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Костномозговые дендритные клетки
Перитонеальные макрофаги
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - + -
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
Raw 264.7
Raw 264.7
60 п
50 -
I 40 -
30 -
20 -
10 -
+ о.
СЭ
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
Рис. 2. Влияние агонистов TLR4 на продукцию белка, закодированного в составе rAD, в дендритных клетках и макрофагах.
Дендритные клетки (a), перитонеальные макрофаги (б) и клеточную линию RAW 264.7 (в, г) трансдуцировали rAd-H1N1 (а), rAd-GFP (б, г) и rAd-SEAP (в) (rAd) (100 БОЕ/кл), инкубировали в течение 24 ч в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/мл), LPS (LPS, 10 мкг/мл) или без активатора. Уровень выработки GFP в клетках детектировали на проточном цитометре FACS Aria II по фуоресценции GFP, для регистрации синтеза H1N1 клетки последовательно окрашивали первичными и флуорохром-меченными вторичными антителами с последующим анализом на проточном цитометре FACS Aria II. Уровень продукции белка SEAP измеряли колориметрическим методом по ферментативной активности SEAP в культуральной жидкости.
По оси ординат — процентное содержание ШШ-позитивных (H1N1+, %) (а), GFP-позитивных (GFP+, %) (б, г) клеток и уровень активности SEAP (mOD/min) (в). Представлены средние значения и стандартные отклонения по трём экспериментам; здесь и на рис. 3, 5, 7—12: * — статистическая значимость отличийp < 0,05.
гласно рекомендациям производителя Adeasy Adenoviral vector system (Stratagene, 240009), используя плазмидные конструкции pGreen (Carolina Biological Supply Company), p310D (pRcCMV-SEAP) и pAL-H1N1 (обе собственного изготовления). Наличие генов белков GFP, SEAP, H1N1 в соответствующих плазмидных конструкциях pShuttle-CMV-GFP, pShuttle-CMV-SEAP, pShuttle-CMV-H1N1 подтверждали рестрикционным анализом с использованием эндонуклеаз EcoRI, NotI и EcoRV и с помощью ПЦР. При-
сутствие генов gfp, seap и h1n1 в rAd подтверждали методом ПЦР. Титры препаратов rAd-GFP, rAd-SEAP и rAd-H1N1 определяли методом бляшкообразования в культуре клеток линии HEK-293 [24].
Трансдукция клеток нереплицирующи-мися рекомбинантными аденовирусными векторами. Культуры клеток трансдуцировали rAd-SEAP, rAd-GFP или rAd-H1N1 из 0 мкг/ мл), LPS (10 мкг/мл), Poly [I:C] (10 мкг/мл) или без активаторов. Для активации клеток, минуя TLR, использовали TNF-a (1—10 нг/мл).
Трансдукция клеток плазмидным вектором. Культуры клеток трансфицировали плазмидным вектором pShuttle-CMV-GFP с помощью реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen) согласно протоколу производителя.
Измерение интенсивности продукции белков SEAP, GFP и H1N1, в-галактозидазы. Продукцию секреторного белка SEAP в культуральной' среде определяли согласно [25] с незначительными модификациями. Тестируемую жидкость осветляли центрифугированием при 14 000 g в течение 2 мин, затем прогревали при 65°C в течение 5 мин. Субстрат «-нитрофенилфосфат вносили в реакционном буфере (0,5 М CaCO3, 0,5 мМ MgCl2, рН 9,8), оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм.
Продукцию GFP в клетках определяли методом проточной цитофлюориметрии FACS Aria II (BD Biosciences). Интенсивность флуоресценции выявляли в диапазоне длин волн 515—545 нм при лазерном возбуждении на волне 488 нм.
Экспрессию мембранного белка H1N1 определяли, окрашивая клетки последовательно первичными моноклональными антителами к H1N1 и вторичными антителами, меченными флуорофорами (Invitrogen, A-11034), с последующим анализом методом проточной цитоф-луориметрии на приборе FACS Aria II.
Для измерения активности р-галактозидазы клетки лизировали (Трис-НС1, pH 7,6, 0,1% NP-40, 0,5мМ MgCl2) и смешивали с раствором субстрата 2-нитрофенил-р^-галактопиранозида (Sigma), оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм.
ПЦР в реальном времени. Препараты тотальной РНК, ДНК и кДНК получали с использованием наборов реагентов фирмы «Синтол» (РНК-экстран, S-сорб, набор реагентов для проведения ОТ соответственно), следуя инструкции производителя. Препараты кДНК и тотальной ДНК применяли в качестве матрицы для проведения количественного ПЦР в реальном времени. Нуклео-тидные последовательности использованных в работе праймеров (Синтол) представлены в таблице. ПЦР осуществляли с помощью ам-плификатора с детекцией в режиме реального времени DT-Prime фирмы «ДНК-технология», используя смесь реактивов фирмы «Синтол». Относительный уровень экспрессии анализируемых генов вычисляли методом 2ЛСр, где ДСр = Ср (нормировочный ген) — Ср (ген интереса), в качестве нормировочного гена использовали ген р-актина или GAPDH.
Иммуноблоттинг. Клетки трижды промывали охлаждённым фосфатно-солевым буфером и подвергали лизису (Invitrogen, Cell Extraction Buffer, FNN0011) в присутствии
ORIGINAL ARTICLE
ïl ■=1 Ё
to p ^
££ s p:
m о
о X
m л
h- С
о S
аз н
■j s
s о
с о
о X
* 5
ns "GFP
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
ríi
X 4
8 . 7
¿ 6
Сортированные макрофаги
— n, "GFP ns
о оз
rAd
Imm
LPS
+ + +
70
ïl .s ra 60
P* 50
s P! m о о X m л
i- с
о 3 а) н
7 S S О
с о
о X
* 5
ns
40 30 20 10 0
ns DHEX
il
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
Рис. 3. Влияние агонистов TLR4 на проникновение rAD в антигенпрезентирующие клетки. Перитонеальные макрофаги трансфицировали rAd-GFP (rAD) (100 БОЕ/кл), инкубировали в течение 24 ч в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/ мл), LPS (LPS, 10 мкг/мл) или без активаторов. В качестве контроля использовали клетки без трансдукции. Клетки отмывали от вируса трижды раствором PBS, после чего подвергали лизису (а, б); из популяций трансфицированных клеток отсортировывали гомогенные популяции макрофагов с помощью сортировщика клеток FACS Aria II по их автофлуоресценции (в), отсортированные клетки так же лизировали. В полученных лизатах количественно оценивали присутствие вирусной ДНК методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров к генам, кодирующим вирусные белки GFP (GFP) (а, в) и Гексон (HEX) (б). Ген р-актина использовали в качестве внутреннего стандарта. Синтез целевого белка GFP в клетках (г) анализировали на проточном цитометре FACS Aria II по флуоресценции GFP. По оси ординат — количество вирусной ДНК в клетках относительно ДНК р-актина (а—в) и процентное содержание GFP-положительных клеток (GFP, %) (г). Здесь и на рис. 4: данные суммированы по результатам трёх независимых экспериментов. Представлены средние значения и стандартные отклонения по трём экспериментам; здесь и на рис. 12: ns (not significant) — статистические различия не обнаружены.
Рис. 4. Динамика накопления аденовирусной ДНК в антигенпрезентирующих клетках.
Перитонеальные макрофаги трансфицировали rAd-GFP (rAd) (100 БОЕ/кл), инкубировали в течение 1—24 ч в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/мл) (а), LPS (LPS, 10 мкг/мл) (б) или без активаторов (rAD). В качестве отрицательного контроля — клетки без трансдукции (Среда). Клетки отмывали от вируса трижды раствором PBS, после чего подвергали лизису, в полученных лизатах количественно оценивали присутствие вирусной ДНК методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров к генам, кодирующим вирусный белок GFP. Ген р-актина использовали в качестве внутреннего стандарта.
По оси ординат — количество вирусной ДНК в клетках относительно ДНК р-актина.
X I 3,5-
о
11 3" Ig2,5
о.
«о о
о X
о л 1 5-
о 3
<UP А TS 1"
s о
g S 0,5* 6 «
Imm
4
Время, ч а
3-
^3,5
* X
51
>s 4s о с О сэ. 2,5
о ьс
££ 2 s ч:
m О Л с
о X 1,5
m л
& g
оз Р
J s s о
g g 0.5 0
1-
24
LPS
2 4 Время, ч б
24
ингибиторов протеаз (Sigma, P2714-1BTL) 30 мин при 4°C. Клеточные лизаты осветляли центрифугированием (14,000^g, 10 мин, 4°C) и измеряли в них концентрацию белка (Pierce, Protein Assay Reagent, 23225). Полученную смесь клеточных белков (10 мкг) разделяли в 8% SDS-ПААГ и переносили на PVDF-мембрану (Amersham, Hybond-P). Для детекции целевых белков мембрану последовательно в течение 1 ч инкубировали с первичными антителами к Phospho-p65 (Ser565) (Cell Signalling), Phospho-elF2a (Cell Signalling), р-актину (Cell signalling) и GAPDH (Abcam) в разведении 1:1000 и со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1:1 000 000 (Sigma, A0545-1ML). Визуализацию результатов осуществляли методом хемилюминес-ценции (Pierce, SuperSignal West Femto Maximum sensitivity, 34095).
Статистическая обработка данных. Все результаты представлены в виде средних значений и соответствующих величин стандартного отклонения. Статистическую значимость различий определяли с использованием /-критерия Стьюдента.
результаты
Регуляция с помощью агонистов ToU-подобmlх рецепторов экспрессии целевого белка, закодированного в составе аденовирусного вектора. При исследовании TLR-опосредованных механизмов, задействованных в усилении экспрессии rAd, мы сконцентрировали наше внимание на двух агонистах TLR4 — LPS и Иммуномаксе [17—20]. На рис. 2 представлены эффекты усиления экспрессии rAd под действием агонистов LPS и Иммуномакс. Видно, что экспрессия це-
Иммунология. 2017; 38(6)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-6-295-306 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
LPS р65Р GAPDH
Imm
р65Р GAPDH
0 5 15 30 60 120
0 5 15 30 60 120
мин
9000 8000 7000 Н 6000 5000 Н 4000 3000 Н 2000 1000Н 0
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
Рис. 5. Активация транскрипционного фактора NF-kB и усиление экспрессии целевого гена rAd в костномозговых макрофагах под действием агонистов TLR4. а — костномозговые макрофаги, инкубировали в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/мл) и LPS (LPS 10 мкг/мл) 0—120 мин, клетки подвергали лизису, в полученных клеточных экстрактах методом иммуноблота анализировали уровень активации фактора NF-kB по фосфорилированию его p65 субъединицы (р65Р), белок GAPDH использовали в качестве внутреннего стандарта; б — костномозговые макрофаги инфицировали rAd-GFP (rAd) (100 БОЕ/клетку) в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/мл) и LPS, (LPS 10 мкг/мл) и без активатора. Через 24 ч после инфекции в клетках оценивали уровень экспрессии GFP на проточном цитометре FACS Aria II по флуоресценции GFP.
По оси ординат — средняя интенсивность фуоресценции GFP (MFI GFP). Представлены средние значения и стандартные отклонения по трём экспериментам.
левых и репортёрных белков (гемагглютинин вируса гриппа H1N1, GFP и SEAP), закодированных соответственно в rAd-H1N1, rAd-GFP и rAd-SEAP, значительно усиливается при активации АПК агонистами TLR4. Этот эффект усиления экспрессии антигенов наблюдается при действии ЛПС и Иммуномакса на дендритные клетки (см. рис. 2, а) и перитонеальные макрофаги мыши (см. рис. 2, б), а также на трансформированные макрофаги линии Raw 264.7 (см. рис. 2, в и г).
Агонисты TLR4 не оказывают влияния на эффективность проникновения аденовирусного вектора в антиген-представляющие клетки. Одним из условий, обеспечивающих успешную экспрессию закодированного в rAd целевого антигена в АПК клетках, является эффективное проникновение вектора в клетки-мишени. Усиление экспрессии целевого белка в составе вектора могло бы происходить вследствие усиления проникновения вектора в клетки. Поэтому мы изучили влияние агонистов TLR4 на проникновение rAd в АПК (рис. 3). Эффективность проникновения вируса мы оценивали по количеству внутриклеточной вирусной ДНК, детектируемой в клетках после их трансфекции rAd-GFP методом ПЦР в реальном времени. В ПЦР использовали специфичные праймеры к генам, кодирующим структурный (гексон, HEX) и целевой (GFP) белки аденовирусного вектора rAd.
При трансфекции перитонеальных макрофагов rAd-GFP в присутствии агонистов TLR4 (Иммуномакс, LPS) количество вирусной ДНК, проникшей в клетки, не отличалось от уровня вирусной ДНК, детектируемой в клетках, трансфициро-ванных в отсутствие активаторов (см. рис. 3, а и б). Подробное исследование кинетики проникновения аденовирусного вектора в АПК в период между 1 и 24 ч после трансфекции тоже не выявило различий в скорости проникновения вектора в клетки при активации клеток агонистами TLR4 (рис. 4).
Полученные методом адгезии перитонеальные макрофаги содержат примесь клеток перитонеального экссудата (В-клетки, лимфоциты, эритроциты). Примесные клетки не трасдуцируются rAd, но при совместном с трансфицирован-ными макрофагами лизисе их геномная ДНК может повлиять на конечный результат нормированного значения уровня вирусной ДНК в клетках. С целью исключения возможности искажения результатов мы исследовали уровень внутриклеточной вирусной ДНК в сортированной популяции перитоне-
альных макрофагов (см. рис 3, в). Для этого клетки перитонеального экссудата, полученные методом адгезии, трансфицирова-ли rAd-GFP в присутствии и в отсутствии агонистов TLR4, после чего из популяции трансфицированных клеток отсортировывали гомогенную популяцию макрофагов с помощью сортировщика клеток FACS Aria II. Степень чистоты популяции сортированных макрофагов составляла 99%. Как видно из рис. 3, г, в очищенной популяции макрофагов также не обнаружено различий в уровне вирусной ДНК при активации клеток агонистами TLR4 относительно уровня вирусной ДНК в клетках, трансфи-цированных в отсутствие TLR4-лигандов.
Таким образом, мы установили, что агонисты TLR4 (Иммуномакс и LPS) не влияют на эффективность проникновения rAd в АПК, но, несмотря на это, усиливают продукцию целевого белка, закодированного в rAd (см. рис 3, г).
Активация транскрипционного фактора NF-kB агонистами TLR4 приводит к усиленному синтезу целевого белка в составе аденовирусного вектора. Целевой антиген в составе rAd закодирован под контролем CMV-промотора. CMV-промотор содержит мотивы для сайтов связывания различных эукариотических факторов транскрипции, в частности NF-kB [26—28].
NF-£B — ключевой транскрипционный фактор, активируемый в клетках при воздействии агонистами TLR. Вероятно, в случае трансдукции клеток rAd в присутствии агони-стов TLR4 мы наблюдаем NF-Afi-опосредованную активацию CMV-промотора и, как следствие, возрастание транскрипции мРНК целевого гена, находящегося под контролем данного промотора.
На рис. 5, а продемонстрирована активация NF-Ш по действием Иммуномакса и LPS в костномозговых макрофагах. При действии на клетки TLR4-агонистами происходит фосфорилирование субъединицы p65 транскрипционного NF-Ш в положении Ser293. Это приводит к активации и транслокации NF-Ш в ядро, где запускается транскрипция контролируемых NF-Ш генов, в частности транскрипция целевого гена белка, закодированного в rAd и, как следствие, продукция целевого белка (см. рис. 5, б).
Для проверки гипотезы о ключевой роли NF-Ш в усилении экспрессии целевого белка в составе аденовирусного вектора мы использовали специальные культуры клеток HEK-293, в которых ген репортёрного белка находится под контролем NF-AB. Мы изучили экспрессию rAd-GFP в трёх репортёрных линиях HEK-293-TLR4/MD2, HEK-293-null и HEK-293-TLR3. Клетки линии HEK-293-TLR4/MD2 и HEK-293-null в ответ на активацию транскрипционного фактора NF-AB продуцируют репортёрный белок в-галактозидазу. В клетках HEK-293-TLR4/MD2 активация NF-AB и продукция репортёрного белка в-галактозидазы происходят в результате активации рецепторов TLR4 соответствующим агонистом. Клетки HEK-293-null не несут на своей поверхности TLR, но активация NF-Ш и продукция репортёрного белка возможны через рецепторы ци-токина TNF-a. Третья клеточная линия HEK-293-TLR3 в ответ на связывание агонистов TLR3 и активацию NF-Ш производит репортёрный белок SEAP, также закодированный в геноме клеток под NF-Ш-зависимым промотором.
Описанные клеточные линии HEK-293-TLR4/MD2, HEK-293-TLR3 и HEK-293-null активировали Иммуномаксом, Poly I: C и TNF-a соответственно. Во всех исследованных линиях на основе HEK-293 при трансфекции rAd-GFP в присутствии
ORIGINAL ARTICLE
HEK-TLR3
HEK-TLR4
HEK-TLRnull
2= 31 — 2,5 -
LL.
Í 2-¡1.5-
о и
CO 1 -
О.
CO
& 0,50-
rAd rAd -ГС
1С - +
2 ю
U-
Е 8
LL.
í 6H
о
Я! CL СО О Ш
rAd rAD +1С
1С - +
31 2,5-
1,5-
0,5 -
rAd rAd Itnm
Imm - +
2-1
1,5-
0,5-
rAd rAd Irfim
Imm - +
3 2,5 2 1,5 1
0,5 0
ríi
rAd rAd TNF
TNF - +
16 - в *
12 - itl
■
rAd rAd TNF
TNF - +
Рис. 6. Активации транскрипционного фактора NF-kB и усиление экспрессии целевого трансгена rAd в NF-kB-репортёрных линиях HEK-293.
Линии клеток HEK-293-TLR3 (а, г) HEK-293-TLR4/MD2 (б, д) и HEK-293-null (в, е) трансфицировали rAD-GFP (rAD) (10 БОЕ/кл) и инкубировали в течение 12 ч в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/мл) (б, д), Poly I: C (1С, 10 мкг/мл) (а, г) или TNF-а (TNF, 1 нг/мл) (в, е) и без активатора. Активацию NF-kB в клетках детектировали колориметрическим методом по ферментативной активности репортёрных белков — ß-галактозидазы (д, е) и SEAP (г). Уровень экспрессии rAD-GFP оценивали на проточном цитометре FACS Aria II по флуоресценции GFP в клетках (а—в).
По оси ординат — возрастание активности ß-галактозидазы (mOD/min) (д, е), SEAP (г) и средней интенсивности флуоресценции GFP (MFI GFP) (а—в) в активированных клетках. Представлены средние значения и стандартные отклонения по трём экспериментам.
Q_ LL
сэ
а>
5
i П> а. со о ш
4 3,532,5 -2 -1,5 -1
0,5 -| 0
m
i
pGFP + +
Imm +
TNF
_ 4
Z 3,5 -
Ё 3-о
о 2,5 -
5
" 2 -1,5 -1 -
¡1,5- Ё
I m í-' I I
S 0 i i i
pGFP - + +
Imm - - +
TNF - - -
Рис. 7. Активации транскрипционного фактора NF-kB в усилении экспрессии целевого гена, закодированного в составе плазмидного вектора.
Линии клеток HEK-293-TLR4/MD2 трансформировали pShuttle-CMV-GFP (pGFP) и инкубировали в течение 12 ч в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/мл) или TNFa (TNF, 1 нг/мл) и без активатора. Уровень экспрессии GFP оценивали на проточном цитометре FACS Aria II по флуоресценции GFP (а). Активацию NF-kB в клетках детектировали колориметрическим методом по ферментативной активности репортёрного белка ß-галактозидазы (б).
По оси ординат — возрастание средней интенсивности флуоресценции GFP (MFI GFP) (а) и активности бета-галоктозидазы (mOD/min) (б) при активации клеток. Представлены средние значения и стандартные отклонения по трём экспериментам.
активаторов — Иммуномакса (рис. 6, б и д), Poly I: C (см. рис. 6, а и г) или TNF-a (см. рис. 6, в и е) регистрировались активация NF-AB (см. рис. 6, г—е) и усиленный синтез целевого белка GFP (см. рис. 6 а—в).
Таким образом, усиленная экспрессия закодированного в rAd целевого белка в клетках линии HEK-293 коррелирует с активацией NF-ffi и не определяется наличием на их поверхности TLR4. Эффект усиления наблюдается при активации NF-ffi через рецепторы TLR4, TLR3 и даже, минуя TLR, через рецепторы TNF-a.
Можно предположить, что NF-Ж-зависимая активация экспрессии целевого трансгена определяется CMV-промотором и не зависит от структуры вектора, в составе которого ген доставляется в клетки, поэтому нами исследована экспрессия целевого белка под контролем CMV-промотора в составе плазмидного вектора pShuttle-CMV-GFP в NF-AB-репортёрных линиях HEK-293-TLR4/MD2 (рис. 7). Клетки
HEK-293-TLR4/MD2 трансфицировали pShuttle-CMV-GFP с помощью реагента Lipofectаmine 2000 (1пуЛ^еп). В качестве активаторов клеток использовали агонист TLR4 Имму-номакс или цитокин ТЫР-а. Через 12 ч после трансфекции плазмидным вектором в клетках анализировали уровень экспрессии белка GFP и активность ЫР-АВ. Из рис. 7 видно, что, как и в случае с аденовирусным вектором, трансфекция HEK-293-TLR4/MD2 клеток плазмидным вектором в присутствии активаторов ЫР-АВ (Иммуномакс и ТЫР-а) приводит к усиленной экспрессии целевого гена GFP (см. рис. 7, а), что коррелирует с активацией ЫР-АВ в исследуемых клетках (см. рис. 7, б).
Регуляция транскрипции мРНК целевого гена аденовирусного вектора агонистами TLR4. Следствием активации транскрипционного фактора ЫР-АБ и соответствующего промотора становится усиление транскрипции мРНК генов, встроенных под активируемый промотор. В связи с этим мы
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Костномозговые дендритные клетки
Перитонеальные макрофаги
0,16
I 0,12 i
1
к 0,08 s
о
о ф
5 0,04
m
El
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - + -
2,5 о. 2
LL
О
I
■g
í 1,5
о;
s
8 i о 1
Q. С
ы
о 0,5
ib
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
Raw 264.7
б
Raw 264.7
CL <
ш
от i
1 к s
8
о О
3 -i
2,5 -
2 -
1,5 -
1 -
0,5 -0
il
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
0,06 П
о.
LL
сэ
I
1 0,04 -
к s
8 о
5 0,02 H
О
fb
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
Рис. 8. Влияние агонистов TLR4 на экспрессию мРНК генов, закодированных в составе rAd, в дендритных клетках и макрофагах.
Костномозговые дендритные клетки (а), перитонеальные макрофаги (б) и клеточную линию макрофагов RAW 264.7 (в, г) трансдуцировали rAd-H1N1 (а), rAd-GFP (б, г), rAd-SEAP (в) (rAd) (100 БОЕ/кл), инкубировали в течение 24 ч в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/ мл) или LPS (LPS,10 мкг/мл) и без активаторов. Уровень экспрессии мРНК целевых генов rAd анализировали методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров. мРНК р-актина и GAPDH применяли в качестве внутреннего стандарта. По оси ординат—относительный уровень экспрессии внутриклеточной мРНК генов H1N1 (а), SEAP (в), GFP (б, г). Данные суммированы по результатам трёх независимых экспериментов. Представлены средние значения и стандартные отклонения по трём экспериментам.
исследовали в антиген-презентирующих клетках влияние агонистов Toll-подобных рецепторов на уровень транскрипции мРНК генов, закодированных в составе rAd. На рис. 8 представлены результаты изучения экспрессии rAd-GFP, rAd-SEAP и rAd-H1N1, кодирующих зелёный флуоресцентный белок (GFP), секреторную щелочную фосфатазу (SEAP) и гемагглютинин вируса гриппа (H1N1) соответственно в дендритных клетках (см. рис. 8, а), перитонеальных макрофагах мыши (см. рис. 8, б) и в макрофагальной клеточной линии Raw
264,7 (см. рис. 8, в и г). Из представленных данных видно, что агонисты TLR4 — Иммуномакс и LPS — усиливают экспрессию целевых генов rAd во всех исследованных культурах клеток (см. рис. 8, а—г). Таким образом, под действием агонистов TLR4 происходит активация транскрипции мРНК целевого гена, встроенного в состав rAd, под контролем NF-ffi -зависимого промотора. Обнаруженное нами усиление транскрипции целевых генов аденовирусных векторов под действием TLR4-агонистов, вероятно, приводит к усиленному накоплению целевого белка-антигена в АПК. Регуляция синтеза белка. Один из наиболее детально изученных механизмов регуляции трансляции белка в клетках эукариот состоит в фосфорилиро-вании альфа-субъединицы фактора инициации трансляции elF-2a в положении Ser-51 [29]. Мы оценили степень фосфорилирова-ния elF-2a в костномозговых макрофагах, активированных TLR4-агонистом LPS (рис. 9, а). В качестве положительного контроля послужили экстракты клеток, подвергшиеся голоданию в растворе PBS, что сопровождается активацией фосфорилирования elF-2a. Из рис. 9, а следует, что активация клеток LPS не приводит к фосфорилированию elF-2a. Следовательно, агонист TLR4 усиливал производство целевого белка-антигена, закодированного в аденовирусном векторе (см. рис. 9, б), не оказывая влияния на elF-2a, один из ключевых регуляторов трансляции клеточных белков.
Индуцированное TLR4-агонистом усиление экспрессии белка, закодированного в rAd, передаётся неактивированным клеткам паракринным путём. В ответ на активацию агонистом TLR4 АПК секретируют провос-палительные цитокины, хемокины, факторы роста, интерфероны и другие биологически активные вещества, способные оказывать паракринное воздействие на соседние клетки. Мы исследовали возможность паракрин-ной передачи сигналов усиления экспрессии трансгена между активированными и неактивированными макрофагами. Первую популяцию макрофагов активировали аго-нистами TLR4 (Иммуномакс или LPS), через 3 ч клетки отмывали от активаторов и смешивали со 2-й популяцией макрофагов, предварительно меченной флуоресцентным красителем Celltrace Violet. Полученная смешанная культура активированных и неактивированных макрофагов трансфицировалась rAd-GFP. Через 24 ч на проточном цитометре FACS Aria II мы могли различать в смешанной культуре по Celltrace Violet предварительно активированные и неактивированные популяции клеток (рис. 10, б). В обеих популяциях макрофагов производство белка, закодированного в rAd-GFP, значительно усиливалось по сравнению с монокультурой неактивированных макрофагов, трансфицирован-ной rAd-GFP. Следовательно, активированные TLR4 макрофаги секретировали сигналы усиления экспрессии белков, закодированных в ДНК rAd, которые паракринным путём воздействовали на неактивированные макрофаги, и в них тоже индуцировали усиленную экспрессию целевого белка, закодированного в rAd.
ORIGINAL ARTICLE
LPS
3 К
Голодание 1 2 ;
b-actin elF2a
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
Рис. 9. Регуляция белкового синтеза под действием фактора инициации трансляции elF-2a не оказывает влияния на накопление целевого белка-антигена rAd в клетках, активированных агонистами TLR4.
а — костномозговые макрофаги активировали LPS (10 мкг/мл) 1—3 ч, отрицательный контроль — клетки без активации (К). В качестве положительного контроля - клетки, подвергшиеся голоданию в растворе PBS 1—3 ч. В лизатах активированных клеток анализировали степень фосфорилирова-ния фактора elF-2a методом иммуноблотинга. В качестве стандарта использовали уровень белка Р-актина в клетках; б — костномозговые макрофаги трансфицировали rAd-GFP (rAd) (100 БОЕ/кл) в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/мл) или LPS (LPS, 10 мкг/мл), или без активаторов. Через 24 ч после трансфекции анализировали экспрессию GFP с помощью цитометра FACS Aria II по флуоресценции GFP. По оси — ординат процентное содержание GFP-положительных клеток (GFP+, %).
4000 3500 3000 2500
LL
° 2000 LL
2 1500 1000 500 0
ГШ
rh
rAd - + + +
Imm - - + -
LPS - - - +
Среда
rAd
rAd+Imm
rAd+LPS
□ CellTrace Violet (+) □ CellTrace Violet (-) a
Рис. 10. Паракринная передача сигналов усиления экспрессии rAd.
Культуру перитонеальных макрофагов инкубировали в течение 3 ч в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/мл), LPS (LPS, 10 мкг/мл) или без активаторов — белые столбики, после чего клетки трижды отмывали от активаторов раствором PBS и смешивали с клетками, предварительно меченными Celltrace Violet — серые столбики. Смесь полученных популяций трансфицировали rAd-GFP (100 БОЕ/кл) (rAd), в качестве отрицательного контроля — клетки без трансдукции (Среда). Через 24 ч анализировали уровень экспрессии GFP в обеих клеточных популяциях на проточном цитометре FACS Aria II. По оси ординат: (а) — средняя флюоресценция GFP (MFI GFP), (б) — разделение Celltrace Violet-положительных и Celltrace Violet-отрицательных популяций клеток; по оси абсцисс (б) представлено распределение флуоресценции GFP в двух популяциях макрофагов после их трансдукции rAd-GFP, указано процентное содержание GFP-положительных клеток (GFP+, %) в общей популяции клеток. Представлены средние значения и стандартные отклонения по трём экспериментам.
В роли таких паракринных сигналов вполне могут выступать провоспалительные цитокины. Косвенно об этом свидетельствуют описанные ранее результаты на клетках HEK-293 (см. рис. 7), в которых TNF-a активировал фосфорилирова-ние транскрипционного фактора NF-AB и усиливал экспрессию трансгена, регулируемого NF-AB-чувствительным промотором.
О паракринной передаче сигналов усиления экспрессии аденовирусных векторов свидетельствуют также результаты экспериментов, в которых супернатант от клеток, активированных агонистами TLR4, переносили к неактивированным клеткам (рис. 11). Для получения супернатанта перитонеаль-ные макрофаги предварительно в течение 1 ч активировали Иммуномаксом или LPS, после чего отмывали от агонистов TLR и инкубировали 24 ч в свежей культуральной среде. Полученный 24-часовой супернатант переносили интактным макрофагам, которые трансфицировали rAd-GFP. Экспрессию белка GFP в трансфицированных клетках анализировали на проточном цитометре. Из рис. 11, а видно, что эффекты
усиления экспрессии rAd передаются посредством суперна-танта. В случае экспрессии rAd-GFP в присутствии агонистов TLR (см. рис. 11, б) эффекты усиления выражены ярче, нежели в клетках, инфицированных в присутствии суперна-танта от активированных TLR-агонистами клеток (см. рис. 11, а). Это свидетельствует о неполной передаче изучаемых эффектов посредством супернатанта.
TNF-a — один из важнейших провоспалительных цито-кинов. Его продукция активируется в АПК агонистами TLR4 (рис. 12, а). Кроме того, TNFa является одним из наиболее сильных физиологических индукторов активации NF-AB в клетках, имеющих рецепторы TNF-a, в частности в анти-генпрезентирующих дендритных клетках и макрофагах [30]. Учитывая перечисленные сведения, мы исследовали влияние TNF-a на экспрессию rAd-GFP в макрофагах (см. рис. 12, б, в и г). Как и предполагалось, TNFa дозозависимым образом усиливал синтез целевого белка GFP (см. рис. 12, б), активируя транскрипцию его гена (рис. 15, в) и не оказывая влияния на количество аденовирусной ДНК, проникшей в клетку-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
+
CL LL.
CD
10-1
8-
6-
2-
25 п
20-
15-
+ CL
сз 10-
5-
rAd - + + +
SN, Imm - - + -
SN, LPS - - - +
rAd - + + +
SN, Imm - - + -
SN, LPS - - - +
Рис. 11. Передача сигналов усиления экспрессии rAd через супернатант клеток, активированных агонистами TLR4.
a — перитонеальные макрофаги инфицировали rAd-GFP (rAd) (100 БОЕ/кл) в присутствии су-пернатанта (SN) от клеток, предварительно активированных Иммуномаксом (SN, Imm), LPS (SN, LPS), или от клеток без активаторов. Для получения супернатанта клетки в течение 1 ч инкубировали в присутствии Иммуномакса (10 мкг/мл), LPS (10 мкг/мл) или без активаторов, после чего трижды отмывали от активаторов раствором PBS и инкубировали 24 ч в свежей среде. Полученный 24-часовой супернатант переносили интактным клеткам; б — перитонеальные макрофаги трансфицировали rAd-GFP (rAd) (100 БОЕ/кл) в присутствии Иммуномакса (Imm, 10 мкг/мл) или LPS (LPS, 10 мкг/мл), или без активаторов. Через 24 ч анализировали уровень экспрессии на проточном цитометре FACS Aria II. По оси ординат — процентное содержание GFP-положительных клеток (GFP+, %). Данные суммированы по результатам трёх независимых экспериментов. Представлены средние значения и стандартные отклонения по трём экспериментам.
мишень (см. рис. 15, г). Эти данные доказывают, что TNF-a играет ключевую роль в паракринной передаче сигналов активации транскрипции трансгена с TLR4-активированных макрофагов на неактивированные макрофаги.
Обсуждение
Рекомбинантные нереплицирующиеся аденовирусные векторы — эффективные инструменты доставки вакцинных антигенов в клетки мишени. Нереплицирующиеся аденовирусные векторы успешно трансфицируют АПК (дендритные клетки, макрофаги). Экспрессия rAd в АПК — это необходимое условие для образования комплексов пептидных фрагментов белка-антигена с молекулами MHC классов I и II, и презентации антигенных пептидов специфическим клонам Т-клеток при развитии адаптативного иммунного ответа на антиген, закодированный в rAd.
В нашей работе мы показали, что синтез закодированных в rAd белков в АПК может быть усилен путём активации клеток агонистами TLR4 (LPS, Иммуномакс) (см. рис. 2). Известно, что активация TLR-агонистами АПК приводит к их созреванию и усиленной экспрессии на их поверхности коактивационных молекул CD80, CD86 и CD40, необходимых для инициации ответа антиген-реактивных CD4+ и CD8+ Т-клеток. Оба процесса, индуцируемых TLR4-агонистом в АПК, — усиленная продукция целевого антигена и стимуляция экспрессии коактивационных молекул — вносят свой вклад в адъювантный эффект TLR4-агонистов при их совместном применении с ДНК-вакцинами. Так, ранее нами продемонстрировано, что применение фармацевтического TLR4-агониста Иммуномакса в качестве адъюванта противогриппозной аденовирусной вакцины позволяет повысить эффективность иммунизации против вируса гриппа [17].
Активация АПК агонистами TLR4 может влиять на различные стадии экспрессии rAd в клетке. Эти стадии хорошо различимы на рис. 1 — адсорбция рекомбинантных аденовирусных
частиц на клетке, проникновение rAd в клетку, выход ДНК вектора в цитоплазму, транспорт в клеточное ядро, активация транскрипции целевого гена, закодированного в ДНК вектора, трансляция целевого белка и его посттрансляционная модификация [22]. В нашей работе мы исследовали влияние TLR4-агониста на различные этапы экспрессии вектора в АПК.
Проникновение аденовирусного вектора в клетку-мишень начинается со связывания белка-фибера, представленного на поверхности псевдовирусных частиц, с рецепторами (CAR, CD46 и др.) На поверхности клетки. Затем пентон вирусной оболочки взаимодействует с клеточными корецепторами — интегринами (avp3, avp5, amp2, и a5p1) [31, 32]. В сочетании два взаимодействия приводят к кооперативному необратимому связыванию капсида с клеточной поверхностью и запуску интер-нализации вируса посредством клатрин-зависимого, рецептор-опосредованного эн-доцитоза и макропиноцитоза. В дополнение к указанным рецепторам, дендритные клетки способны осуществлять эндоцитоз, опосредованный DEC-205 и Fcy-рецепторами [33].
TLR-агонисты могут вызывать быструю стимуляцию процессов макропино-цитоза в АПК. Позднее они замедляются в результате истощения в активированной клетке активных форм ГТФаз семейства Rho, в частности Cdc42 [34].
В нашей работе мы доказали, что усиленная продукция белков, закодированных в составе rAd, не связана с более интенсивным проникновением вируса в клетки при активации агонистами TLR4 (см. рис. 3, 4). В разные сроки (от 1 до 24 ч) после трансфекции мы измеряли количество проникшей в клетки ДНК rAd и не обнаружили статистических различий между клетками, активированными агонистом TLR4, и клетками, трансфицированными rAd в отсутствие TLR4-агонистов, по количеству внутриклеточной ДНК rAd (см. рис. 3, а—в; 4).
После проникновения в клетку ДНК вектора транспортируется в ядро, где происходит транскрипция мРНК целевого гена, кодирующего антиген. Целевой антиген в составе rAd закодирован под контролем CMV-промотора. Энхансер в составе CMV-промотора содержит повторяющиеся консенсус-ные мотивы для сайтов связывания таких эукариотических факторов транскрипции, как NF-kB, CREB/ATF, SP-1, YYl, AP-1, SRE, ETS и др. [26—28]. От функционального состояния клетки зависит, какой из перечисленных транскрипционных факторов в большей мере повлияет на результат транскрипции генов под контролем CMV-промотора.
Агонисты TLR4 через адапторную молекулу Myd88 запускают в клетке сигнальный каскад, заканчивающийся активацией транскрипционного фактора NF-ffi. Действительно, в наших экспериментах под действием LPS и Иммуномакса в АПК происходила активация транскрипционной активности NF-ffi и усиленное накопление белка, ген которого закодирован составе rAd под контролем NF-ffi-зависимого CMV-промотора (см. рис. 5). Аналогичные результаты получены на NF-ffi-репортёрных линиях HEK-293.
Репортёрные линии HEK-293 — искусственно созданные системы для регистрации активации NF-ffi в клетке в ответ на внешние стимулы. Мы изучили эффекты усиления экспрессии ^d в клетках трёх линий HEK-293, HEK-293-TLR4/ MD2 и HEK-293-TLR3, на которых нет рецепторов TLR или экспрессированы TLR4 или TLR3. В HEK-293-TLR4/MD2
ORIGINAL ARTICLE
-0,0025-,
яГ a 0,002-| о ьс
o,ooi5
s 4 ш о
0 ~ m
Ь g
<в Р у —
1 о
о х
* Ï5
60-,
50-
4P 40-
+
0. 30-
LL-
CS
20-
10-
о-
■LPS
■ Imm
2 4 Время, ч а
1 3 10 TNF, нг/мл б
30
* Щ
X s
£
to
s Ч о о
0 ï
m л
& g
аз Р
1 s s р с о о х
* Б
0,35 0,3 -0,25 -0,2 -0,15 0,1 -0,05
0
[il
rAd - + + rAd - + +
TNF - - + TNF - - +
Рис. 12. Экспрессия рекомбинантного аденовирусного вектора в антигенпрезентирующих клетках под действием TNF-a.
а — индукция экспрессии мРНК TNF-a агонистами TLR4. Перитонеальные макрофаги в течение 0—8 ч активировали LPS (10 мкг/мл) или Imm (10 мкг/мл). Клетки лизировали и в полученных лизатах анализировали уровень экспрессии мРНК TNF-a методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров, мРНК ß-актина использовали в качестве внутреннего стандарта.
По оси ординат — относительный уровень экспрессии внутриклеточной мРНК TNF-a; б — усиление синтеза целевого белка GFP, закодированного в составе аденовирусного вектора под действием TNF-a. Перитонеальные макрофаги трансфицировали rAd-GFP в присутствии TNF-a (TNF, 0—30 нг/мл). Через 24 ч после трансфекции уровень экспрессии GFP анализировали на проточном цитометре FACS Aria II.
По оси ординат — процентное содержание GFP-положительных клеток (GFP+, %); в, г — проникновение рекомбинантного аденовирусного вектора в перитонеальные макрофаги и транскрипция в них мРНК целевого гена GFP под действием TNF-a. Перитонеальные макрофаги трансфицировали rAd-GFP (rAd) (100 БОЕ/кл) в присутствии TNF-a (TNFa, 10 нг/мл) или без активатора. Через 24 ч после трансфекции клетки лизировали, в полученных лизатах анализировали уровень экспрессии мРНК GFP (в) и ДНК GFP, проникшей в клетки при трансфекции (г), методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров. мРНК и ДНК ß-актина и использовали в качестве внутренних стандартов.
По оси ординат — относительный уровень внутриклеточной мРНК (в) и ДНК (г) GFP. Данные суммированы по результатам трёх независимых экспериментов. Представлены средние значения и стандартные отклонения по трём экспериментам.
и HEK-293-TLR3 связывание соответствующего агониста с TLR4 или TLR3 запускает внутриклеточный сигнальный путь, заканчивающийся активацией NF-ffi и синтезом репортёрно-го белка. Клетки HEK-293-null лишены TLR, но активация NF-ffi вполне возможна с помощью TNF-a через рецепторы этого цитокина. При трансфекции rAd всех трёх клеточных линий в присутствии соответствующих активаторов NF-ffi мы наблюдали усиленную продукцию целевого белка, закодированного в составе аденовирусного вектора (см. рис. 6). Следовательно, активация NF-ffi через рецепторы TLR4,
TLR3 или, минуя TLR-рецепторы, через рецептор цитокина TNFa приводит к усиленной экспрессии трансгена, введённого в клетки в составе генома rAd.
Было интересно проверить, возможна ли активация экспрессии целевого белка при использовании не аденовирусного вектора, а бактериальной плазмиды, в которой целевой ген находится под контролем CMV-промотора. Мы установили, что активация NF-ffi с помощью агониста TLR4 или цитокина TNF-a сопровождается усиленной экспрессией белка, ген которого введён в клетки в составе ДНК-плазмиды (см. рис. 7).
Известно, что активный транскрипционный фактор, взаимодействуя с регулятор-ными областями в ДНК (энхансер, промотор), активирует инициацию транскрипции мРНК генов, подконтрольных активируемому промотору. Мы исследовали интенсивность транскрипции мРНК целевых генов в составе rAd при активации трансфициро-ванных клеток агонистом TLR4. Оказалось, что агонисты TLR4 (LPS, Иммуномакс) активируют транскрипцию мРНК целевых генов rAd в клетках-мишенях (см. рис. 8). Aктивация агонистами TLR4 транскрипции мРНК целевых генов трёх разных белков (гемагглютинин H1N1, SEAP и GFP), закодированных в трёх rAd-векторах, была зарегистрирована нами в дендритных клетках, макрофагах и клетках макрофагальной линии RAW 264.7. Это важный результат, доказывающий, что агонисты TLR4 усиливают синтез целевого белка rAd на уровне транскрипции гена, кодирующего целевой белок.
Мы исследовали уровень фосфорили-рования elF-2a, одного из ключевых регуляторов трансляции белков в клетке [29], в активированных агонистами TLR4 клетках (см. рис. 9). В наших условиях в AПК клетках не происходит фосфорилирования elF-2a под действием агонистов TLR4. Следовательно, в клетках, активированных агонистами TLR4, не происходит изменений в белковом синтезе, но при этом в них наблюдается усиленное накопление целевых белков аденовирусного вектора. Полученные данные отменяют возможность более интенсивного накопления белков, закодированных в rAd, как результат действия агонистов TLR4 на их трансляцию.
Заключение
Представленные в данной работе результаты наших исследований позволили установить, что усиленное накопление в AПК целевого белка, закодированного в rAd, происходит в результате активации агонистами TLR4 транскрипционного фактора NF-ffi и транскрипции мРНК целевого гена, находящегося под контролем NF-ffi-чувствительного промотора. При этом не затрагиваются ни интенсивность проникновения вектора в клетки, ни механизмы регуляции трансляции, в частности фосфорилирование elF2a.
Мы обнаружили паракринную передачу сигнала усиления экспрессии rAd от клеток, активированных агонистом TLR4, к клеткам, не подвергшимся такой активации (рис. 10).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Этот эффект опосредуется провоспалительными цитокина-ми, в частности TNF-a. Следовательно, усиленная экспрессия трансгена в клетках, активированных TLR-агонистом, с помощью секретируемых цитокинов распространяется на клетки, не активированные TLR-агонистом.
Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы успешно применяются в целях генной иммунизации. Описанные в нашей работе механизмы действия агонистов TLR4 на экспрессию белков, закодированных в аденовирусных векторах, раскрывают некоторые механизмы адъювант-ного эффекта агонистов TLR при их совместном применении с ДНК-вакцинами.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
17. Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Шишкова Н.М., Мастернак Т.Б., Малкина Е.Ю., Ульянова Л.И., Стеценко О.Н. Клеточные механизмы иммуномодулирующего действия «Иммуномакса». Иммунология. 2005; 2: 111—20. 19. Атауллаханов P.P., Шмаров М.М., Седова Е.С., Логунов Д.Ю., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М. Рекомбинант-ная трёхвалентная вакцина от гриппа человека. Патент No W02013129961 A1 РФ, 2013.
references
1. Janeway C.A, Jr. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1989; 54(1): l—13.
2. Janeway C.A, Jr., Medzhitov R. Innate immune recognition. Ann. Rev. Immunol. 2002; 20: 197—216.
3. Schnare M., Barton G.M., Holt A.C., Takeda K., Akira S., Medzhitov R. Toll-like receptors control activation of adaptive immune responses. Nat. Immunol. 2001; 2: 947—50.
4. Takeda K., Kaisho T., Akira S. Toll-like receptors. Annu. Rev. Immunol. 2003; 21: 335—76.
5. Lodmell D.L., Ray N.B., Ulrich J.T., Ewalt L.C. DNA vaccination of mice against rabies virus: effects of the route of vaccination and the adjuvant monophosphoryl lipid A (MPL). Vaccine. 2000; 18: 1059—66.
6. Planelles L., Thomas M.C., Alonso C., Lopez M.C. DNA immunization with Trypanosoma cruzi HSP70 fused to the KMP11 protein elicits a cytotoxic and humoral immune response against the antigen and leads to protection. Infect. Immun. 2001; 69: 6558—63.
7. Lin C.C., Yang H.J., Tu C.F., Lai M.D. The opposing effects of li-popolysaccharide on the antitumor therapeutic efficacy of DNA vaccine. DNA Cell. Biol. 2008; 27(3): 151—7.
8. Van den Berg J.H., Quaak S.G., Beijnen J.H., Hennink, W.E., Storm, G., Schumacher, T.N. et al. Lipopolysaccharide contamination in intradermal DNA vaccination: toxic impurity or adjuvant? Int. J. Pharm. 2010; 390(1): 326.
9. Ohlschlager P., Spies E., Alvarez G., Quetting M., Groettrup M. The combination of TLR-9 adjuvantation and electroporationmediated delivery enhances in vivo antitumor responses after vaccination with HPV-16 E7 encoding DNA. Int. J. Cancer. 2011; 128(2): 473.
10. Tatsis N., Ertl H.C.J. Adenoviruses as vaccine vectors. Molecular Therapy. 2004; 10(4): 616—29.
11. Fuchs J.D., Bart P., Frahm N., Morgan C., Gilbert P.B., Kochar N. et al. Safety and Immunogenicity of a Recombinant Adenovirus Serotype 35-Vectored HIV-1 Vaccine in Adenovirus Serotype 5 Seronegative and Seropositive Individuals. J. AIDS Clin. Res. 2015; 6(5).
12. Ouedraogo A., Tiono A.B., Kargougou D., Yaro J.B., Ouedraogo E., Kabore Y. et al. A phase 1b randomized, controlled, double-blinded dosage-escalation trial to evaluate the safety, reactogenicity and immunogenicity of an adenovirus type 35 based circumsporozoite malaria vaccine in Burkinabe healthy adults 18 to 45 years of age. PloSone. 2013; 8(11): e78679.
13. Agnandji S.T., Huttner A., Zinser M.E., Njuguna P., Dahlke C., Fer-nandes J.F. et al. Phase 1 Trials of rVSV Ebola Vaccine in Africa and Europe. New Eng. J. Med. 2016; 374(17): 1647—60.
14. Kelly C., Swadling L., Capone S., Brown A., Richardson R., Hal-liday J. et al. Chronic hepatitis C viral infection subverts vaccine-induced T-cell immunity in humans. Hepatology. 2016.
15. Tameris M., Hokey D.A., Nduba V., Sacarlal J., Laher F., Kiringa G. et al. A double-blind, randomised, placebo-controlled, dose-finding trial of the novel tuberculosis vaccine AERAS-402, an adenovirus-vectored fusion protein, in healthy, BCG-vaccinated infants. Vaccine. 2016; 33(25): 2944—54.
16. Wille-Reece U., Flynn B.J., Lore K., Koup R.A., Miles A., Saul A. et al. Toll-like receptor agonists influence the magnitude and quality of memory T cell responses after prime-boost immunization in nonhuman primates. J. Exp. Med. 2006; 203(5): 1249—58.
17. Ataullakhanov R.I., Pichugin A.V., Shishkova N.M. Masternak T.B., Malkin E.Yu., Ulyanova L.I., Stetsenko O.N. Cellular mechanisms of immunomodulating action of «Immunomax». Immunologiya. 2005; 2: 111—20.
18. Shmarov M.M., Sedova E.S., Verkhovskaya L.V., Rudneva I.A., Bogacheva E.A., Barykova Y.A. et al. Induction of a protective het-erosubtypic immune response against the influenza virus by using recombinant adenoviral vectors expressing hemagglutinin of the influenza H5 virus. Acta Naturae. 2010; 2(1): 111—8.
19. Ataullahanov R.R., Shmarov M.M., Sedova E.S., Logunov D.Ju., Pichugin A.V., Ataullahanov R.I., Khaitov R.M. Recombinant trivalent vaccine against human influenza. Patent RF N WO2013129961 A1, 2013. (in Russian)
20. Ghochikyan A., Ataullakhanov R.I., Agadjanyan M., Pichugin A.V., Bagaev A.V. Method for the cancer treatment and prevention of metastatic disease. Patent No WO 2016069502 A1RU; 2016.
21. Bagaev A.V., Pichugin A.V., Lebedeva E.S., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Y. et al. Regulation of the target protein (transgene) expression in the adenovirus vector using agonists of Toll-like receptors. Acta Naturae. 2014; 23(6): 27—39.
22. Wolfrum N., Greber U.F. Adenovirus signalling in entry. Cel. micro-biol. 2013; 15(1): 53—62.
23. Inaba K., Inaba M., Romani N., Aya H., Deguchi M., Ikehara S. et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 1992; 176(6): 1693—702.
24. Graham F.L., Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. Gene transfer and expression protocols. 1991; 7: 109—28.
25. Berger J., Hauber J., Hauber R., Geiger R., Cullen B.R. Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene. 1988; 66(1): 1—10.
26. Stenberg R.M., Thomsen D.R., Stinski M.F. Structural analysis of the major immediate early gene of human cytomegalovirus. J. Virol. 1984; 49(1): 190—9.
27. Boshart M., Weber F., Jahn G., Dorsch H.K., Fleckenstein B., Schaffner W. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 1985; 41(2): 521—30.
28. Liu B., Hermiston T.W., Stinski M.F. A cis-acting element in the major immediate-early (IE) promoter of human cytomegalovirus is required for negative regulation by IE2. J. Virol. 1991; 65(2): 897—903.
29. Hinnebusch A.G. The elF-2a kinases: regulators of protein synthesis in starvation and stress. Seminars in cell biology. 1994; 5(6): 417—26.
30. Ozes O.N., Mayo L.D., Gustin J.A., Pfeffer S.R., Pfeffer L.M., Donner D.B. NF-кЬ activation by tumour necrosis factor requires the Akt serine—threonine kinase. Nature. 1999; 401(6748): 82—5.
31. Wickham T.J., Mathias P., Cheresh D.A., Nemerow G.R. Integrins a v ß 3 and a v ß 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. Cell. 1999; 73(2): 309—19.
32. Meier O., Greber U.F. Adenovirus endocytosis. J. Gene Med. 2004; 6(S1): S152-S163.
33. Platt C.D., Ma J.K., Chalouni C., Ebersold M., Bou-Reslan H., Carano R.A. Mature dendritic cells use endocytic receptors to capture and present antigens. Proc. Nat. Acad. Sci. 2010; 107(9): 4287—92.
34. Garrett W.S., Che L.M., Kroschewski R., Ebersold M., Turley S., Trombetta S. Developmental control of endocytosis in dendritic cells by Cdc42. Cell. 2000; 102(3): 325—34.
Поступила 07.08.17 Принята в печать 16.08.17
