CC BY
30
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 612.112.95.014.467:612.017.1.083
Чулкина М.М., Багаев А.В., Лебедева Е.C., Гараева А.Я., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И.
СИНЕРГИЧЕСКАЯ АКТИВАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ inos, ifn-ß, il12p40, il6, tnf-a ПРИ ОДНОВРЕМЕННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НА МАКРОФАГИ АГОНИСТАМИ РЕЦЕПТОРОВ TLR4, TLR9 И NOD2
Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115478, Москва, Россия
Воздействие комбинацией двух или нескольких агонистов рецепторов, распознающих молекулярные образы патогенов, способствует синергической активации клеток иммунной системы и, в конечном счёте, определяет эффективность иммунной защиты от инфекции. В работе исследовали влияние тройной комбинации агонистов NOD2, TLR4 и TLR9 на активацию транскрипции генов провоспалительных цитокинов tnf-a, il6, ill2p40; интерферона I типа (ifn-в) и гена inos в макрофагах мыши, полученных из костного мозга. В широком диапазоне концентраций каждого агониста сравнили эффективность активации макрофагов тройной комбинацией, парными сочетаниями или отдельными агонистами. Показано, что использование двойных и тройных сочетаний агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 позволяет индуцировать усиленную реакцию макрофагов по продукции мРНК генов цитокинов tnf-a, il6, il12p40 и защитных противомикробных субстанций ifn-в и inos. Тройное сочетание агонистов индуцировало более интенсивную транскрипцию генов il12p40 и inos по сравнению с парными сочетаниями тех же агонистов. По продукции мРНК tnf-a активация тремя агонистами не имела преимущества по отношению к сочетаниям двух агонистов. Полученные данные свидетельствуют о синергетическом усилении ответа на уровне транскрипции генов провоспалительных цитокинов и противомикробных субстанций при комбинированном воздействии на макрофаги агонистами рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2.
Ключевые слова: макрофаги; паттерн-распознающие рецепторы; транскрипция генов; синергизм; цитокины;
противомикробные субстанции. Для цитирования: Чулкина М.М., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Гараева А.Я., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Синергическая активация транскрипции генов inos, ifn-fi, il12p40, il6, tnf-a при одновременном воздействии на макрофаги агонистами рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2. Иммунология. 2018; 39(4): 178-185. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-178-185
Chulkina M.M., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Garaeva A.Ya., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. SYNERGISTIC ACTIVATION OF inos, ifn-p, il12p40, il6, tnf-a GENES TRANSCRIPTION IN MACROPHAGES UNDER SIMULTANEOUS INFLUENCE WITH AGONISTS OF TLR4, TLR9 AND NOD2 RECEPTORS
National Research Center - Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115478, Moscow, Russia
Combined stimulation of two or more pattern recognition receptors (PRRs) can synergistically activate cells of immune system and ultimately confer effective immune defense against infections. Here, we evaluated the activation impact of the triple composition of TLR4, TLR9 and NOD2 receptors' agonists on mouse bone marrow-derived macrophages according to mRNA-expression of tnf-a, il6, il12p40 cytokines as well as ifn-p and inos genes. Macrophage response to the triple agonistic composition was compared to the one induced with the same PRR-agonists used as a paired or single compounds. It was shown that macrophage stimulation with the paired or triple combinations of NOD2, TLR4 and TLR9 agonists induced much stronger, synergistic, expression of tnf-a, il6, il12p40, ifn-p and inos mRNA as compared to the transcription induced by the same agonists used alone. Triple was stronger than paired combination of PRR-agonists in induction of il12p40 and inos, but not of tnf-a genes transcriptional response in macrophages. Our data suggest that concordant stimulation of TLR4, TLR9 and NOD2 receptors synergistically induces macrophage response on the level of proinflammatory cytokines and antimicrobial compounds genes' transcription.
Keyword: macrophage; PRR; gene transcription; synergism; cytokines; antimicrobial compounds.
For citation: Chulkina M.M., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Garaeva A.Ya., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Synergistic
activation of inos, ifn-fi, il12p40, il6, tnf-a genes transcription in macrophages under simultaneous influence with agonists of
TLR4, TLR9 andNOD2 receptors. Immunologiya. 2018; 39(4): 178-185. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-
39-4-178-185
For correspondence: Ravshan I. Ataullakhanov, MD, PhD, Prof., Head of the Department of Immune Biotechnology, NRC Institute of Immunology FMBA, Russia, E-mail: [email protected]
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The work was supported by the grant of RPF15-15-00102.
Received 16.07.18 Accepted 16.09.18
Для корреспонденции: Атауллаханов Равшан Иноятович, д-р мед. наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, E-mail: [email protected]
Введение
Клетки организма человека и животных оснащены рецепторами PRR (pathogen-associated molecular patterns), распознающими молекулярные образы бактерий, вирусов, грибов, гельминтов и других патогенов. Связывание с PRR молекулярных структур патогена активирует клетки врождённого иммунитета и способствует развитию защищающих от патогена адаптивных иммунных реакций [1]. PRR локализуются в различных компартментах клетки: плазматической мембране (например, TLR4), в эндосомах и фагосомах (например, TLR9) и в цитозоле (например, NOD2). Активация клеток агонистами PRR запускает внутриклеточные сигнальные каскады, что индуцирует экспрессию большого количества генов, вовлеченных в защиту от патогена [2].
Макрофаги и дендритные клетки в обилии представлены на границах нашего организма с внешним миром. Именно здесь происходит вторжение различных патогенов и именно здесь макрофаги и дендритные клетки среди первых защитников встречают как патогенные организмы, так и их макромолекулы, несущие оригинальные молекулярные образы патогенов. При этом срабатывает не один, а несколько типов рецепторов, узнающих патоген, поэтому особую актуальность приобретают исследования интеграции внутриклеточных сигналов, идущих с различных PRR [3, 4]. Изучение совместного действия нескольких агонистов PRR позволяет моделировать процессы микробных и вирусных инфекций и разрабатывать эффективные препараты на основе представлений о механизмах работы врожденного иммунитета. Одновременная сигнализация с нескольких рецепторов может выражаться в положительной (синергетический) или отрицательной (антагонистический) регуляции возможных иммунных реакций [4, 5]. Взаимное влияние двух или большего числа сигнальных путей может изменять амплитуду, кинетику и качество реакций клеток иммунной системы [6, 7]. Основываясь на данных об усилении иммунного ответа при активации нескольких PRR, разрабатываются и внедряются в практику вакцинные адъюванты, включающие композицию нескольких агонистов [7, 8].
В ряде экспериментальных работ было показано, что одновременная активация нескольких типов PRR может оказывать синергетическое иммуностимулирующее действие, что приводит к усиленной продукции провоспалительных цитокинов и антимикробных пептидов [8-13]. Описан синергизм между TLR2/4 и NOD2 (10-12,14); TLR4 и TLR9 [15,16]; NOD2 и TLR9 [17] на уровне продукции цитокинов. В тоже время существуют данные, что в определенных условиях происходит ингибирование одного PRR-сигнального пути при активации другого. Например, NOD2 способен ингибировать провоспалительный ответ, вызванный TLR2/4 [18], а при взаимодействии агонистов TLR4 и TLR9 предварительная обработка одним из лигандов модулирует провос-палительный ответ [12].
В единичных исследованиях применяли более двух аго-нистов PRR. Так, одновременное использование агонистов TLR2/6, TLR3, TLR9 повышало эффективность вакцинации белком оболочки ВИЧ [19], а комбинация TLR4+TLR7+TLR9 увеличивала кросс-презентацию антигена in vitro [20].
Регуляция ответа клеток на комбинированное воздействие двумя или более агонистами PRR может происходить на разных молекулярных уровнях - через интеграцию внутриклеточных сигнальных путей, изменение транскрипции генов, а также через модификацию продукции белков, определяющих ответ клетки на агонисты PRR [3,13]. В настоящей работе мы исследовали на уровне транскрипции генов про-воспалительных цитокинов и противомикробных субстанций ответы макрофагов мыши на активацию одиночными агонистами TLR9, TLR4 и NOD2, их парными сочетаниями или тройным комплексом TLR9+TLR4+NOD2. Показано,
ORIGINAL ARTICLE
что использование двойных и тройного сочетаний агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 позволяет индуцировать усиление ответа макрофагов по продукции мРНК иммуностимулирующих цитокинов TNFa, IL6, IL12, а также защитных IFNß и фермента iNOS, производящего NO. Для синергического усиления транскрипции генов tnf-a, il6, il12p40, ifn-ß и inos в первичных макрофагах мыши мы установили оптимальные концентрации агонистов PRR при их использовании в сочетаниях по два и три.
Методы
Реактивы
В работе были использованы агонисты Toll-подобных рецепторов: липополисахарид из E. coli серотип 055:B5 (LPS, агонист TLR4, Sigma, L-2880), ODN CpG-1826 (CpG, агонист TLR4, Invitrogen), L18-MDP (MDP, агонист NOD2-рецептора, Invitrogen).
Животные
Мышей линии BALB/c в возрасте 8-10 нед, полученных из питомника «Столбовая», содержали на стандартной' диете в стандартных условиях вивария ГНЦ Института иммунологии ФМБА.
Культуры клеток
Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM с 25 мМ HEPES, дополненной коктейлем заменимых аминокислот, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ ß-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы фирмы ПанЭко) при 37 оС в увлажненной атмосфере с 5 % С02.
Макрофаги получали in vitro дифференцировкой клеток костного мозга мышей BALB/c в присутствии гранулоци-тарного макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF, granulocyte-macrophage colony stimulating factor). Костный мозг вымывали из бедренных и больших берцовых костей мыши, эритроциты удаляли осмотическим лизисом, ядросодержащие клетки дважды отмывали PBS, после чего культивировали в ПС с добавлением 10 нг/мл GM-CSF (Sigma) в течение 7 дней как описано в [14]. Адгезионная часть культуры была на 95 % представлена макрофагами. Для получения макрофагов сначала осторожно удаляли неадгезионные клетки, оставшийся монослой адгезионных клеток промывали (PBS, 0,5% BSA), выдерживали в растворе Версена (ПанЭко) в течение 1 ч при 37 °С, после чего макрофагов смывали (PBS, 0,5 % BSA).
Активация макрофагов
Клетки рассеивали в 96 луночный плейт в количестве 50 тыс./лунка в ПС, инкубировали ночь, затем добавляли активаторы в полной среде. При активации несколькими ли-гандами к клеткам добавляли смесь активаторов. Активацию ставили в дублях или триплетах для каждого экспериментального варианта. Клетки помещали в термостат на определённые временные промежутки. По окончании времени активации из лунки осторожно убирали среду и немедленно добавляли лизирующий раствор для выделения РНК, содержащий гуанидин-изотиоционат и фенол.
ПЦР в реальном времени
Выделение РНК проводили коммерческим набором «РНК-Экстран» (производство «Синтол», Россия), согласно инструкции производителя. Осадок нуклеиновых кислот растворяли в 10 мкл mQ, обработанной DEPC, далее проводили обработку ДНКазой (производство Thermo Scientific, США) (1 мкл 30 мин при 37 0C, инактивировали ДНКазу 1 мкл 25mM EDTA 10 мин при 65 0C). Отжиг праймера для ОТ (Random-primers, Синтол, Россия) проводили при 65 0C 5 мин, после чего пробы немедленно охлаждали на льду. Реакцию обратной транскрипции проводили, используя коммерческий набор реагентов для обратной транскрипции (производство «Синтол», Россия), согласно инструкции производителя. Полученную кДНК ис-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
пользовали для ПЦР в режиме реального времени. Постановку ПЦР ставили в дублях, в анализе использовали среднее значение порогового цикла (Ср) дублей. Последовательности праймеров и зондов (синтез «Синтол», Россия), использованных в исследовании приведены в табл. 1.
Для проведения ПЦР и детекции флюоресценции использовали детектирующий амплификатор DTprime4 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) с программным обеспечением, предоставляемым производителем прибора (Деа1-Тте_РСЯ у.7.3)
Программа амплификации:
94 0С -5 мин
94 ОС -10 сек
62 ОС -20 сек * 40 циклов
72 ОС - 5 сек
10 ОС - хранение
Примечание. * - на этом этапе производится измерение флюоресценции.
Уровень относительной экспрессии мРНК целевых генов вычисляли, используя ДДСр метод [21], по формуле:
□ =2(Cp -Cp ), где
4 *норм. гена ^иссл. гена7'
Cp (норм. гена) - значение порогового цикла нормировочного гена, автоматически определяемое прибором (среднее по дублям);
Cp (иссл. гена) - значение порогового цикла исследуемого гена, автоматически определяемое прибором (среднее по дублям).
В качестве нормировочного гена использовали ß-actin. Для каждого опыта вычисляли отношение значения экспрессии исследуемого гена в активированных образцах к контрольному значению. Проведено два независимых эксперимента, приводится среднее по экспериментам.
статистическая обработка данных
Все результаты представлены в виде средних значений и соответствующих величин стандартного отклонения. Достоверное отличие измеренного отклика от парного воздействия (прирост относительно контрольного значения) от линейного суммирования прироста от двух лигандов, посчитанно по непараметрическому критерию Уилкоксона-Манна-Уитни (Wilcoxon—Mann-Whitney test, WMW) [22] Для оценки изменения при действии трех лигандов относительного парного воздействия использовали t-test.
результаты и обсуждение
Регуляция синтеза и секреции цитоки-нов может происходить на разных молекулярных уровнях [23, 24]. Ранее нами было показано, что в основе действия парных сочетаний агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 лежит активация транскрипции генов про-воспалительных цитокинов [25], также мы отмечали увеличение продукции цитокинов при парных сочетаниях [26]. Мы предположили, что комбинированное сочетание трех агонистов может дополнительно влиять на транскрипцию генов, кодирующих белки, продукция которых усиливается при активации, в частности цитокины и хемокины. Для проверки этого предположения мы провели эксперименты по изучению интенсивности транскрипции генов провоспалительных цитокинов, интерферонов и противоинфек-ционных защитных веществ. Методом количественной RT-PCR в широком диапазоне концентраций было исследовано влияние агонистов NOD2, TLR4 и TLR9 на активацию транскрипции генов, кодирующих провоспалительные цитокины TNF-a, IL6, IL12p40; интерферон I типа; iNOS - фер-
мент, обеспечивающий продукцию активных форм азота. На макрофагах мыши, полученных из костного мозга, была исследована роль отдельных агонистов NOD2, TLR4 и TLR9, а также их парных и тройного сочетаний.
Блияние сочетанного воздействия лигандов TLR4, TLR9 и NOD2 на продукцию мРНК генов провоспали-тельных цитокинов tnf-a и il6.
Выработка провоспалительных цитокинов макрофагами в ответ на стимуляцию PRR является важным этапом реализации защитных программ организма. Цитокинами острой фазы воспаления являются TNF- а и IL-6, с их действием связано увеличение проницаемости сосудов, активация и вовлечение других клеток в воспалительный процесс. Если TNF- а является пирогенным цитокином, одним из первых вырабатывается на действие патогена и выступает как «мастер-цитокин» воспаления, то IL-6 является прейотроп-ным и обладает как провоспалительными, так и противо-спалительными функциями и влияет на многие процессы, в том числе иммунные ответы, восстановление повреждённых тканей [27].
Нами было обнаружено усиление транскрипции гена tnf-a при парных сочетаниях агонистов рецепторов NOD2+TLR9 и NOD2+TLR4. На рис. 1 показана концентрационная зависимость уровня продукции мРНК костномозговых макрофагов в ответ на двухчасовую стимуляцию агонистами NOD2, TLR4 и TLR9, и их сочетаниями относительно контроля (клетки без активации). Как следует из графика, парное сочетание агонистов NOD2+TLR9 увеличивало продукцию мРНК гена tnf-a относительно активации одиночными агонистами только при высокой концентрации CpG-ODN (1 мкг/мл) (рис. 1, а). Парное сочетание агонистов NOD2+TLR4 только при низкой концентрации MDP увеличивало продукцию мРНК, при увеличении концентрации MDP до 1 мкг/мл усиления продукции мРНК tnf-a не наблюдали (рис. 1, б). Такая концентрационная зависимость эффекта усиления транскрипции этого гена согласуется с нашими предыдущими данными [25)]. При тройном сочетании активаторов достоверного изменения экспрессии мРНК гена tnf-a относительно парных сочетаний не наблюдали, кроме того, при увеличении концентрации LPS при тройном сочетании лигандов отмечено снижение уровня мРНК (рис. 1, в).
В литературе имеются сообщения [8, 26] о подобном синергизме в продукции мРНК tnf-a при активации клеток агонистами нескольких PRR. В то же время Kim и др. [11]
Таблица 1
Последовательности праймеров, использованных в работе
№ Ген Название праймера 5'->3' последовательность
1 b-actin b-actin-F AGAGGGAAATCGTGCGTGAC
b-actin-R CAATAGTGATGACCTGGCCGT
b-actin-TP FAM-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-RTQ
2 tnfa TNF-F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA
TNF-RV TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC
TNF-TP FAM-CACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGA-RTQ
3 il-6 IL6-F GAGGATACCACTCCCAACAGACC
IL6-RV AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
IL6-TP FAM-CAGAATTGCCATTGCACAACTCTTTTCTCA-RTQ
4 ifnb IFNb-F ACCACAGCCCTCTCCATC
IFNb-RV GCATCTTCTCCGTCATCTCC
IFNb-TP FAM-CAACCTCACCTACAGGGCGGAC-RTQ
5 inos iNOS-FW CAG CTG GGC TGT ACA AAC CTT
iNOS-RV CAT TGG AAG TGA AGC GTT TCG
iNOS-TP FAM -CGG GCA GCC TGT GAG ACC TTT GA - RTQ
ORIGINAL ARTICLE
ES
г о
¡I
о со
0 ÇÛ
S 8.
1 i i I
ш О
1- JÇ.
120 100 80 60 40 20 0
NOD2+TLR9
^т GpG-ODN 0 v-7-л CpG-ODN 0 2 I-I CpG-ODN 1
no LPS
MOP 0 M DP 0.2
MDP 1
NOD2+TLR9+TLR4
Mi GpG-ODN 0 Г7-7\ CpG-ODN 0.2 I-1 CpG-ODN 1
LPS 0.02
MDP 0 MDP0 2
NOD2+TLR9+TLR4
MDP 1
^m GpG-ODN 0 CZ23 CpG-ODN 0.2 i-1 CpG-ODN 1
MDP 0
MDP 0.2
MDP 1
Рис. 1. Изменение относительной экспрессии мРНК гена Ш/-а через 2 ч стимуляции костномозговых макрофагов сочетаниями агонистов NOD2+TLR9 (а), NOD2+TLR4 +TLR9 (б, в) в диапазоне концентраций активаторов.
Здесь и на рис. 2-5: Представлено среднее по трём экспериментальным повторам. * - достоверное изменение экспрессии мРНК при парном сочетании агонистов относительно одиночных активаторов; ** - достоверное изменение экспрессии мРНК при тройном сочетании относительно парных сочетаний. Концентрации активаторов приведены в мкг/мл.
не наблюдали синергизма по продукции мРНК tnf-a при действии NOD2+TLR4. Синергизм другой пары агонистов - TLR4 и TLR9 - по продукции мРНК гена tnf-a в костномозговых макрофагах мыши через усиление МАРК сигнал-линга был описан De Nardo и др. [15], однако в их работе синергизм достигался при предварительной обработке клеток LPS с последующей отмывкой от лиганда. Можно предположить, что различия в экспериментальных данных разных исследовательских групп по эффектам совместного действия нескольких PRR связаны с зависимостью этих эффектов от типа клеток, последовательности воздействия агонистами, времени между воздействиями, концентрации лигандов и других методических деталей [5]. Известно, что экспрессия гена tnf-a регулируется на транскрипционном уровне работой нескольких факторов, включая NFkB и NF-AT, а также на уровне трансляции через UA- повторы в З'-концевой последовательности мРНК [29]. Возможно, при воздействии на клетки разными типами и комбинациями агонистов PRR используются разные клеточные механизмы этой регуляции, что и приводит к разным результатам воздействия.
Для гена il6 мы показали усиление продукции мРНК при сочетании лигандов NOD2 и TLR9, причём эффект усиления связан с концентрацией CpG-ODN и проявлялся при максимальной концентрации этого агониста (рис. 2, а). LPS является мощным активатором транскрипции гена il6, различия между эффектами при использовании 20 и 100 нг/мл LPS не были существенными. Воздействие комплексом трех агони-стов LPS+CpG-ODN+MDP1 вызывало более интенсивную транскрипцию мРНК il6 по сравнению с парными сочетаниями тех же лигандов только при концентрации LPS 20 нг/мл (рис. 2, б). При увеличении концентрации агониста TLR4 наблюдалось снижение продукции мРНК при дополнительной стимуляции CpG-ODN и MDP1 (рис. 2, в).
Транскрипция мРНК интерферона-в в макрофагах, активированных тройной комбинацией агонистов TLR4, TLR9 и NOD2
Интерфероны I типа индуцируют транскрипцию большой группы генов, участвующих в противовирусной защите, а также в активации ключевых этапов врождённого и адаптивного иммунитета, включая созревание антигенпрезентирую-щих клеток и продукцию цитокинов для активации Т-клеток, В-клеток и NK-клеток [31]. Активация транскрипции гена ifn-в через различные PrR, а также усиление продукции мРНК при совместной стимуляции нескольких PRR описаны для антигенпрезентирующих клеток [32, 33].
В наших экспериментах стимуляция макрофагов одиночным агонистом NOD2 не активировала транскрипцию мРНК ifn-ft, а агонист TLR9 вызывал слабую активацию продукции мРНК ifn-ft. Однако при более высоких концентрациях CpG-ODN и MDP1 наблюдается кооперация этих двух агонистов в усилении транскрипции гена ifn-ft (рис. 3, а). При концентрации 20 нг/мл LPS парные сочетания агонистов TLR4+NOD2 и TLR4+TLR9 индуцировали усиленную транскрипцию мРНК ifn-в по сравнению с действием одиночных лигандов. Добавление третьего агониста к указанным парным сочетаниям не влияло на продукцию мРНК ifn-ft (рис. 3, б). При увеличении концентрации LPS синергический эффект TLR4+NOD2 сохранялся, но при добавлении третьего лиганда TLR9 наблюдали снижение транскрипции гена ifn-fí (рис. 3, в). Тройное сочетание агонистов TLR4+TLR9+NOD2 при высокой концентрации LPS и MDP1, но низкой концентрации CpG-ODN даёт усиление продукции мРНК ifn-fí по сравнению с парными сочетаниями агонистов (см. рис. 3, в).
Интересным является тот факт, что при отсутствии стимуляции транскрипции гена ifn-fi одиночным лигандом к NOD2, наблюдается усиление сигнала при парной стимуляции TLR4+NOD2 и NOD2+TLR9. Это согласуется с данными Herskovits и др., показавшими усиление выработки интерферона при совместной активации NOD2+TLR3 [33]. Кроме
а
б
в
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
х
»1
О
I?
1 а
600 500 400 300 200 100
NOD2+TLR9
GpG-ODN Q ZZ2 CpG-ODN 0 2 a CpG-ODN 1
no LPS
MDP 0.2
NOD2+TLR9+TLR4
600
Й
1
tL ■=-
2
® S
_ ПЗ
5 о
Е 5
■i GpG-ODN 0 егз cpg-odn о г **
ZZt CpG-ODN 1
LPS 0,02
MDP 0 MDP 0.2
NOD2+TLR9+TLf!'t
Ш GpG-ODN О ГР~71 CpG-ODN 0 2 CpG-ODN 1
LPS 0.1
MDP 0 MDP 0 2
MDP 1
Рис. 2. Изменение относительной экспрессии мРНК гена И6 через 2 ч стимуляции костномозговых макрофагов сочетаниями агонистов :ЫОЭ2+ТЪК9 (а), :Ы002+ТЬК4 +!ЬК9 (б, в) в диапазоне концентраций активаторов.
того, показано, что синергизм и NOD2 для индукции
связан с деградацией бактерий в фагосомах, после чего фрагменты клеточной стенки бактерии попадают в цитозоль, где распознаются NOD2 [31]. Возможно, усиление продукции интерферона связано с последовательным вовлечением PRR, представленных на внешней мембране в эндосоме и ци-тозоле. Это позволяет предполагать кинетические различия в
продукции интерферона при активации клеток одиночными агонистами или комбинацией нескольких агонистов.
По нашим данным, кинетика продукции мРНК ifn-в зависит от сочетаний агонистов. Как следует из рис. 3, г, при часовой экспозиции мы наблюдали пик продукции мРНК при тройной комбинации лигандов, превышающий парные сочетания. Активация одиночным агонистом TLR4 усиливала синтез мРНК гена ifn-в в 42 ± 11 раза относительно контроля, активация парными сочетаниями составила 39 ± 9 и 54 ±10 для TLR4+NOD2 и TLR4+TLR9 соответственно, а комбинация трёех агонистов TLR4+TLR9+NOD2 индуцировала усиление в 82 ± 12 раз. Однако при двухчасовой экспозиции композиция из трёх лигандов даёт уровень активации транскрипции не превышающий парных сочетаний лиган-дов. Уровень транскрипции гена ifn-в при парном сочетании TLR4+NOD2 выше уровня транскрипции, чем при активации одиночными лигандами. Таким образом, синергическая активация транскрипции мРНК ifn-в парным сочетанием TLR4+NOD2 характеризовалась пролонгированием транскрипции этого гена. Кинетика же активации парными сочетаниями TLR4+TLR9 схожа с таковой при активации одним агонистом TLR4, что согласуется с нашими предыдущими данными [25] и с исследованиями кинетики сочетаний агонистов TLR4+TLR2 и TLR4+TLR3 [32].
Синергическая активация транскрипции мРНК IL-12(p40) в макрофагах, активированных сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2
Провоспалительный цитокин IL12 синтезируется макрофагами и дендритными клетками в ответ на бактериальные компоненты и является важным связующим звеном врождённого и адаптивного иммунитета. Ключевая функция этого ци-токина - участие в поляризации Т-клеток по ТЫ-типу [34].
В наших экспериментах сочетание агонистов NOD2+TLR9 существенно увеличивало синтез мРНК il12p40, и максимальное увеличение продукции относительно отдельных агонистов достигалось при концентрации MDP 1мкг/мл и CpG-ODN 0.2 мкг/мл (рис. 4, а). Парные сочетания агонистов NOD2+TLR4 усиливали транскрипцию только при концентрации LPS 20 нг/мл, при увеличении концентрации LPS до 100 нг/мл усиления транскрипции не наблюдали (рис. 4, б, в). Схожая зависимость усиления транскрипции при парном сочетании NOD2+TLR4 от концентрации LPS была показана ранее Kim и др. [11] на перитонеальных макрофагах. Синергизм был показан в диапазоне до 50 нг/мл LPS, а при концентрации 1 мкг/мл наблюдали ингибирование транскрипции [11].
Парное сочетание агонистов TLR4+TLR9 в нашем исследовании индуцировало усиленную транскрипцию мРНК il12p40 при использовании концентрации 20 нг/мл LPS (см. рис. 4, б). При концентрации LPS 100 нг/мл сочетание агони-стов TLR4+TLR9 приводило к более выраженному усилению транскрипции, если CpG-ODN использовали в концентрации 0.2 мкг/мл. Однако, при повышении концентрации CpG-ODN интенсивность транскрипции гена il12p40 снижалась (см. рис. 4, в).
Использование тройной комбинации активаторов давало значимое усиление продукции мРНК относительно парных сочетаний агонистов при высокой концентрации MDP1, но при низких концентрациях LPS и CpG-ODN (см. рис. 4, б). При повышении концентрации CpG-ODN уровень ответа при тройном сочетании был не выше, чем при парном сочетании лигандов, а при увеличении концентрации LPS в комбинации активаторов наблюдали снижение уровня транскрипции гена (см. рис. 4, в).
Следовательно, синергические взаимодействия сигнальных путей проявляются при субмаксимальной активации каждого из них. При индукции максимального ответа одного из сигнальных путей система достигает своего максимума и дополнение другими сигналами не может повысить амплитуду ответа.
а
б
в
ORIGINAL ARTICLE
100 80 60 40 20 0
100
: 80
I
I 60
I i
[ 40
L
i 20 0
NOD2+TLR9
NOD2+TLR9
НИ CpG-ODN 0 го LPS
CpG-ODN 0 2
С=Э CpG-ODN 1
*
_ г-"-| - - -Г tJ^H
MOP 0 MQP 0-2 MDP 1
б
NOD2+TLR9 +TL R4
^m SBG-ODNO EZ3 CpG-ODN 0 2 ■-1 CpG-ODN 1
LPS 0.02
MDP0 MOP 0 2
NOD2+TLR9+TLR4
MDP 0.2
г
120 100
80 ее ■
40
20 0 ■
- KOhTpOItu
- LPS
- LPS*CpG-ODN
- LPS-tMDP
- CPG-ODN* MDP
- LPS+CpG-OON* MDP
30 60 120
Время, мим
Рис. 3. Изменение относительной экспрессии мРНК гена ifn-P через 2 ч стимуляции костномозговых макрофагов сочетаниями агонистов NOD2+TLR9 (а), NOD2+TLR4 +TLR9 (б, в) в диапазоне концентраций активаторов; (г) временная динамика активации в присутствии лиган-дов LPS 10 нг/мл, CpG ODN 1826 200 нг/мл, L18-MDP 200 нг/мл.
х
О.
£
Ö S
С
MDP 0.2 б
NOD2+TLR9+TLR4
Ш GpG-ODN 0
CpG-ODN 0 2 =1 CpG-ODN 1
MDP 0
MDP о.г в
NOD2+TLR9+TLR4
MDP1
80
X,?
к Л
I GpG-ODN 0 i CpG-ODN 0.2 I CpG-ODN 1
LPS 0.1
60
40
I
s 20
I
MDP 0 2
Рис. 4. Изменение относительной экспрессии мРНК гена Ш2р40 через 12 ч стимуляции костномозговых макрофагов сочетаниями агонистов NOD2+TLR9 (а), NOD2+TLR4 +TLR9 (б, в) в диапазоне концентраций активаторов.
Результаты наших исследований хорошо согласуются с данными литературы. Синергизм в продукции мРНК гена il12p40 для парных сочетаний TLR4+NOD2 был показан ранее Fritz [12]. Эффект усиления продукции мРНК гена il12p40 был наиболее выражен при низких концентрациях агониста TLR4. В костномозговых макрофагах мышей, нокаутных по NOD2, выработка этого цитокина была нарушена [11]. Для сочетаний агонистов TLR4+TLR9 и TLR3+TLR9 синергизм в продукции il12p40 был показан в перитонеальных макрофагах мыши [35].
а
а
в
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
а
NOD2+TLR9
S 200
У
II
s f
S I 150
Й ® ф I
с О
I S 100
If
И о.
г? го
I GpG-ODN 0 ] CpG-ODN 02 I CpG-ODN 1
ПО LPS
Л
jrri
MDP 02 б
NOD2+TLR9+TLR4
200
it о л
S S
s I
E
о
150
100
50
Ш GpG-ODN 0
CpG-ODN о г X] CpG-ODN »
LPS 0.02
ш
ШМ
MDP 0,2 в
NOD2+TLRS+TLR4
200
1 î |I
о щ
150
m m
s &
100
50
^m GpG ODN 0 1^71 CpG-ODN 0.2 I-1 CpG-ODN 1
LPS 0.1
JL
Ш
Рис. 5. Изменение относительной экспрессии мРНК гена inos через 12 ч стимуляции костномозговых макрофагов сочетаниями агонистов NOD2+TLR9 (a), NOD2+TLR4 +TLR9 (б, в) в диапазоне концентраций активаторов.
Влияние сочетанного воздействия лигандов TLR4, TLR9 и NOD2 на продукцию мРНК гена inos.
После активации макрофаги способны мигрировать в очаг воспаления для локализации патогена и его обезвреживания. Это достигается за счёт увеличения производства активных форм кислорода и оксида азота (NO), синтез которого обеспечивается ферментом - индуцибельной синтазой оксида азота (iNOS) [29].
Нами было установлено, что в контрольных макрофагах без активации мРНК гена inos не детектируется. Как следует из рис. 5, одиночный агонист MDP не индуцирует синтеза мРНК inos, а CpG-ODN и LPS активируют этот ген дозозави-симым образом. Парные сочетания агонистов NOD2+TLR9 и TLR4+TLR9 при концентрации CpG-ODN 1 мкг/мл индуцируют в макрофагах существенное усиление синтеза мРНК
inos по сравнению с одиночными активаторами. При концентрации CpG-ODN 0,2 мкг/мл увеличение транскрипции при парном сочетании NOD2+TLR9 показано вне зависимости от концентрации MDP. Тройная комбинация TLR4 + TLR9 + NOD2 была более эффективна в активации транскрипции гена inos в макрофагах по сравнению с парными комбинациями этих же агонистов (см. рис. 5, б, в).
Таким образом, нами было показано, что при активации сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 в макрофагах костного мозга наблюдается кооперация работы PRR на уровне транскрипции генов провоспалительных цитокинов, и противомикробных субстанций в макрофагах. Для генов tnf-a, ifn-ft, il12p40 и inos было показано усиление транскрипции при парном сочетании агонистов NOD2 + TLR4 и NOD2 + TLR9. Парное сочетание агонистов TLR4+TLR9 вызывало синергическую активацию транскрипции мРНК ifn-ft, il12p40 и inos. Усиление транскрипции генов при парном сочетании зависит от диапазона концентраций активаторов. Активация макрофагов комбинацией трёх агонистов TLR4+TLR9+NOD2 индуцировала ещё более интенсивный ответ. Транскрипция генов il6, ifn-в, il12p40 и inos после активации клеток тройной композицией была выше, чем после активации парными сочетаниями агонистов.
В наших экспериментах, описанных выше, наибольший синергизм по активации транскрипции мРНК наблюдался для генов il12p40 и inos, которые индуцируются медленнее, чем, например, ген TNF-a. Это согласуется с данными Napolitani и др. [32], показавшими на большом спектре генов, что синергические ответы на несколько TLR по продукции мРНК цитокинов и других индуцибельных генов проявляются при длительных экспозициях как для поздних генов так и для ранних генов, экспрессия которых устойчива во времени [32]. Как предполагают авторы, одним из возможных механизмов синергизма является результат непрерывной сигнализации от нескольких PRR и ключевая роль в этом принадлежит участникам JNK сигнального пути. Предполагается, что при кооперации сигналов от нескольких TLR для этого сигнального пути поддерживается активация через фосфо-рилирование c-jun (компонента транскрипционного фактора AP-1) на более поздних временах, совпадающих с пиком продукции мРНК генов-мишеней [32].
По-видимому, взимодействие сигнальных путей при одновременной активации TLR- и NOD-рецепторов может приводить как синергизму, так и к взаимному ингибированию, что, скорее всего, зависит от интенсивности ответа на каждый сигнал в отдельности. Сочетание двух немаксимальных по амплитуде активационных сигналов может приводить к достижению максимума при меньших концентрациях агони-стов. Напротив, чрезмерная активация любого из сигнальных путей может выразиться в ингибировании ответа клеток при воздействии комбинацией агонистов.
Синергическая активация или, напротив, взаимное ин-гибирование ответов на агонисты TLR- и NOD-рецепторов может иметь значение в патогенезе болезней. Например, взаимодействие между NOD2 и TLR, связывают с патогенезом болезни Крона, поскольку отсутствие синергизма у пациентов с потерей функциональных мутаций NOD2 приводит к снижению продукции IL-10 и усилению Th1 ответа [10]. В экспериментальной модели язвенного колита было показано, что использование агониста NOD2 (MDP) оказывает выраженное терапевтическое действие [18], а использование агониста TLR9 (CpG-ODN), напротив, ухудшает течение болезни [36].
Таким образом, активация нескольких PRR и взаимодействие между их сигнальными путями может регулировать экспрессию генов, определяющих эффективность и адекватность иммунных реакций. Дальнейшее изучение механизмов совместного действия PRR важно как для понимания принципов реагирования клеток на совокупность внешних сигна-
лов, так и для установления механизмов патогенеза некоторых актуальных заболеваний человека.
Финансирование. Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 15-15-00102.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-24, 26-36 см. в REFERENCES)
25. Лебедева Е. С., Багаев А. В., Чулкина М. М., Пичугин А. В., Атауллаханов Р.И. Синергическое усиление транскрипции генов интерферонов 1-го типа и цитокинов при активации макрофагов и дендритных клеток сочетанием двух агонистов PRR. Иммунология. 2017; 38(1):76-83.
26. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М. М., Ата-уллаханов Р.И. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременнуюактивацию парами агонистов разлилчных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38(1): 83-9.
REFERENCES
1. Janeway C.A., Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol. 2002; 20(1): 197-216.
2. Uematsu S., Akira S. Pathogen recognition by innate immunity. Ski Res. 2008; 7(1): 1-11.
3. Liu Q., Ding J.L. The molecular mechanisms of TLR-signaling cooperation in cytokine regulation. Immunol. Cell Biol. 2016; 94(6): 538-42.
4. Underhill D.M. Collaboration between the innate immune receptors dectin-1, TLRs, and Nods. Immunol Rev. 2007; 219(1): 75-87.
5. Tan R.S.T., Ho B., Leung B.P., Ding J.L.. TLR Cross-talk Confers Specificity to Innate Immunity. Int Rev Immunol. 2014; 33(6): 44353.
6. Steinhagen F., Kinjo T., Bode C., Klinman D.M. TLR-based immune adjuvants. Vaccine. 2011; 29(17): 3341-55.
7. Reed S.G., Orr M.T., Fox C.B. Key roles of adjuvants in modern vaccines. Nat Med. 2013; 19(12): 1597-608.
8. Tukhvatulin A., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shcheblyak-ov D.V., Shmarov M.M., Dolzhikova IV., et al. Powerful complex immunoadjuvant based on synergistic effect of combined TLR4 and NOD2 activation significantly enhances magnitude of humoral and cellular adaptive immune responses. PLoS One. 2016; 11(5): 1-24.
9. Makela S.M., Strengell M., Pietila T.E., Osterlund P., Julkunen I. Multiple signaling pathways contribute to synergistic TLR ligand-dependent cytokine gene expression in human monocyte-derived macrophages and dendritic cells. J. Leukoc. Biol. 2009; 85(4): 66472.
10. Netea M.G., Ferwerda G., de Jong D.J., Jansen T., Jacobs L., Kramer M., et al. Nucleotide-Binding Oligomerization Domain-2 Modulates Specific TLR Pathways for the Induction of Cytokine Release. J. Immunol. 2005; 174(10): 6518-23.
11. Kim H., Zhao Q., Zheng H., Li X., Zhang T., Ma X. A novel crosstalk between TLR4- and NOD2-mediated signaling in the regulation of intestinal inflammation. Nat. Publ. Gr. 2015; (4): 1-17.
12. Fritz J., Girardin S., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M., et al. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2-activating agonists. Eur. J. Immunol. 2005; 35(8): 2459-70.
13. Wolfert M.A., Murray T.F., Boons G.-J., Moore J.N. The Origin of the Synergistic Effect of Muramyl Dipeptide with Endotoxin and Peptidoglycan. J. Biol. Chem. 2002; 277(42): 39179-86.
14. Uehara A., Takada H. Synergism between TLRs and NOD1/2 in oral epithelial cells. J. Dent. Res. 2008; 87(7): 682-6.
15. De Nardo D, De Nardo CM, Nguyen T, Hamilton JA, Scholz GM. Signaling Crosstalk during Sequential TLR4 and TLR9 Activation Amplifies the Inflammatory Response of Mouse Macrophages. J. Immunol. 2009; 183(12): 8110-8.
16. Yeo S.-J., Yoon J.-G., Hong S.-C., Yi A.-K. CpG DNA Induces Self and Cross-Hyporesponsiveness of RAW264.7 Cells in Response to CpG DNA and Lipopolysaccharide: Alterations in IL-1 Receptor-Associated Kinase Expression. J. Immunol. 2003; 170(2): 1052-61.
ORIGINAL ARTICLE
17. van Heel D.A. Synergy between TLR9 and NOD2 innate immune responses is lost in genetic Crohn's disease. Gut. 2005; 54(11): 1553-7.
18. Watanabe T., Asano N., Murray P.J., Ozato K., Tailor P., Fuss I.J., et al. Muramyl dipeptide activation of nucleotide- binding oligomerization domain 2 protects mice from experimental colitis. J. Clin. Invest. 2008; 118(2): 545-59.
19. Zhu Q., Egelston C., Gagnon S., Sui Y., Belyakov I.M., Klinman D.M., et al. Using 3 TLR ligands as a combination adjuvant induces qualitative changes in T cell responses needed for antiviral protection in mice. J. Clin. Invest. 2010; 120(2): 607-16.
20. Madan-Lala R., Pradhan P., Roy K. Combinatorial Delivery of Dual and Triple TLR Agonists via Polymeric Pathogen-like Particles Syn-ergistically Enhances Innate and Adaptive Immune Responses. Sci. Rep. 2017; 7(1): 2530.
21. Bustin S.A., Benes V., Nolan T., Pfaffl M.W. Quantitative real-time RT-PCR-a perspective. J. Mol. Endocrinol. 2005; 34(3): 597-601.
22. Mann H.B., Whitney D.R.. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. Ann. Math. Stat. 1947; 18: 50-60.
23. Liu Q., Ding J.L. The molecular mechanisms of TLR-signaling cooperation in cytokine regulation. Immunol Cell Biol. 2016; 94(6): 538-42.
24. Liu Q., Zhu Y., Yong W.K., Sze N.S.K., Tan N.S, Ding J.L. Cutting Edge: Synchronization of IRF1, JunB, and C/EBPß Activities during TLR3-TLR7 Cross-Talk Orchestrates Timely Cytokine Synergy in the Proinflammatory Response. J. Immunol. 2015; 195(3): 801-5.
25. Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataul-lakhanov R.I. Synergistic activation of gene transcription encoding type I interferons and cytokines in macrophages and dendritic cells by the combinations of two PRR-agonists. Immunologiya. 2017; 38(1): 76-83. (in Russian)
26. Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M. M., Ataullakhanov R.I. Synergistic cytokine production by murine dendritic cells in response to their simulteneous ctivation with pairsof agonists of innate immune receptors. Immunologiya. 2017; 38(1): 83-9. (in Russian)
27. Duque G.A., Descoteaux A. Macrophage cytokines: Involvement in immunity and infectious diseases. Front Immunol. 2014; 5(11): 1-12.
28. Oviedo-Boyso J., Bravo-Patio A., Baizabal-Aguirre V.M. Collaborative Action of Toll-Like and Nod-Like Receptors as Modulators of the Inflammatory Response to Pathogenic Bacteria. Mediators Inflamm. 2014; 2014: 1-16.
29. Parameswaran N., Patial S.. Tumor necrosis factor-a signaling in macrophages. Crit. Rev. Eukaryot Gene Expr. 2010; 20(2): 87-103.
30. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R., Silverman R.H., Schreiber R.D. How cells respond to interferons. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 227-64.
31. Perry A.K., Chen G., Zheng D., Tang H., Cheng G.. The host type I interferon response to viral and bacterial infections. Cell Res. 2005; 15(6): 407-22.
32. Napolitani G., Rinaldi A., Bertoni F., Sallusto F., Lanzavecchia A.. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells. Nat. Immunol. 2005; 6(8): 769-76.
33. Herskovits A.A., Auerbuch V., Portnoy D.A. Bacterial ligands generated in a phagosome are targets of the cytosolic innate immune system. PLoSPathog. 2007; 3(3).
34. Zhu C., Rao K., Xiong H., Gagnidze K., Li F., Horvath C., et al. Activation of the murine interleukin-12 p40 promoter by functional interactions between NFAT and ICSBP. J. Biol. Chem. 2003; 278(41): 39372-82.
35. Ouyang X., Negishi H., Takeda R., Fujita Y., Taniguchi T., Honda K. Cooperation between MyD88 and TRIF pathways in TLR synergy via IRF5 activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 354(4): 1045-51.
36. Obermeier F., Dunger N., Deml L., Herfarth H., Schölmerich J., Falk W. CpG motifs of bacterial DNA exacerbate colitis of dextran sulfate sodium-treated mice. Eur J Immunol. 2002; 32(7): 2084-92.
Поступила 16.07.18 Принята в печать 16.09.19
