CC BY
76
ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ
© коллектив авторов, 2015 удк 615.371.012.6.07
Багаев А.В.1, Пичугин А.В.1, Лебедева Е.С.1, Лысенко А.А.2, Шмаров М.М.2, Логунов Д.Ю.2, Народицкий Б.С.2, Атауллаханов Р.И.1, Хаитов Р.М.1, Гинцбург А.Л.2
влияние tlr-агонистов на экспрессию в антиген-презентирующих клетках целевого белка-антигена, закодированного в аденовирусном векторе
1ФГБУ Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России, 115478, Москва; 2ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва
Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы (rAd) представляют собой одну из самых перспективных платформ для создания генетических вакцин. Ген целевого антигена, вставленный в rAd-вектор, транскрибируется в клетках вакцинированного человека, в частности, в дендритных клетках и макрофагах, являющихся эффективными антиген-презентирующими клетками (АПК). Продукция целевого антигена в организме человека продолжается в течение 2-3 недель после введения rAd-вектора, кодирующего антиген. Это индуцирует развитие интенсивных реакций Т- и В-клеток, специфичных к целевому антигену.
Иммунные реакции на целевой антиген, закодированный в rAd, можно усиливать с помощью иммуноадъювантов, в частности, агонистов Toll-подобных рецепторов, которые стимулируют АПК в плане синтеза провоспалительных цитокинов и хемокинов, а также экспрессии ко-активационых молекул на клеточной мембране. Мы предположили, что наряду с перечисленными иммуностимулирующими эффектами, сочетанное применение агониста TLR и rAd, кодирующего целевой антиген, может приводить к усилению продукции целевого антигена в АПК. В данной работе показано иммуноадъювантное действие TLR'4-агониста (Иммуномакс) при иммунизации мышей BALB/c конструктом rAd-HA, содержащим ген гемагглютинина вируса гриппа H1N1. В условиях культуры клеток in vitro установлено, что прямое действие агониста TLR4 на антиген-презентирующие дендритные клетки достоверно повышает их эффективность в индукции ответа антиген-реактивных Т-клеток, секретирующих интерферон-гамма. Изучена экспрессия в дендритных клетках и макрофагах белковых антигенов, закодированных в rAd. На примере трех белков - цитоплазматического, мембранного и секреторного - показано, что TLR4-агонист, действительно, усиливает продукцию целевого белка в АПК. При этом увеличиваются как содержание целевого антигена в каждой клетке, производящей антиген, так и количество АПК, синтезирующих данный антиген. Сравнение Иммуномакса с агонистами различных TLR позволило установить, что агонисты TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 и TLR9 усиливают, а агонист TLR3, напротив, угнетает экспрессию целевых белков, закодированных в rAd.
Ключевые слова: антиген-презентирующие клетки; рекомбинантные аденовирусные векторы; экспрессия антигенов; агонисты Toll-подобных рецепторов.
Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(4): 188-195.
BagaevA.V.1, PichuginA.V.1, LebedevaE.S.1, LysenkoA.A.2, ShmarovM.M.2, LogunovD.Yu.2, NaroditskyB.S.2, Ataullakhanov R.I.1, Khaitov R.M.1, GintsburgA.L.2
INFLUENCE OF TLR-AGONISTS ON EXPRESSION BY ANTIGEN-PRESENTING CELLS OF THE TARGET PROTEIN ANTIGEN ENCODED IN ADENOVIRAL VECTOR
'«State scientific center "Institute of immunology», Federal medico-biological Agency of Russia, 115478, Moscow; 2«N. F. Gamaleya Federal research center of epidemiology and Microbiology» Ministry Of Health Of Russia, 123098, Moscow
Replication-defective recombinant adenoviral vectors (rAd) represent one of the advantageous platforms for development of genetic vaccines. A target gene inserted into rAd is transcribed in cells of the vaccinated human, namely in macrophages and dendritic cells which are effective antigen-presenting cells (APC). The target antigen production is continued in the human organism during 2-3 weeks following administration of rAd, encoding the antigen. It induces intensive responses of T- and B-cells specific to the target antigen.
Immune responses against the rAd-encoded target antigen can be enhanced with a use of immune adjuvants, in particular, agonists of Toll-like receptors which stimulate APC for production of pro-inflammatory cytokines and chemokines as well as expression of co-stimulatory receptors on the cell membrane. We hypothesized that a combined use o f TLR-agonists with the target antigen encoding rAd can enhance a production of the target antigen in APC, along with above mentioned immunostimulation effects.
In this work we showed an immunoadjuvant effect of TLR4-agonist (Immunomax) administered in BALB/c mice during their immunization with the rAd-HA construct comprising gene of H1N1 Influenza virus hemagglutinin. Using in vitro cell cultures a direct stimulation of antigen-presenting dendritic cells by the TLR4-agonist was revealed which significantly enhanced
Для корреспонденции: Атауллаханов Равшан Иноятович, ravshan.ataullakhanov@gmail.com For correspondence: Ataullakhanov Ravshan Inoyatovich, ravshan.ataullakhanov@gmail.com
the response of interferon-gamma secreting antigen-recognizing T cells. We examined expression of rAd-encoded protein antigens in dendritic cells and macrophages. Using cytoplasmic, membrane-bound and secretory target proteins, we showed that TLR4-agonist enhanced production of these three target proteins in APC. Both the number of APCs producing the antigen and the accumulation of the target protein in each antigen-producing cell were increased under influence of the TLR4-agonist. A comparison of Immunomax with agonists of other TLRs revealed that agonists of TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 and TLR9 enhanced, but the agonist of TLR3, unexpectedly, suppressed the expression of rAd-encoded target proteins.
Keywords: antigen-presenting cells; recombinant adenoviral vectors; antigen expression; agonists of Toll-like receptors.
citation: Immunologiya. 2015; 36(4): 188-195. (in Russian)
введение
Иммунизация нереплицирующимися рекомбинантными аденовирусными векторами (rAd) - один из современных эффективных методов вакцинации. Наиболее перспективными представляются генетические вакцины, созданные с использованием векторов на основе аденовирусов человека и шимпанзе. Иммунизация rAd является безопасной, так как вирусный вектор содержит делетированный геном и не способен к размножению в нормальных клетках [1]. Большинство препаратов на основе rAd находится в различных стадиях клинического изучения [2-6] и лишь один препарат зарегистрирован и применяется в медицине [7]. Несмотря на это, уже накоплено достаточно сведений, чтобы считать иммуногены и вакцины на основе rAd безопасными и эффективными. Не случайно, первая вакцина против лихорадки Эбола, клинические испытания которой начались осенью 2014 г., сделана на основе аденовирусного вектора [8].
Иммунные реакции на целевой антиген, закодированный в rAd, можно усиливать с помощью агонистов Toll-подобных рецепторов (TLR) [4, 9]. В отечественной кандидатной rAd-вакцине против гриппа А и В в качестве адъюванта использован Иммуномакс, агонист TLR4 [9-11]. Препарат активирует антиген-представляющие клетки (АПК), в частности дендритные клетки и макрофаги. В дендритных клетках Иммуно-макс индуцирует усиленную экспрессию ко-активационных молекул, а именно CD80, CD86, CD40, MHC класса II и, кроме того, секрецию иммуностимулирующих цитокинов IL1ß, TNFa, IL6, IL8, IL12 [12, 13].
Мы предположили, что наряду с перечисленными иммуностимулирующими эффектами, сочетанное применение Имму-номакса и rAd, кодирующего целевой антиген, может приводить к усилению продукции целевого антигена в АПК. В данной работе изучена экспрессия в дендритных клетках и макрофагах белковых антигенов, закодированных в rAd. На примере трех белков - цитоплазматического, мембранного и секреторного
- показано, что Иммуномакс, действительно, усиливает продукцию целевого белка в АПК. При этом увеличиваются как содержание целевого антигена в каждой клетке, производящей антиген, так и количество АПК, синтезирующих данный антиген. Сравнение Иммуномакса с агонистами различных TLR позволило установить, что агонисты TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 и TLR9 усиливают, а агонист TLR3 подавляет экспрессию целевых белков, закодированных в rAd.
Mатeриал и методы
Антитела и реагенты
В работе были использованы агонисты Toll-подобных рецепторов: TLR2 - липотейхойевая кислота (LTA); TLR3
- синтетический аналог двухцепочечной РНК - полиинози-новая кислота : полицитидиловая килота (Poly[I:C]); TLR4
- липополисахарид (LPS) из E. coli серотип 055:B5 (Sigma L-2880), а также монофосфорильное производное липида А (MPL-A); TLR5 - флагеллин; TLR7 и TLR8 - имиквимод; TLR9 - синтетический олигонуклеотид ODN-CpG 1826. Все агонисты, кроме LPS, произведены Invivogen.
Животные
Мыши линии BALB/c, самки 8-10-недельного возраста, были получены из питомника «Столбовая», содержались на стандартной диете в стандартных условиях вивария ГНЦ Институт иммунологии ФМБА.
Культуры клеток
Все культуры клеток инкубировались в полной среде (ПС), составленной из DMEM с 25 мМ HEPES, дополненной коктейлем заменимых аминокислот, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mM L-глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ p-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы ПанЭко). Культуры клеток инкубировали при 37оС в увлажненной атмосфере 5% CO2 в воздухе.
Суспензии первичных клеток селезенки, костного мозга и брюшной полости мышей приготавливали общепринятыми методами. Дендритные клетки получали in vitro дифференцировкой клеток костного мозга мышей BALB/c в присутствии гранулоцитарного макрофагального коло-ниестимулирующего фактора (GM-CSF, granulocyte-macrophage colony stimulating factor). Костный мозг вымывали из бедренных и больших берцовых костей мыши, эритроциты удаляли осмотическим лизисом, ядросодержащие клетки дважды отмывали фосфатным буферным раствором (PBS, Amresco E404), после чего культивировали в полной среде с добавлением 10 нг/мл GM-CSF (Sigma) в течение 7 дней, как описано в [14]. К окончанию этого срока неадгезионные клетки содержали 70-75% дендритных клеток. Адгезионная часть культуры была на 95% представлена макрофагами. Для получения макрофагов сначала осторожно удаляли неадгезионные клетки, оставшийся монослой адгезионных клеток отмывали PBS (0,5% БСА), затем приливали раствор Версена (ПанЭко) и выдерживали в течение 1 часа при 4оС, после чего макрофаги смывали PBS (0,5% БСА).
Перитонеальные макрофаги получали путем вымывания клеток из перитонеальной полости интактных мышей BALB/c с помощью PBS, дополненного 1% глюкозы, 10 mM HEPES и 0,5% БСА. Клетки осаждали центрифугированием, суспензировали в ПС, культивировали в течение 18-20 ч при 37oC в атмосфере 5% CO2. Затем не прилипшие к пластику клетки удаляли осторожным промыванием куль-туральной средой и PBS. Более 90% оставшихся на пластике адгезионных клеток были представлены макрофагами.
нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы со вставкой целевого гена
Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы rAd-SEAP, rAd-GFP и rAd-HA со вставкой целевых генов секреторной эмбриональной щелочной фоcфатазы (SEAP), зеленого флуоресцентного белка (GFP), гемагглюти-нина вируса гриппа H1N1, соответственно, получали на основе плазмиды pShuttle-CMV, согласно рекомендациям производителя «AdEasy Adenoviral vector system» (Stratagene, Cat. 240009), используя плазмидные конструкции pGREEN (Carolina Biological Supply Company), p310D (pRcCMV-SEAP) и pAL-HA (обе собственного изготовления). Наличие генов белков GFP, SEAP, HA в составе соответствующих плазмид-ных конструкций pShuttle-CMv-GFP, pShuttle-CMv-SEAP, pShuttle-CMV-HA подтверждали рестрикционным анализом при использовании эндонуклеаз EcoRI, NotI и EcoRV и методом ПЦР.
Наличие целевых генов GFP, SEAP и HA в составе соответствующих rAd подтверждали методом ПЦР. Титры препаратов rAd-GFP, rAd-SEAP и rAd-HA анализировали методом бляшкообразования в культуре клеток линии HEK293 [15].
Иммунизация животных. Мыши BALB/c, по 10 особей в группе, были иммунизированы однократно интраназально rAd-HA в дозе 107 БОЕ/мышь. В двух экспериментальных группах rAd-HA (107 БОЕ) вводили вместе с фармацевтическим иммуномодулятором «Иммуномакс» в дозах 5 мкг или 10 мкг (в расчете на мышь). Мышам контрольной группы был введен PBS. Через 4 недели после иммунизации мышей умерщвляли, извлекали селезенки, суспензии клеток селезенки готовили стандартным методом.
Определение числа INFy-производящих клеток методом ELISPOT
Метод ELISPOT осуществлялся согласно рекомендациям производителя (Mouse IFN-y ELISPOT Set, BD Bioscience, USA). В лунки специальных планшет, покрытые антителом к IFN-y, вносили по 10 000 дендритных клеток на лунку. Использовали два вида дендритных клеток: (а) активированные LPS (1мкг/мл) в течение 19 ч и (б) транс-дуцированые rAd-HA (10-100 БОЕ на клетку) в течение 19 ч. Затем к дендритным клеткам, активированным LPS (способ «а»), добавляли раствор рекомбинантного ге-магглютинина вируса гриппа H1N1 (1 мкг/мл). Поверх слоя дендритных клеток наносились клетки селезенки (0,5 млн/лунку) мышей контрольных или иммунизированных групп. После 19 ч совместной инкубации клетки лизировали в буфере от производителя, после чего наносились детектирующие антитела в два этапа - биотинили-рованные антитела к IFN-y, а затем конъюгат стрептави-дина с пероксидазой. Проявление мест связывания INF-y осуществлялось с помощью BD™ AEC Substrate Reagent Set (BD Bioscience, USA). Анализировалось количество образовавшихся пятен (spots), выявляющих локализацию клеток, секретирующих INF-y.
Трансдукция клеток нереплицирующимися рекомби-нантными аденовирусными векторами
Культуры клеток трансдуцировали rAd-SEAP, rAd-GFP или rAd-HA из расчета 7-200 БОЕ на клетку. Трансдукция клеток осуществлялась в 50 мкл бессывороточной среды OpTmizer™ (GIBCO) в течение 1 ч, затем в культуры клеток вносили 150 мкл ПС. Трансдуцированные клетки культивировали в присутствии TLR4-агониста Иммуномакса (10 мкг/мл) или без него в течение 1-6 дней. При исследовании влияния других агонистов TLR клетки инкубировали в присутствии LTA (1 мкг/мл), Poly[I:C] (10 мкг/мл), LPS (10 мкг/мл), MPL-A (5 мкг/мл), флагеллина (0,1 мкг/мл), имиквимода (1 мкг/мл) или ODN-CpG 1826 (10 нг/мл).
Трансдукция нереплицирующимися рекомбинантны-ми аденовирусными векторами in vivo
Для трансдукции восприимчивых клеток in vivo мышам BALB/c в брюшную полость вводили rAd-SEAP в количестве 108 БОЕ в 200 мкл физиологического раствора NaCl вместе с 10 мкг Иммуномакса или без него (по 4 мыши в каждой экспериментальной группе).
Экспрессию введенного трансгена оценивали по концентрации целевого белка SEAP в крови мышей. Для этого через 3 суток после введения rAd-SEAP у мышей забирали кровь из ретро-орбитального синуса, получали сыворотку крови и в индивидуальных образцах сыворотки измеряли содержание SEAP.
Измерение интенсивности продукции белков SEAP, GFP и HA, закодированных в rAd
Продукцию целевого секреторного белка SEAP в сыворотке крови или культуральной среде определяли по методу [16] с незначительными модификациями. Тестируемую жидкость осветляли центрифугированием 14 000 об/мин в течение 2 мин, затем прогревали при 65оС в течение 5 мин. Субстрат пара-нитрофенил фосфат вносили в реакционном буфере (0,5М CaCO3, 0,5 мМ MgCl2, рН 9.8), оптическую плотность измеряли на длине волны 405 нм. Активность SEAP выражали в мЕ/мл, считая, что 1 мЕ/мл соответствует увеличению оптической плотности 0,04 ед. в 1 минуту.
Продукцию GFP в анализируемых клетках определяли методом проточной цитофлуориметрии на FACS Aria II (BD
Biosciences). Величина средней интенсивности флюоресценции определялась при лазере 488 нм в канале 520/50. Идентификацию популяций клеток осуществляли путем окрашивания суспензии смесью меченных флуорохромом антител к поверхностным белкам CD11b, CD11c, CD19, Ly6G, F4/80 с последующим анализом на цитофлуориметре FACS Aria II.
Экспрессию целевого мембранного белка HA определяли с помощью окрашивания клеток моноклональными антителами к HA с последующим анализом методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACS Aria II.
Статистическая обработка данных
Все результаты представлены в виде средних значений и соответствующих величин стандартного отклонения. Для установления значимости различия данных применялся /-критерий Стьюдента.
Результаты
Иммуномакс усиливает Т-клеточный ответ мышей на иммунизацию rAd-HA
Количество Т-клеток памяти, формирующихся в результате иммунизации - одна из основных характеристик эффективности иммуногенов и вакцин. Для проверки адъю-вантного действия Иммуномакса мы иммунизировали мышей rAd-HA (107 БОЕ, интраназально) вместе с Иммуно-максом или без него. Через 4 недели после иммунизации методом ELISPOT было исследовано количество INF-y продуцирующих Т-клеток, специфически распознающих антигены гемагглютинина вируса гриппа H1N1. Клетки селезенки исследуемых мышей были реактивированы in vitro рекомбинантным гемагглютинином H1N1 в присутствии дендритных клеток, способных к презентации пептидов Т-клеткам. Для повышения эффективности презентации пептидов перед «нагрузкой» антигеном дендритные клетки были активированы LPS.
Результаты исследования свидетельствуют, что иммунизация мышей rAd-HA совместно с Иммуномаксом индуцировала более эффективную генерацию Т-клеток, распознающих эпитопы гемаглютинина вируса гриппа, чем иммунизация rAd-HA без Иммуномакса. Количество Т-клеток, производящих IFN-y в ответ на рестимуляцию гемагглютинином вируса гриппа, было в 2 раза выше в селезенках мышей, иммунизированных rAd-HA с Имму-номаксом, по сравнению с количеством таких клеток в селезенках контрольных мышей, иммунизированных только rAd-HA (рис. 1). Стоит отметить, что использованный в этих опытах вариант реактивации Т-клеток дендритными клетками, «нагруженными» растворимым рекомбинант-ным белковым антигеном (гемагглютинин), выявляет CD4 Т-клетки, поскольку пептидные фрагменты растворимого антигена представляются в комплексе с молекулами MHC класса II.
стимуляция Иммуномаксом повышает способность дендритных клеток индуцировать ответ антиген-реактивных Т клеток in vitro
Трансдуцированные rAd-HA дендритные клетки синтезируют гемагглютин вируса гриппа H1N1, презентируют его пептидные фрагменты в комплексе с молекулами MHC класса I и способны реактивировать CD8 Т-клетки, специфичные к гемагглютинину. В селезенке мышей, иммунизированных интраназально rAd-HA в дозе 107 БОЕ, через 4 недели после иммунизации накапливается около 300 Т-клеток (в расчете на 1 млн клеток селезенки), реагирующих in vitro секрецией INF-y при реактивации дендритными клетками, трансдуциро-ванными rAd-HA. Такое большое количество специфических к антигену Т-клеток памяти (~0,5 х 10-4 от всех Т-клеток селезенки) индуцировано иммунизацией rAd-HA и представлено, главным образом, CD8 Т-клетками. Это подтверждает высокую иммуногенность rAd-конструктов и Th1-поляризацию иммунного ответа, развивающегося на такую иммунизацию.
В той же схеме эксперимента по реактивации in vitro Т-клеток памяти, полученных из селезенки иммунизиро-
х ®
1§ 2 *
s £
5 5
p
2-s
200
150
100
50
T
о
Иммунизация
rAd-HA Иммуномакс (мкг/мышь)
ДК-LPC + + +
- 5 10
ДК-ЛПС+rHA - + + +
- - 5 10
Рис. 1. Количество INF-y производящих клеток (метод ELISPOT) в культуре клеток селезенки мышей, иммунизированных rAd-HA (аденовирусный конструкт со вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа H1N1).
Группы по 5 мышей были вакцинированы интраназально rAd-HA дозой 107 БОЕ/мышь, контрольные мыши получали фосфатный буфер. Двум группам мышей при интраназальной иммунизации совместно с rAd-HA вводили раствор Иммуномакса (5 или 10 мкг/мышь соответственно). Через 4 нед после иммунизации получали клетки селезенки, которые объединяли в пулы в пределах экспериментальной группы. Реактивацию in vitro Т-клеток, специфичных к гемагглютинину H1N1, производили с помощью антиген-презентирующих дендритных клеток, активированных LPS (1 мкг/мл), а затем нагруженных рекомбинантным гемагглю-тинином вируса гриппа H1N1 (ДК-LPS + rAd-HA). Контрольные дендритные клетки (ДК-LPS) были активированы LPS, но не нагружались антигеном.
Здесь и на рис. 3-6: * -p < 0,05.
0 s
5> I § 03
x §
ä о S *
ц
1
600
400"
200-
_ я U. I
600 -i r~*~ 1 i-1
400-
200-
ДК 1 ДК+rAd-HA 1
I Без иммунизации Иммунизация rAd-HA
12 3
Рис. 2. Иммуноадъювантное действие Иммуномакса при активации антиген-презентирующих дендритных клеток in vitro (а). Мышей вакцинировали интраназально rAd-HA дозой 107 БОЕ/мышь). Контрольным мышам интраназально вводили PBS. Через 4 нед после иммунизации мышей забивали, получали суспензии клеток селезенки, которые объединяли в пулы в пределах экспериментальной группы (5 мышей в каждой группе). При исследовании методом ELISPOT клетки селезенки рестимулировали in vitro дендритными клетками, трансдуцированными rAd-HA (ДК + rAd-HA) или контрольными дендритными клетками (б). Клетки селезенки мышей, вакцинированных интраназально rAd-HA в дозе 107 БОЕ/мышь, были исследованы методом ELISPOT при реактивации дендритными клетками, трансдуцированными rAd-HA (i), либо дендритными клетками, трансдуцированными rAd-HA при дополнительной активации Иммуномаксом в концентрациях 1 мкг/мл (2) или 10 мкг/мл (3). После трансдукции rAd-HA и активации Иммуномаксом дендритные клетки отмывали перед совместным культивированием с клетками селезенки.
ванных Ad-HA мышей, в качестве антиген-презентирующих использовали дендритные клетки, которые трансдуцирова-ли Ad-HA и дополнительно активировали Иммуномаксом. Оказалось, что дополнительно активированные Иммуномак-сом антиген-презентирующие клетки стали стимулировать в 2 раза больше Т-клеток, продуцирующих у-интерферон в тесте ELISPOT (рис. 2, б). В данной постановке эксперимента Иммуномакс был использован не в качестве вакцинного адъюванта, а в качестве активатора дендритных клеток in vitro. Иммуномакс индуцирует выработку дендритными клетками цитокинов IL1p, TNNFa, IL6, IL8, IL12, а также увеличивает количество ко-активационных молекул CD80, CD86 на поверхности этих клеток [12]. Поэтому увеличение числа реагирующих на гемаглютинин Т-клеток могло быть связано как с усилением презентационных свойств дендритных клеток, так и с усилением выработки антигена (гемаглютинин) в клетках, дополнительно активированных Иммуномаксом при трансдукции rAd-HA.
Усиление продукции антиген-реактивных Т-клеток в организме мышей при их иммунизации Ad-HA и одновременной стимуляции Иммуномаксом (см. рис. 1) тоже могло быть связано, как минимум, с двумя причинами - с усиленной продукцией антигена в дендритных клетках, а также с усиленной презентацией ко-активационных молекул и секрецией иммуностимулирующих цитокинов.
Экспрессия целевого белка (антигена), закодированного в rAd, усиливается при активации антиген-презентирующих клеток Иммуномаксом
Нереплицирующиеся rAd трансдуцируют эпителиальные клетки и эффективно экспрессируют целевой трансген в этом типе клеток. rAd вполне успешно экспрессируются в первичных дендритных клетках и макрофагах мыши. При введении rAd-GFP в культуры клеток селезенки, костного мозга или перитонеальных макрофагов мы наблюдали экспрессию це-
левого трансгена в дендритных клетках, макрофагах и грану-лоцитах селезенки.
Мы исследовали влияние фармацевтического аго-ниста TLR4 (Иммуномакс) на экспрессию в антиген-презентирующих клетках модельного белка GFP, закодированного в rAd. Для этого in vitro одновременно с трансдукцией rAd-GFP дендритные клетки активировались Иммуномаксом. Такая стимуляция клеток приводила к увеличению процента дендритных клеток, экспрессирующих GFP, а также интенсивности продукции GFP (рис. 3). Подобное усиление экспрессии rAd-GFP мы наблюдали и в макрофагах перитонеальной полости, а также в культурах макрофагов костного мозга.
Использованный нами конструкт Ad-GFP экспресси-ровался продукцией цитоплазматического GFP, поэтому было интересно проверить, как повлияет Иммуномакс на экспрессию трансгенов, кодирующих секреторный и мембранный белки. В этих экспериментах были использованы rAd-SEAP, кодирующий секреторную эмбриональную фос-фатазу, и rAd-HA, кодирующий мембранную форму гемаг-глютинина. Именно этот вариант rAd-HA был использован в описанных выше экспериментах по иммунизации мышей (см. рис. 1, 2). Экспрессию SEAP оценивали по концентрации этого целевого белка в культуральной жидкости, а экспрессию HA в клеточной мембране измеряли методом проточной цитометрии клеток, меченных моноклональными антителами к HA.
На рис. 4, а представлены результаты изучения экспрессии rAd-SEAP в дендритных клетках и перитонеальных макрофагах мыши. Из представленных данных видно, что Им-муномакс усиливает экспрессию секреторного белка SEAP, закодированного в rAd-SEAP. В экспериментах на моноцитах человека, трансдуцированных rAd-HA, Иммуномакс вызывал усиление экспрессии целевого мембранного белка HA, закодированного в векторе (см. рис. 4, с).
у0 Костномозговые
. с дендритные клетки
15
10-
+ а.
LL
О 5
о-1
~~i-1-1-г~
0 1 2,5 5 Ad-GFP (БОЕ ■ 105/мл)
% Зп
2-
1 -
~~i-1-1-г~
0 1 2,5 5
Ad-GFP (БОЕ ■ 10=/мл)
% 80 -,
60-
40-
20-
Перитонеальные макрофаги
-1-1-
1 2,5 !
Ad-GFP (БОЕ ■ 105/мл) б
%
3-
2 -
1 -
О
1 2,5 Ad-GFP (БОЕ ■ 105/мл)
Костномозговые макрофаги
0 1 2,5 Ad-GFP (БОЕ ■ 105/мл)
15
10
5 -
1 2,5 Ad-GFP (БОЕ ■ 105/мл)
Рис. 3. Влияние агониста TLR4 (Иммуномакс) на экспрессию GFP в дендритных клетках и макрофагах. Костномозговые дендритные клетки, перитонеальные макрофаги и макрофаги костного мозга трансдуцировали rAd-GFP и инкубировали в течение 4 сут в присутствии Иммуномакса (10 мкг/мл) или без активаторов (среда). Клетки анализировали на проточном цитометре FACS Aria II после окрашивания смесью меченных флуорохромом антител.
По оси абсцисс - доза rAd-GFP, использованная для трансдукции клеток, или дни после трансдукции (правая вертикаль), по оси ординат - процент GFP-позитивных клеток (а); средняя интенсивность флуоресценции (MFI), нормированная на значение в контроле без активатора (б). Представлены средние значения и стандартные отклонения по 3 экспериментам. 1 - Иммуномакс, 2 - среда.
Усиление экспрессии rAd Иммуномаксом наблюдается не только in vitro, но и in vivo
Успех иммунизации векторами типа rAd прямо зависит от интенсивности продукции целевого белка (антигена), закодированного в rAd. Мы изучили влияние Иммуномакса на продукции белка, закодированного в rAd, в организме лабораторных мышей. Поскольку измерение продукции мембранного гемагглютинина в организме мыши затруднительно, мы использовали вектор, кодирующий секреторную фосфатазу, точное измерение которой в сыворотке крови легко осуществимо. Вектор rAd-SEAP вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 108 БОЕ в 200 мкл физиологического раствора NaCl. Интенсивность продукции целевого белка SEAP определяли по концентрации SEAP в крови животных через 3 дня после инъекции rAd-SEAP. Опытным мышам вместе с rAd-SEAP вводили Иммуномакс. Контрольным мышам вместе с вектором вводили физиологический раствор. Результаты, представленные на рис. 4, б, свидетельствуют, что введение Иммуномакса приводило к достоверному усилению продукции в организме мыши белка SEAP, закодированного в векторе rAd-SEAP.
Усиление экспрессии rAd в антиген-презентирующих клетках происходит под влиянием агонистов TLR2, 4, 5, 7/8 и 9
Иммуномакс является агонистом TLR4 и оказывает усиливающее влияние на экспрессию целевого гена в составе rAd в дендритных клетках и макрофагах. Было интересно, будут ли оказывать подобное действие другие агонисты TLR4, например LPS и MPL-A. Кроме того, было интересно изучить возможное влияние агонистов других TLR на экспрессию трансгенов, введенных в клетки в составе rAd. На рис. 5 представлены данные, доказывающие, что LPS усиливает экспрессию трансгенов, как и Иммуномакс. Интересно, что монофосфорильное производное липида А (MPL-A), являющееся минимальным действующим началом LPS, тоже активировало экспрессию rAd-GFP. Более того, агонисты TLR2, 5, 7/8 и 9, подобно агонистам TLR4, оказывали стимулирующее влияние на экспрессию GFP, введенного в составе rAd-GFP.
Poly[I:C], агонист TLR3, в отличие от агонистов TLR2, 4, 5, 7/8 и 9, вызывал не усиление, а угнетение продукции белка (см. рис. 5), закодированного в rAd-векторе, что может быть связано с известным противовирусным действием Poly[I:C].
Принципиально важным представляется тот факт, что усиливающее действие агонистов TLR на экспрессию rAd не является следствием образования комплекса rAd с агонистом или облегчения вхождения rAd в клетки. Это
с s
Ш S
О. <
Ш ОТ
Костномозговые дендритные клетки
0 0,01 0,1 1 10 Иммуномакс, мкг/мл
1,0 0,8
I 0,6
ш s û_
SS 0,4
от
0,2-
0,0
Перитонеальные макрофаги
0,01 0,1 1 Иммуномакс, мкг/мл
-1— 10
с s ш s
CL <
ш от
50 -
40 -
30 -
20 -
10 -
ФР
Иммуномакс
о s
О) s
2
< I
8 "I
6 -
4 -
2 -
"I-1-Г
0 1 5
Иммуномакс, мкг/мл
Рис. 4. Влияние агониста TLR4 (Иммуномакс) на экспрессию в культурах клеток in vitro и в организме мышей целевого секреторного белка (SEAP).
Целевой секреторный белок (SEAP), закодированный в ДНК аденовирусного вектора (а). Костномозговые дендритные клетки и перитонеальные макрофаги мыши трансдуцировали rAd-SEAP (5 105 БОЕ в 1 мл) и инкубировали в течение 4 сут в присутствии указанных концентраций Иммуномакса. Интенсивность продукции целевого белка определяли по содержанию SEAP (мЕ/мл) в культуральной жидкости (б). Концентрация целевого белка SEAP в крови мышей через 3 дня после введения rAd-SEAP совместно с Иммуномаксом или без него. Опытным мышам (n = 4) в перитонеальную полость вводили rAd-SEAP в количестве 108 БОЕ на мышь с 10 мкг Иммуномакса в 200 мкл физиологического раствора NaCl. Контрольным мышам (n = 4), вместо Иммуномакса, вводили 200 мкл физиологического раствора (ФР). Через 3 сут определяли содержание SEAP в сыворотке крови мышей (в). Мононуклеарные клетки периферической крови человека трансдуцировали Ad-HA (5 107 БОЕ в 1 мл) и инкубировали в течение 2 сут в присутствии Иммуномакса или без него. По окончании инкубации методом проточной цитометрии определяли процент гемагглютинин-позитивных клеток.
было показано в экспериментах с отмыванием rAd перед внесением в культуру клеток агониста TLR4 (иммуномакс, LPS) или, наоборот, путем отмывания агониста TLR4 перед трансдукцией клеток rAd. В обоих вариантах экспериментов эффект усиления экспрессии rAd не отличался от варианта одновременного добавления к клеткам rAd и TLR-агониста (рис. 6).
Обсуждение
Рекомбинантные аденовирусные векторы, кодирующие целевой антиген, - современный и довольно перспективный подход к созданию новых вакцин. Относительно небольшое время, необходимое для конструирования и наработки аденовирусных векторов, делает их универсальной платформой для получения вакцин, как от сезонных, так и от пандемических штаммов вируса гриппа. Известно, что доставка гена гемагглютинина вируса гриппа птиц в составе аденовирусного вектора в клетки животных индуцирует протективный гетеросубтипиче-ский перекрестный иммунный ответ не только против вирусов гриппа внутри одного подтипа, но и против вирусов гриппа разных подтипов, относящихся к одному клайду [6]. В результате такой иммунизации формируется большое количество CD4 и CD8 Т-клеток памяти, от-
вечающих выработкой интерферона-гамма при встрече с антигенами вируса гриппа (см. рис. 1 и 2).
Ранее мы показали эффективность использования фармакологического TLR4-лиганда Иммуномакса в качестве адъю-ванта при иммунизации rAd, кодирующими гемагглютинин вируса гриппа [9, 10]. При этом мы наблюдали увеличение протективных свойств rAd-вакцины и возможность уменьшения вакцинирующей дозы rAd в 5-10 раз при совместном использовании с Иммуномаксом. Анализ иммунной памяти, проведенный в данной работе, показал, что и количество Т-клеток, распознающих специфические антигены вируса гриппа, тоже значительно увеличивается после вакцинации rAd в сочетании с Иммуномаксом (см. рис. 1). Наряду с этим, усиливаются и антиген-презентирующие свойства дендритных клеток, участвующих в представлении антигенов Т-клеткам (см. рис. 2).
Для эффективной индукции клеточных и гуморальных иммунных реакций на целевой белковый антиген необходимо, чтобы, во-первых, на поверхности антиген-презентирующих клеток происходила экспрессия пептидных фрагментов белка-антигена в комплексе с молекулами MHC классов I и II. Во-вторых, на поверхности тех же клеток должна происходить экспрессия ко-активационных молекул CD80, CD86 и cD40, обеспечивающих активацию специфических к ан-
+ CL
сэ
£ ^ V*" # #
Ж V Л> <s> ov ^ ^
// V- JT ^ «V сЯ
<Г Jt
Рис. 5. Влияние различных агонистов Toll-подобных рецепторов на трансдукцию и экспрессию rAd-SEAP и rAd-GFP в макрофагах мыши. Макрофаги перитонеальной полости мыши трансдуцировали Ad-GFP 5^107 БОЕ/мл, а затем инкубировали в течение 4 сут в присутствии агонистов различных TLR. По окончании инкубации определяли содержание (процент) GFP-позитивных клеток. В опыте были использованы следующие концентрации указанных агонистов: LTA (1 мкг/мл), Poly[I:C] (10 мкг/мл), Иммуномакс (10 мкг/мл), LPS (10 мкг/мл), MPL-A (5 мкг/ мл), флагеллин (1 мкг/мл), имиквимод (1 мкг/мл), ODN-CpG 1826 (10 нг/ мл). Представлены средние значения и стандартные отклонения.
%
80 -, 60 -
о
Р 40-
+ о_
LL
сэ
20 -
СЭ
Иммуномакс ЛПС Вирус отмыт
а *
Среда Иммуномакс Иммуномакс
отмыт
%
100 П
80- i
60-
40- T '///,
20- m V///
П- m
тигену Т-клеток при контакте с антиген-презентирующей клеткой. Оказалось, что активация Иммуномаксом антиген-презентирующих клеток, трансдуцированых аденовирусными конструкциями, приводит к усиленной продукции целевых белков, закодированных в rAd-векторе (см. рис. 3 и 4). Подобное усиление экспрессии транетена мы наблюдали и при использовании агонистов TLR2, TLR4, TLR5, TLR7/8 и TLR9 рецепторов (см. рис. 5). Важно, что эффект увеличения продукции целевого белка, закодированного в rAd, при совместном использовании с агонистом TLR показан нами не только в культурах клеток in vitro, но и в организме мыши (см. рис. 4, б).
Полученные данные позволяют объяснить механизмы адъювантного эффекта агониста TLR4 при вакцинации вектором rAd, кодирующим целевой антиген. Введение в организм rAd со вставкой гена целевого белка обеспечивает продукцию белка-антигена в течение 2-3 нед. Сочетание rAd с агонистом TLR4 позволяет достичь более высоких концентраций целевого антигена, чем при использовании только rAd. Одновременно с усиленной продукцией антигена антиген-презентирующие клетки усиливают экспрессию ко-активационных молекул CD80, CD86, CD40, а также секрецию иммуностимулирующих цитокинов IL1p, TNFa, IL6, IL8, IL12. Совокупность указанных событий вполне достаточна для индукции усиленного иммунного ответа и иммунной памяти при со-четанной вакцинации rAd и агонистом TLR4. Такой же механизм может обеспечивать адъювантное действие и агонистов других TLR.
Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы могут быть использованы не только для иммунизации, но и для генной терапии. Описанные в данной работе эффекты агонистов TLR на экспрессию трансгенов, закодированных в аденовирусных векторах, намечают перспективное направление - разработку способов направленной регуляции экспрессии трансгенов в организме. В идеале могут быть разработаны методы, которые позволят после введения трансгена в организм больного произвольно усиливать или
Рис. 6. Усиление экспрессии rAd-GFP при последовательном (раздельном) использовании rAd-GFP и агонистов TLR4. а - перитонеальные макрофаги (2-104 на лунку) инкубировали в полной культуральной среде в присутствии Иммуномакса (10 мкг/мл) в течение 4 ч, затем клетки трижды отмывали PBS, после чего в культуры вносили rAd-GFP (70 БОЕ на клетку). Через 24 ч культивирования при 37°С в СО2-инкубаторе культуральную жидкость заменяли на раствор Версена (ПанЭко) и культуры оставляли на 1 ч при 4°С, затем клетки смывали PBS c 0,5% БСА и анализировали содержание GFP-позитивных клеток на цитофлуориметре FACS Aria II (б). Перитонеальные макрофаги (2-104 на лунку) инкубировали в течение 2 ч в полной культуральной среде с добавлением rAd-GFP (70 БОЕ на клетку), после чего часть лунок трижды отмывали PBS, а затем вносили полную культуральную среду с Иммуномаксом (10 мкг/мл) или LPS (3 мкг/мл). Контролем служили аналогичные культуры без активатора. Через 24 ч клетки снимали раствором Версена и анализировали содержание GFP-позитивных клеток на цитофлуориметре FACS Aria II.
подавлять экспрессию целевого белка, в зависимости от текущей задачи.
ЛИТЕРАТУРА
1. Van Kampen K.R., Shi Z., Gao P. Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans. Vaccine. 2005; 23 (8): 1029-36.
2. Arama C., Assefaw-Redda Y., Rodriguez A., Fernández C., Corradin G., Kaufmann S.H. et al. Heterologous prime-boost regimen adenovector 35-circumsporozoite protein vaccine/ recombinant Bacillus Calmette-Guérin expressing the Plasmodium falciparum circumsporozoite induces enhanced long-term memory immunity in BALB/c mice. Vaccine. 2012; 30 (27): 4040-5.
3. Hoft D.F., Blazevic A., Stanley J., Landry B., Sizemore D., Kpa-megan E. et al. A recombinant adenovirus expressing immunodominant TB antigens can significantly enhance BCG-induced human immunity. Vaccine. 2012; 30 (12): 2098-108.
4. Scallan C.D., Tingley D.W., Lindbloom J.D., Toomey J.S., Tucker S.N. An adenovirus-based vaccine with a double-stranded RNA adjuvant protects mice and ferrets against H5N1 avian in-
fluenza in oral delivery models. Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20 (1): 85-94.
5. Sharma A., Tandon M., Bangari D.S., Mittal S.K. Adenoviral vector-based strategies for cancer therapy. Curr. Drug Ther. 2009; 4 (2): 117-38.
6. INGN 201: Ad-p53, Ad5CMV-p53, adenoviral p53, p53 gene therapy-introgen, RPR/INGN 201. Drugs R. D. 2007; 8 (3): 176-87.
7. Pearson S., Jia H., Kandachi K. China approves first gene therapy. Nature Biotechnol. 2004; 22 (1): 3-4.
8. Phase 1 Clinical Trials of NIAID/GSK Investigational Ebola Vaccine. 28 August 2014. Available at: http: //www.niaid.nih. gov/news/QA/Pages/EbolaVaxQA.aspx).
9. Атауллаханов P.P., Шмаров М.М., Седова Е.С., Логунов Д.Ю., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М. Реком-бинантная трехвалентная вакцина от гриппа человека. Патент W02013129961 A1, PCT/RU2012/000366, 2013.
10. Shmarov M.M., Sedova E.S., Verkhovskaya L.V., Rudneva I.A., Bogacheva E.A., Barykova Y.A. et al. Induction of a protective heterosubtypic immune response against the Influenza virus by using recombinant adenoviral vectors expressing hemagglutinin H5 Vi4rus. Acta Naturae. 2010; 2 (1): 111-8.
11. Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В, Шишкова Н.М., Мастернак Т.Б., Малкина Е.Ю., Ульянова Л.И., Стеценко О.Н. Клеточные механизмы иммуномодулирующего действия препарата «Иммуномакс». Иммунология. 2005; 2: 111-20.
12. Пичугин А.В., Багаев А.В., Чулкина М.М., Бержицкая Д.А., Шишкова Н.М., Атауллаханов Р.И. Иммуномодулятор «Иммуномакс» активирует дендритные клетки. Иммунология. 2015; 36(4).
13. Мельникова Т.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М. Способ получения вещества, обладающего антимикробной, противовирусной и иммуностимулирующей активностью, в частности, в отношении дендритных клеток, вещество, полученное этим способом, и фармацевтическая композиция на его основе. Заявка на патент RU 2013151824, приоритет 21.11.2013.
14. Inaba K., Inaba M., Romani N., Aya H., Deguchi M., Ikehara S. et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/ macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 1992; 176: 1693-702.
15. Graham F.L., Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. Meth. Mol. Biol. 1991; 7: 109-27.
16. Berger J., Hauber J., Hauber R., Geiger R., Cullen B.R. Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene. 1988; 66(1): 1-10.
Поступила 11.03.15
references
1. Van Kampen K.R., Shi Z., Gao P. Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans. Vaccine. 2005; 23 (8): 1029-36.
2. Arama C., Assefaw-Redda Y., Rodriguez A., Fernández C., Cor-radin G., Kaufmann S.H. et al. Heterologous prime-boost regimen adenovector 35-circumsporozoite protein vaccine/recom-
binant Bacillus Calmette-Guerin expressing the Plasmodium falciparum circumsporozoite induces enhanced long-term memory immunity in BALB/c mice. Vaccine. 2012; 30 (27): 4040-5.
3. Hoft D.F., Blazevic A., Stanley J., Landry B., Sizemore D., Kpa-megan E. et al. A recombinant adenovirus expressing immunodominant TB antigens can significantly enhance BCG-induced human immunity. Vaccine. 2012; 30 (12): 2098-108.
4. Scallan C.D., Tingley D.W., Lindbloom J.D., Toomey J.S., Tucker S.N. An adenovirus-based vaccine with a double-stranded RNA adjuvant protects mice and ferrets against H5N1 avian influenza in oral delivery models. Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20 (1): 85-94.
5. Sharma A., Tandon M., Bangari D.S., Mittal S.K. Adenoviral vector-based strategies for cancer therapy. Curr. Drug Ther. 2009; 4 (2): 117-38.
6. INGN 201: Ad-p53, Ad5CMV-p53, adenoviral p53, p53 gene therapy-introgen, RPR/INGN 201. Drugs R. D. 2007; 8 (3): 176-87.
7. Pearson S., Jia H., Kandachi K. China approves first gene therapy. Nature Biotechnol. 2004; 22 (1): 3-4.
8. Phase 1 Clinical Trials of NIAID/GSK Investigational Ebola Vaccine. 28 August 2014. Available at: http: //www.niaid.nih. gov/news/QA/Pages/EbolaVaxQA.aspx).
9. Ataullakhanov R.R., Shmarov M.M., Sedova E.S., Logunov D.Yu., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I., Khaitov R.M. Recombinant Trivalent Vaccine Against Human Influenza. Patent RF N W02013129961 A1, PCT/RU2012/000366, 2013. (in Russian)
10. Shmarov M.M., Sedova E.S., Verkhovskaya L.V., Rudneva I.A., Bogacheva E.A., Barykova Y.A. et al. Induction of a protective heterosubtypic immune response against the Influenza virus by using recombinant adenoviral vectors expressing hemagglutinin of the Influenza H5 Virus. Acta Naturae. 2010; 2(1): 111-8.
11. Ataullakhanov R.I., Pichugin A.V., Shishkova N.M., Masternak T.B., Malkina E.Yu., Ul'yanova L.I., Stetsenko O.N. Cellular mechanisms of immunomodulatory action of "Immunomax". Immunologiya. 2005; 2: 111-20. (in Russian)
12. Pichugin A.V., Bagaev A.V., Chulkina M.M., Berzhitskaya D.A., Shishkova N.M., Ataullakhanov R.I. Immunomodulator "Immunomax" activates dendritic cells. Immunologiya. 2015; 36(4). (in Russian)
13. Mel'nikova T.M., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I., Khaitov R.M. A Method of Producing a Substance with Antimicrobial, Antiviral and Immunostimulating Activity, in Particular, on Dendritic Cells, a Substance Produced by this Method and its Pharmaceutical Compositions. Russian Patent Application RU 2013151824, priority date: November 21, 2013. (in Russian)
14. Inaba K., Inaba M., Romani N., Aya H., Deguchi M., Ikehara S. et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/ macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 1992; 176: 1693-702.
15. Graham F.L., Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. Meth. Mol. Biol. 1991; 7: 109-27.
16. Berger J., Hauber J., Hauber R., Geiger R., Cullen B.R. Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene. 1988; 66 (1): 1-10.
Received 11.03.15
