Синергическое усиление транскрипции генов интерферонов 1-го типа и цитокинов при активации макрофагов и дендритных клеток сочетанием двух агонистов PRR Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОБЗОРЫ

КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 612.017.1:612.112.94

Лебедева Е.С., Багаев А.В., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И.

СИНЕРГИЧЕСКОЕ УСИЛЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ИНТЕРФЕРОНОВ 1-го ТИПА И ЦИТОКИНОВ ПРИ АКТИВАЦИИ МАКРОФАГОВ И ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК СОЧЕТАНИЕМ ДВУХ АГОНИСТОВ PRR

ГНЦ «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115478, Москва, Россия

Клеточные рецепторы, распознающие молекулярные образы патогенов (pattern recognition receptors, PRR), обеспечивают реакции врожденного иммунитета и критически необходимы для реакций адаптивного иммунитета [1]. Связывание PRR со своим агонистом активирует в клетках защитную программу, направленную на борьбу с инфекционными и опухолевыми агентами. Воздействие на клетки врожденного иммунитета сочетанием двух или нескольких агонистов PRR способствует синергической активации их защитных реакций. Мы исследовали эффективность стимуляции врожденных защитных реакций при активации дендритных клеток и макрофагов парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9, NOD2, локализованных на клеточной мембране, эндосоме и цитозоле соответственно. Все исследованные сочетания агонистов (TLR4 + TLR9, TLR4 + NOD2 и TLR9 + NOD2) индуцировали синергические ответы клеток по продукции веществ, определяющих эффективность противоинфекционных и противоопухолевых защитных реакций. В частности, мы наблюдали синергизм по продукции TNFa, IL6, IFN(3, а также оксида азота. Обнаруженные эффекты зависят от концентрации агонистов PRR и от времени экспозиции клеток в присутствии этих активаторов. В данной работе установлено, что синергический ответ клеток на парные сочетания агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 основан на синергической активации транскрипции генов интерферонов (IFNP) и провоспалительных цитокинов (TNFa и IL6). Результаты свидетельствуют о кооперации нескольких PRR-путей на уровне транскрипции генов.

Ключевые слова: макрофаги; дендритные клетки; рецепторы, узнающие молекулярные образы патогенов;

синергизм; транскрипция; цитокины; интерфероны; оксид азота. Для цитирования: Лебедева Е.С., Багаев А.В., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Синергическое усиление транскрипции генов интерферонов 1-го типа и цитокинов при активации макрофагов и дендритных клеток сочетанием двух агонистов PRR. Иммунология. 2017; 38(1): 64-71. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-1-64-71

LebedevaE.S.1, BagaevA.v.1, ChulkinaMM.1, PichuginA.v.1, AtaullakhanovR.I.1

SYNERGISTIC ACTIVATION OF GENE TRANSCRIPTION ENCODING TYPE I INTERFERONS AND CYTOKINES IN MACROPHAGES AND DENDRITIC CELLS BY THE COMBINATIONS OF TWO PRR-AGONISTS

'National Research Center — Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115478, Moscow, Russia

Pattern recognition receptors (PRR) detecting pathogen-associated molecular patterns are necessary for both innate and adaptive immune responses [1]. PRR-agonist binding to its receptors on host cells activates their defense program against infections and tumors. Stimulation of innate immunity cells by combinations of two or more PRR-agonists induces synergistic defensive response. We examined the efficacy of innate defense reactions in dendritic cells and macrophages activated by paired combinations of TLR4, TLR9 and NOD2 agonists, localized on the cell membrane, and in endosome and cytosol, respectively. All the tested combinations of agonists, namely, TLR4 + TLR9, TLR4 + NOD2, and TLR9 + NOD2, induced synergistic production of substances which determine anti-infective and anti-cancer defense efficacy. Synergistic responses depended on the concentration of PRR-agonists. We report in this paper that macrophages and dendritic cells' synergistic responses induced by the paired combinations of TLR4, TLR9 and NOD2 are based on synergistic transcription of type I interferon (INFP) and pro-inflammatory cytokine (TNFa and IL6) genes. These results show a cooperation between several PRR-pathways at the level of gene transcription.

Keywords: macrophages; dendritic cells; patter-recognition receptors; synergism; transcription; cytokines; interferons; nitric oxide.

For citation: Lebedeva E.S., Bagaev A. v., Chulkina M.M., Pichugin A. v., Ataullakhanov R.I. Synergistic activation of gene transcription encoding type I interferons and cytokines in macrophages and dendritic cells by the combinations of two PRR-agonists. Immunologiya.2017; 38(1): 64-71. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-1-64-71

For correspondence: Ravshan I. Ataullakhanov, MD, PhD, Prof., Head of the Department of Immune Biotechnology, NRC Institute of Immunology FMBA, Russia, E-mail: [email protected]

conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgments. The work was performed with financial support from grant RSF15-15-00102.

Received 28.09.16 Accepted 03.11.16

введение

Макрофаги и дендритные клетки играют ключевую роль в распознавании инфекции и активации реакций врожденного

Для корреспонденции: Атауллаханов Равшан Иноятович, д-р мед. наук, проф., руководитель отдела иммунной биотехнологии ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, E-mail: [email protected]

и адаптивного иммунитета [2]. Оба типа клеток экспрессиру-ют несколько классов клеточных рецепторов, распознающих молекулярные образы патогенов (pattern recognition receptors, PRR) [2—5]. Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLR) обеспечивают распознавание бактериальных продуктов на поверхности клеток (TLR1, 2, 4 и 5) и в составе внутриклеточных вакуолярных структур (TLR3, 7, 8 и 9). NOD-подобные рецепторы (NOD-like receptors, NLR) распознают микробные структуры в цитозоле клетки. Такое трехуров-

REVIEWS

невое распределение сенсорных рецепторов в клетке — на внешней мембране, в эндосоме и цитозоле — гарантирует максимально надежное детектирование молекулярных образов инфекций, заразивших клетку или поглощенных ею извне. Например, TLR в составе внешней клеточной мембраны распознают компоненты микробных клеток, в частности ли-попротеин, липопептид и пептидогликан (TLR1, 2 и 6), LPS (TLR4) или флагеллин (TLR5). TLR, встроенные в мембрану внутриклеточных вакуолей, связывают чужеродные нуклеиновые кислоты — dsRNA (TLR3), ssRNA (TLR7 и 8) и участки ДНК, богатые неметилированными повторами CpG (TLR9). Цитоплазматические рецепторы NOD1 и NOD2 направлены на связывание структурных компонентов пептидо-гликана клеточной стенки бактерий — диаминопимелиновую кислоту и мурамилдипептид соответственно. Распознавание NLR и TLR своих агонистов приводит к стимуляции в макрофагах и дендритных клетках механизмов врожденного иммунитета. Активированные клетки вырабатывают различные противомикробные субстанции (активные формы кислорода, активные формы азота, дефенсины, интерфероны и др.), направленные на деструкцию и ограничение распространения источника инфекции, а также провоспалительные цитокины (TNFa, IL-1ß, IL-6 и др.), привлекающие в очаг инфекции эф-фекторные клетки врожденного и адаптивного иммунитета.

В условиях реальной инфекции клетки врожденного иммунитета одновременно распознают различные сочетания молекулярных образов патогенов, задействуюя в этом практически все TLR и NLR. В связи с этим в настоящее время изучают аддитивные и синергические эффекты сочетаний агонистов NLR и TLR. Такие исследования позволяют воссоздать картину, близкую к распознаванию реальных патогенов клетками хозяина. Кроме того, одновременная стимуляция PRR, относящихся к различным семействам рецепторов, позволяет усиливать в десятки раз защитные иммунные реакции [6—11], что может иметь практическое применение.

Агонисты PRR — эффективные иммуностимулирующие вещества. Синергический ответ макрофагов и дендритных клеток на сочетание агонистов различных PRR открывает новые возможности в иммунотерапии вирусных [12], микробных [11] и опухолевых [13] заболеваний. Создание высокоэффективной иммуномодулирующей композиции агонистов PRR требует детального понимания механизмов регуляции ответа клеток врожденного иммунитета как на сами патогены, так и на отдельные агонисты PRR и их сочетания. В настоящей работе мы исследовали эффективность ответа клеток врожденного иммунитета (макрофаги и дендритные клетки) при воздействии агониста-ми PRR на уровне внешней клеточной мембраны (TLR4), внутриклеточных мембран эндосом и других вакуолей (TLR9) и в цитозоле (NOD2). Активация клеток производилась указанными лигандами по отдельности или в парных сочетаниях TLR4 + TLR9, TLR4 + NOD2 или TLR9 + NOD2. Ответы макрофагов и дендритных клеток анализировали по продукции интерферонов 1-го типа, провос-палительных цитокинов, а также активных форм азота, служащих кочевыми медиаторами противоопухолевых и противомикробных реакций врожденного иммунитета. Установлены парные сочетания агонистов TLR4, TLR9 и NOD2, а также их концентрации, вызывающие синергические ответы клеток по продукции IFNß, TNFa, IL-6 и оксида азота.

Материал и методы

Реактивы. В работе использованы агонисты Toll-подобных рецепторов: липополисахарид из Е. coli серотип 055: B5 (LPS, агонист TLR4, Sigma, L-2880), Иммуномакс (iMM, агонист TLR4, Им-мафарма), ODN CpG-1826 (CpG, агонист TLR4,

Invitrogen), L18-MDP (MDP, агонист NOD2-pe^nropa, Invit-rogen).

Животные. Мышей линии BALB/c в возрасте 8—10 нед, полученных из питомника «Столбовая», содержали на стандартной диете в стандартных условиях вивария Института иммунологии ФМБА.

Культуры клеток. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM с 25 мМ HEPES, дополненной коктейлем заменимых аминокислот, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ p-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы фирмы ПанЭко) при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO2.

Дендритные клетки и макрофаги получали in vitro дифференцировкой клеток костного мозга мышей BALB/c в присутствии гранулоцитарного макрофагального колоние-стимулирующего фактора (GM-CSF, granulocyte-macrophage colony stimulating factor). Костный мозг вымывали из бедренных и больших берцовых костей мыши, эритроциты удаляли осмотическим лизисом, ядросодержащие клетки дважды отмывали PBS, после чего культивировали в ПС с добавлением 10 нг/мл GM-CSF (Sigma) в течение 7 дней, как описано в литературе [14]. К окончанию этого срока неадгезионные клетки содержали 70—75% дендритных клеток. Адгезионная часть культуры была на 95% представлена макрофагами. Для получения макрофагов сначала осторожно удаляли неадгезионные клетки, оставшийся монослой адгезионных клеток промывали (PBS, 0,5% BSA), выдерживали в растворе Вер-сена (ПанЭко) в течение 1 ч при 37 °C, после чего макрофаги смывали (PBS, 0,5% BSA).

Измерение продукции активных форм азота. Клетки инкубировались в количестве 100 тыс/лунку 96-луночного планшета в присутствии активаторов и без активаторов, через 48 ч культуральную среду отбирали и в ней измеряли остаточное количество активных форм азота (NO) с помощью реактива Грисса (Griess Reagent kit, ThermoFisher Scientific), следуя инструкции производителя. Интенсивность коло-метрической реакции детектировали на спектрофотометре Dynex MRX (США) при длине волны 550 нм.

ПЦР в реальном времени. Препараты тотальной РНК и кДНК получали с использованием наборов реагентов фирмы «Синтол» (РНК-экстран, набор реагентов для проведения ОТ соответственно), следуя инструкции производителя. Препарат кДНК использовали в качестве матрицы для проведения количественного ПЦР в реальном времени. Нуклеотидные

Таблица 1

Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в работе

Ген Название праймера 5' — >3' последовательность

b-actin b-actin-F AGAGGGAAATCGTGCGTGAC

b-actin-R CAATAGTGATGACCTGGCCGT

b-actin-TP FAM-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-RTQ

tnfa TNF-F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA

TNF-RV TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC

TNF-TP FAM-CACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGA-RTQ

il-6 IL-6-F GAGGATACCACTCCCAACAGACC

IL-6-RV AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA

IL-6-TP FAM-CAGAATTGCCATTGCACAACTCTTTTCTCA-RTQ

ifnb IFNb-F ACCACAGCCCTCTCCATC

IFNb-Rv GCATCTTCTCCGTCATCTCC

IFNb-TP FAM-CAACCTCACCTACAGGGCGGAC-RTQ

ОБЗОРЫ

последовательности использованных в работе праймеров (Синтол) представлены в табл. 1. ПЦР осуществляли с помощью амплификатора с детекцией в режиме реального времени DT-Prime фирмы «ДНК-технолигия», используя смесь реактивов фирмы «Синтол». Относительный уровень экспрессии анализируемых генов вычисляли методом 2ДСр, где ДСр = Cp (нормировочный ген) — Cp (ген интереса), в качестве нормировочного гена использовали ген ß-актина.

статистическая обработка данных. Все результаты представлены в виде средних значений и соответствующих величин стандартного отклонения. Достоверное отличие измеренного отклика от парного воздействия (прирост относительно контрольного значения) от линейного суммирования прироста от двух лигандов посчитано по непараметрическому критерию Уилкоксона—Манна—Уитни (Wilcoxon— Mann—Whitney test, WMW) [15].

результаты и обсуждение

Синергическая активация транскрипции генов интерферонов 1-го типа в дендритных клетках и макрофагах при их активации парными сочетаниями агони-

стов TLR4, TLR9 и NOD2. Интерфероны 1-го типа (IFNa, IFNß) играют ключевую роль в борьбе с инфекционными и опухолевыми заболеваниями [16]. Связывая рецепторный комплекс на поверхности инфицированных и соседних клетках, интерфероны 1-го типа индуцируют в них экспрессию интерферон-стимулированных генов (ISG). Продукты ISG запускают внутриклеточные защитные программы, позволяющие остановить распространение возбудителей инфекций и опухолевых клеток. Кроме того, интерфероны 1-го типа способны оказывать влияние на продукцию цитокинов клетками врожденного иммунитета (дендритные клетки, макрофаги) [17]. Показано паракринное и аутокринное влияние IFNa и IFNß на синергическую продукцию провоспалительных ци-токинов клетками, активированными сочетаниями агонистов PRR [18].

Мы предположили, что синергическое усиление продукции противомикробных и провоспалительных субстанций регулируется на уровне транскрипции генов. В настоящей работе мы исследовали экспрессию мРНК гена IFNß в дендритных клетках и макрофагах, активированных агонистами TLR4, TLR9 и NOD2 и их парными сочетаниями. При со-

а

SCO.

I-

со —

m v;

Р

(О s

!! i-s-

t" Й га

s?

1412" 10" 8-

Medium IMM 0,1 CpG 0,05 CpG 0,05 + IMM

~Ô ' 1 1 3 Г

14 12 10 8 642 -

Medium IMM 0,1 CpG 0,5 CpG 0,5 + IMM

1 3

Время инкубации, ч

14121086420-

Medium IMM 0,1 CpG 5

CpG 5 + IMM

14 -12 -

i* 10

ras 8 H

H

H 64-

S ra

S? 2 H

0,1 1 IMM, мкг/мл

IMM

-я— IMM+ MDP 0,3

Рис. 1. Экспрессия мРНК IFNP в ответ на их активацию сочетанием агонистов TLR4, NOD2 и TLR9.

а — костномозговые макрофаги инкубировали 0—6 ч в присутствии 100 нг/мл ТЬЯ4-агониста Иммуномакса (IMM0.1), 0,05—5 мкг/мл ТЬЯ9-агониста ODN CpG 1826 (CpG0.05, CpG0.5 и CpG5) и при их сочетании (CpG 0.05 + IMM; CpG 0.5 + IMM; CpG 5 + IMM); в качестве отрицательного контроля — клетки без активаторов (Medium); б — костномозговые макрофаги инкубировали в 0—1 ч в присутствии 100 нг/мл ТЬЯ4-агониста Иммуномакса (IMM) и с добавлением 0,3 мкг/мл агониста NOD2-рецептора L18-MDP (IMM + NOD2 0.3). Уровень экспрессии мРНК целевых генов IFNp анализировали методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров, мРНК р-актина использовали в качестве внутреннего стандарта. По оси абсцисс — время инкубации в часах, по оси ординат — значение активации экспрессии мРНК IFNp относительно мРНК р-актина, нормированное на значение в контроле.

Здесь и на рис. 2, 3, 4, 5 приведены средние значения и стандартные отклонения по двум культуральным и двум измерительным параллелям; * — достоверное (p < 0,05) отличие измеренного отклика от парного воздействия (прирост относительно контрольного значения) от линейного суммирования прироста от двух лигандов, посчитанное по непараметрическому критерию Уилкоксона—Манна—Уитни (Wilcoxon—Mann—Whitney test, WMW) [15].

REVIEWS

Medium

MdP

IMM20

IMM 20 + MDP

Medium MDP CPG 0,2 CPG 0,2 + MDP

300 250 200 150 100 50 0

2015"

TLR4+NOD2

■ Medium MDP IMM 500 IMM 500 + MDP

1 3

TLR9+NOD2

Medium MDP CPG 1

CPG 1 + MDP

Medium MDP IMM 100 IMM 100 +MDP

20 1

15 -

Medium MDP CPG 5

CPG 5 + MDP

Medium IMM

CPG 0,05 CPG 0,05 + IMM

10 -

5-

50 40 30

10 -

Medium IMM

CPG 0,5 CPG 0,5 + IMM

504030-

Medium IMM CPG 5

CPG 5 + IMM

13 Время инкубации, ч

Рис. 2. Экспрессия мРНК TNFa в ответ на их активацию сочетанием агонистов TLR4, NOD2 и TLR9.

а — костномозговые макрофаги инкубировали 0—6 ч в присутствии 20—500 нг/мл ТЬЯ4-агониста Иммуномакса (IMM 20, IMM 100, IMM 500) или 2,5 мкг/мл агониста NOD2-рецептора L18-MDP (MDP) и при их сочетании (IMM 20 + MDP; IMM 100 + MDP IMM 500 + MDP); в качестве отрицательного контроля — клетки без активаторов (Medium); б — костномозговые макрофаги инкубировали 0—6 ч в присутствии 0,2—5 мкг/мл ^Я9-агониста ODN CpG 1826 (CpG 0.2, CpG 1 и CpG 5) или 2,5 мкг/мл агониста NOD2-рецептора L18-MDP (MDP) и при их сочетании (CpG 0.2 + MDP; CpG 1 + MDP; CpG 5 + MDP); в качестве отрицательного контроля — клетки без активаторов (Medium), в — костномозговые макрофаги инкубировали 0—6 ч в присутствии 100 нг/мл TLR4 агониста Иммуномакса (IMM) или 0,2—5 мкг/мл TLR9 агониста ODN CpG 1826 (CpG 0.2, CpG 1 и CpG 5) и при их сочетании (CpG 0.2 + IMM; CpG 1 + IMM; CpG 5 + IMM), в качестве отрицательного контроля — клетки без активаторов (Medium). Уровень экспрессии мРНК гена TNFa анализировали методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров, мРНК р-актина использовали в качестве внутреннего стандарта. По оси абсцисс — время инкубации в часах, по оси ординат — значение активации экспрессии мРНК TNFa относительно мРНК р-актина, нормированное на значение в контроле.

вместном применении агонистов TLR4 + NOD2 и TLR4 + TLR9 мы наблюдали синергическое усиление продукции мРНК ШЫр (рис. 1). Из рис. 1, а, видно, при сочетанном воздействии на костномозговые макрофаги агонистами TLR4 (иммуномакс) и TLR9 (CpG) выработка мРНК значи-

тельно возрастает по сравнению с уровнем мРНК ШЫр при воздействии на клетки отдельными агонистами TLR4 или TLR9. Обнаруженный эффект имеет концентрационную и временную зависимость. Так, при сочетании агонистов TLR4 + TLR9 усиленная экспрессия мРНК обнаруживается в

ОБЗОРЫ

случае применения средних и высоких концентраций CpG (0,5 и 5 мкг/мл) и не детектируется при низкой концентрации CpG (0,05 мкг/мл) (см. рис. 1, а). В отсутствие агониста TLR4 повышение концентрации агониста TLR9 с 0,05 до 5 мкг/мл не оказывало влияния на амплитуду выработки мРНК IFNß. После воздействия сочетанием агонистов TLR4 + TLR9 синергизм по экспрессии мРНК IFNß наблюдали через 1 или 3 ч в зависимости от выбранной концентрации CpG (5 или 0,5 мкг/мл соответственно).

Сочетание агонистов TLR4 + NOD2 тоже приводит к усиленной экспрессии мРНК IFNß по сравнению с экспрессией мРНК IFNß под действием отдельного агониста TLR4 (см. рис. 1, б).

В литературе описаны случаи синергической экспрессии и продукции интерферонов 1-го типа при сочетанном действии агонистов TLR3 и TLR4/TLR7/8 [19], TLR3 и TLR7 [20], TLR-3 и TLR9 [21]. Выбор тех или иных агонистов PRR для индукции синергической продукции интерферонов 1-го типа чаще падает на агонисты эндосомальных TLR3, TLR7/8, TLR9 и TLR4. Вероятно, это объясняется их способностью активировать в клетках регуляторные факторы интерферонов (IRF) — стимуляторов транскрипции генов интерферонов 1-го типа [2, 3]. В нашей работе при воздействии парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 мы тоже наблюдали максимальный эффект в индукции экспрессии мРНК IFNß в случае сочетания агонистов (TLR4 + TLR9), каждый их которых был способен активировать транскрипционные факторы семейства IRF. Комбинация агонистов TLR4 + NOD2 приводила к меньшему эффекту по транскрипции мРНК IFNß.

Проведенное нами исследование кинетики продукции мРНК гена IFNß свидетельствует, что синергическая продукция интерферонов 1-го типа регулируется на транскрипционном уровне и проявляется при воздействии на клетки определенными концентрациями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2.

Продукция провоспалительных цитокинов макрофагами при их активации одиночными агонистами TLR4, TLR9 и NOD2 и их парными сочетаниями. Провоспали-тельные цитокины секретируются макрофагами и дендритными клетками в ответ на инфекцию и позволяют организовать реакцию защиты, известную как воспаление. Фактор некроза опухоли альфа (TNFa) — ключевой цитокин ранней

фазы инфекционного воспаления. TNFa играет решающую роль в активации и привлечении эффекторных клеток в очаг инфекции. TNFa способствует элиминации патогенов в результате паракринной и аутокринной активации в иммунных клетках механизмов фагоцитоза, выброса активных форм кислорода и внутриклеточных протеаз. TNFa привлекает нейтрофилы в очаг инфекции, стимулируя продукцию хемо-кинов и экспрессию тканеспецифичных молекул адгезии на их поверхности и на поверхности клеток эндотелия [22].

Экспрессия гена TNFa индуцируется в клетках в ответ на действие агонистов PRR [23]. Мы исследовали интенсивность продукции мРНК TNFa в костномозговых макрофагах при активации клеток агонистами TLR4, TLR9 и NOD2, а также их сочетаниями по 2. На рис. 2 видно, что TLR4-агонист значительно активировал транскрипцию мРНК TNFa, аго-нист TLR9 оказывал слабое действие, а агонист NOD2 либо оказывал слабое действие, либо не влиял на транскрипцию гена TNFa. При воздействии на макрофаги сочетаниями агонистов TLR4 + NOD2, TLR4 + TLR9 или TLR9 + NOD2 мы наблюдали сильный синергический ответ по интенсивности транскрипции мРНК TNFa. Уровень экспрессии гена TNFa, как и гена IFNa (см. рис. 1), сильно зависел от концентраций агонистов PRR. При сочетании агонистов TLR4 и TLR9 в низких (IMM 20 нг/мл, CpG 0,2 мкг/мл) и средних (IMM 100 нг/мл, CpG 1 мкг/мл) концентрациях с агонистом NOD2 наблюдалась пролонгация экспрессии гена TNFa, максимум накопления мРНК TNFa сдвигался на более поздние сроки, по сравнению с действием отдельных агонистов (см. рис. 2, а и б, левый и средний графики). При сочетании более высоких концентраций агониста TLR9 (5 мкг/мл) с агонистом NOD2 (см. рис. 2, б, правый график) уровень мРНК TNFa резко возрастал. Сочетание NOD2 с высокой концентрацией иммуномакса (500 нг/мл) приводило к меньшему усилению продукции мРНК TNFa (см. рис. 2, а, правый график) по сравнению с сочетанием NOD2-агониста со средней концентрацией (100 нг/мл) иммуномакса (см. рис. 2, а, средний график). Сочетание агонистов TLR4 + TLR9 лишь в высоких концентрациях приводило к синергически усиленной транскрипции мРНК TNFa (см. рис. 2, в, правый график).

При анализе влияния парных сочетаний агонистов PRR на интенсивность транскрипции другого провоспалительно-го цитокина — IL6 — мы также наблюдали сильные синер-

а б в

Время инкубации, ч

Рис. 3. Экспрессия мРНК IL-6 в ответ на их активацию сочетанием агонистов TLR4 и NOD2.

Костномозговые макрофаги инкубировали 0—6 ч в присутствии 20—100 нг/мл TLR4 агониста Иммуномакса (IMM 20, IMM 100, IMM 500) или 2,5 мкг/мл агониста NOD2-рецептора L18-MDP (MDP) и при их сочетании (IMM 20 + MDP; IMM 100 + MDP IMM 500 + MDP), в качестве отрицательного контроля — клетки без активаторов (Medium). Уровень экспрессии мРНК гена IL-6 анализировали методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров, мРНК ß-актина использовали в качестве внутреннего стандарта. По оси абсцисс — время инкубации в часах, по оси ординат — значение активации экспрессии мРНК IL6 относительно мРНК ß-актина, нормированное на значение в контроле.

REVIEWS

MDP, мкг/мл

MDP, мкг/мл

CPG, мкг/мл

0 1 0 0,05 0,5 5 0 0,05 0,5 5

0 2,8 2,9 0 2,7 2,2 2,0 2,5 0 1,0 2,4 2,6 4,8

0,1 2,2 3,1 с S "с 0,05 1,6 1,3 1,3 3,9 с д 0,2 1,3 1,2 6,8 6,2

s S 1

1 3,5 5,7 сэ CL о 0,5 2,7 3,8 6,2 4,6 1 2,8 3,9 12,7 15,3

* * *

10 7,8 20,5 5 4,6 6,9 6,7 8,4 5 6,7 5,6 13,5 18,8

2520 -2 15-

o

z 105 -

0 -TLR4 TLR9 NOD2

Ш

- + + +

+ +

+ +

Рис. 4. Продукция активных форм азота в ответ на активацию дендритных клеток сочетанием агонистов TLR4, NOD2 и TLR9. Костномозговые дендритные клетки (100 тыс./лунка, 96-луночный планшет) инкубировали в присутствии различных агонистов PRR и их сочетаний: TLR4-агониста — Иммуномакса (IMM, 0—10 мкг/мл), TLR9-агониста — ODN CpG 1826 (CpG, 0—5мкг/мл) и агониста NOD2-рецептора — L18-MDP (MDP, 0—5 мкг/мл). Через 48 ч в культуральной среде определяли остаточный уровень нитритов (NO) с помощью реактива Грисса. а — в ячейках представлен уровень нитритов (NO, цМ), детектируемый в среде в зависимости от концентраций агонистов PRR, концентрации сочетаемых агонистов указаны справа и сверху от ячеек. Представлены средние значения по двум культуральным и двум измерительным параллелям; б — по оси ординат — количество нитритов (NO, цМ), детектируемое в среде при активации клеток сочетанием агонистов TLR4 (10 мкг/мл), TLR9 (5 мкг/мл) NOD2 (1 мкг/мл) в оптимальных концентрациях, приведены средние значения и стандартные отклонения по двум культуральным и двум измерительным параллелям.

гические эффекты по уровню мРНК IL6 в активированных клетках (рис. 3). В отличие от экспрессии гена TNFa, синер-гическая транскрипция гена IL6 наблюдалась при всех использованных концентрациях агониста TLR4 (ИММ 20, 100 и 500 нг/мл) в сочетании с агонистом NOD2.

Провоспалительные цитокины — главные медиаторы ответа клеток на вторжение патогенов. Синергизм по их продукции наблюдают в результате сочетанного действия различных пар агонистов PRR [23—28]. Наиболее изучена синергическая продукция цитокина TNFa. Показано, что сочетания агонистов TLR8/TLR3/TLR4 [23], TLR4 и TLR2 [24], TLR4 и TLR9 [25], NOD1 и TLR1/2/TLR4 [26], NOD2 и TLR4 [27], NOD2 и TLR9 [28] усиливают продукцию TNFa в активированных клетках. Полученные нами данные по активации транскрипции генов провоспалительных цитокинов (TNFa и IL-6) не противоречат литературным. Исследования концентрационной и временной зависимостей эффектов транскрипции генов TNFa и IL6 под действием сочетаний агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 свидетельствуют о регуляции синерги-ческого ответа клеток на транскрипционном уровне.

Считается, что синергизм в экспрессии генов провоспа-лительных цитокинов определяет набор транскрипционных

факторов, активируемых в клетке при действии определенным сочетанием агонистов PRR [23]. В частности, показано, что в случае активации клеток агонистами TLR3 или TLR4 совместно с агонистом TLR8 происходит возрастание связывания транскрипционных факторов NFAr-B-, IRF- и STAT-семейств с соответствующими последовательностями в промоторе гена IL12, что приводит к синергизму в транскрипции данного гена. Молекулярные механизмы обнаруженного нами явления синергической транскрипции генов провоспа-лительных цитокинов (см. рис. 2 и 3), а также интерферонов 1-го типа (см. рис. 1) предстоит изучить. Вполне вероятно, что ключевую роль в этом также играет набор транскрипционных факторов, активируемых в ответ на действие отдельных агонистов TLR4, TLR9, NOD2 и их парных сочетаний.

Продукция активных форм азота дендритными клетками и макрофагами при их активации парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2. Активные формы азота, в частности нитрит азота (NO), — это токсичные вещества, способные разрушать возбудителей инфекций и их продукты [29]. NOS2 (Nitric-Oxide Synthase 2) — ключевой фермент, участвующий в синтезе NO. Экспрессия гена Nos2 индуцируется в ответ на инфекцию и регулируется системой

ОБЗОРЫ

LPS, мкг/мл IMM, мкг/мл

Рис. 5. Продукция активных форм азота в ответ на активацию макрофагов сочетанием агонистов TLR4 и NOD2.

Костномозговые макрофаги (100 тыс./лунка, 96-луночный планшет) инкубировали в присутствии агонистов TLR4 — LPS (LPS, 0—10 мкг/мл) (а) или Иммуномакса (IMM, 0—10 мкг/мл) (б) и агониста NOD2-рецептора — L18-MDP (MDP, 1 мкг/мл) и их сочетаний (LPS + MDP, IMM + MDP). Через 48 ч в культуральной среде определяли остаточный уровень нитритов (NO, ^M) с помощью реактива Грисса. По оси ординат — количество нитритов (NO, цЫ) в среде.

интерферонов и провоспалительных цитокинов, активируемых в ответ на связывание PRR своих агонистов.

Мы исследовали действие агонистов TLR4, NOD2 и TLR9 и их попарных сочетаний на продукцию активных форм азота. Продукция NO дендритными клетками синергически стимулировалась всеми исследованными сочетаниями агонистов TLR4 + NOD2, TLR4 + TLR9 и TLR9 + NOD2. На рис. 4, а видно, что, как и в случае экспрессии генов IFNß, TNFa и IL6, уровень продукции NO под действием парных сочетаний аго-нистов PRR зависит от концентраций агонистов. Варьируя концентрациями двух агонистов PRR, можно добиться антагонистических, аддитивных или синергических эффектов по продукции NO. Мы определили оптимальные концентрации агонистов TLR4, TLR9 и NOD2, обеспечивающие усиленную выработку NO (см. рис. 4, б). При активации клеток парными сочетаниями TLR4 + NOD2, TLR4 + TLR9 и TLR9 + NOD2 оптимальными оказались концентрации 10, 5 и 1 мкг/мл для Иммуномакса, CpG-ODN и MDP соответственно.

Наибольшие эффекты по продукции NO детектировались при сочетании агонистов TLR4 + NOD2 и TLR4 + TLR9, тогда как сочетание TLR9 + NOD2 индуцировало меньший эффект по продукции NO. Показано, что совместное действие агонистов TLR4 и интерферонов 1-го типа приводит к синергизму по продукции NO [30, 31]. Учитывая, что агонисты TLR4 и TLR9 стимулируют транскрипцию мРНК IFN-ß (см. рис. 1), а их сочетание — к усиленной экспрессии гена IFNß, вполне возможно, что мы наблюдаем синергическую продукцию NO при действии сочетания TLR4 + TLR9 в результате паракринного или аутокринного действия интерферонов 1-го типа. Интересно, что агонист NOD2 не индуцирует продукцию активных форм азота дендритными клетками, однако при сочетании агониста NOD2 с агонистами TLR4 или TLR9 наблюдают значительное усиление в продукцию NO по сравнению с действием отдельных агонистов TLR4 и TLR9.

Аналогично ответам дендритных клеток активация макрофагов агонистами TLR4 + NOD2 тоже приводит к усиленной продукции NO по сравнению действием одиночных агонистов TLR4 и NOD2 (рис. 5). Обнаруженный эффект наблюдают при сочетании агониста NOD2 с различными агонистами TLR4 (LPS или Иммуномакс), он зависит от концентраций используемых TLR4-активаторов. Как и в случае дендритных клеток, концентрации TLR4 и NOD2 агониста, обеспечивающие максимальную продукцию NO макрофагами, составляли 10 и 1 мкг/мл соответственно.

LPS — классический агонист TLR4, его широко применяют в фундаментальных исследованиях сигнального пути TLR4, все имеющиеся в литературе данные об активации клеток сочетаниями агонистов различных PRR выполнены с использованием LPS в качестве TLR4-активатора. Однако использование LPS в медицинской практике ограничено его токсичностью. Мы показали, что по синергической индукции синтеза NO фармацевтический TLR4-агонист иммуномакс не уступает LPS при комбинировании с агонистом NOD2.

Таким образом, сочетанное действие агонистов TLR4 + TLR9, TLR4 + NOD2 и TLR9 + NOD2 приводит к синергиче-ским эффектам экспрессии генов провоспалительных цито-кинов TNFa и IL-6, интерферонов 1-го типа (IFN-P), а также продукции активных форм азота (NO) костномозговыми макрофагами и дендритными клетками. Синергические эффекты зависят от концентрации сочетаемых агонистов.

Заключение

В настоящей работе изучен синергический ответ макрофагов и дендритных клеток на парные сочетания агонистов TLR4, TLR9 и NOD2. Показано, что синергизм в продукции цитокинов и интерферонов регулируется на уровне транскрипции генов, кодирующих эти белки. В частности, при активации клеток сочетаниями TLR4 + TLR9, TLR4 + NOD2 и TLR9 + NOD2 продемонстрирована синергическая транскрипция мРНК провоспалительных цитокинов TNFa и IL-6, а также интерферона 1-го типа (IFN-P). Описаны условия индукции усиленного производства активных форм азота (NO) в ответ на активацию дендритных клеток и макрофагов парными сочетаниями TLR4, TLR9 и NOD2.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 15-15-00102.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

литература/ references

1. Janeway C.A, Jr. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1989; 54(1): l—13.

2. Janeway C.A, Jr., Medzhitov R. Innate immune recognition. Ann. Rev. Immunol. 2002; 20: 197—216.

3. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity. Int. immunol. 2005; 17(1), 1—14.

4. Akira S., Uematsu S., Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 2006; 124(4): 783—801.

5. Creagh E.M., O'Neill L.A. TLRs, NLRs and RLRs: a trinity of pathogen sensors that co-operate in innate immunity. Trends Immunol. 2006; 27: 352—7.

6. Wolfert M.A., Murray T.F., Boons G.J., Moore J.N. The origin of the synergistic effect of muramyl dipeptide with endotoxin and peptido-glycan. J. Biol. Chem. 2002; 277: 39179—86.

7. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M. et al. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2- activating agonists. Eur. J. Immunol. 2005; 35: 2459—70.

8. Tada H., Aiba S., Shibata K., Ohteki T., Takada H. Synergistic effect of Nod1 and Nod2 agonists with toll-like receptor agonists on human dendritic cells to generate interleukin-12 and T helper type 1 cells. Infect. Immun. 2005; 73: 7967—76.

9. van Beelen A.J., Zelinkova Z., Taanman-Kueter E.W., Muller F.J., Hommes D.W., Zaat S.A. et al. Stimulation of the intracellular bacterial sensor NOD2 programs dendritic cells to promote interleukin-17 production in human memory T cells. Immunity. 2007; 27: 660—9.

10. Schwarz H., Posselt G., Wurm P., Ulbing M., Duschl A., Horejs-Hoeck J. TLR8 and NOD signaling synergistically induce the production of IL-1ß and IL-23 in monocyte-derived DCs and enhance the expression of the feedback inhibitor SOCS2. Immunobiology. 2013; 218(4): 533—42.

11. Tukhvatulin A.I., Gitlin I.I., Shcheblyakov D.V., Artemicheva N.M., Burdelya L.G., Shmarov M.M. et al. Combined stimulation of Toll-like receptor 5 and NOD 1 strongly potentiates activity of NF-kB, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar Typhimurium infection. Infect. and immun. 2013; 81(10): 3855—64.

12. Nasirudeen A.M.A., Wong H.H., Thien P., Xu S., Lam K.P., Liu D.X. RIG-I, MDA5 and TLR3 synergistically play an important role in restriction of dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 2011; 5(1): e926.

13. Whitmore M.M., DeVeer M.J., Edling A., Oates R.K., Simons B., Lindner D. et al. Synergistic activation of innate immunity by double-stranded RNA and CpG DNA promotes enhanced antitumor activity. Cancer Res. 2004; 64(16): 5850—60.

14. Inaba K., Inaba M., Romani N., Aya H., Deguchi M., Ikehara S. et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 1992; 176(6): 1693—702.

15. Mann H.B., Whitney D.R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. Ann. Mathemat. Statist. 1947; 18: 50—60.

16. Abdolvahab M.H., Mofrad M.R.K., Schellekens H. Interferon beta: from molecular level to therapeutic effects. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2016; in press.

17. Ivashkiv L.B., Donlin L.T. Regulation of type I interferon responses. Nature Rev. Immunol. 2014; 14(1): 36—49.

18. Gautier G., Humbert M., Deauvieau F., Scuiller M., Hiscott J., Bates E.E. et al. A type I interferon autocrine—paracrine loop is involved

REVIEWS

in Toll-like receptor-induced interleukin-12p70 secretion by dendritic cells. J. Exp. Med. 2005; 201(9): 1435—46.

19. Mäkelä S.M., Österlund P., Julkunen I. TLR ligands induce synergistic interferon-ß and interferon-^ gene expression in human monocyte-derived dendritic cells.Mol. Immunol. 2011; 48(4): 505—15.

20. Kreutz M., Bakdash G., Dolen Y., Sköld A.E., Hout-Kujer M.A., Vries I.J. M. et al. Type I IFN mediated synergistic activation of mouse and human DC subsets by TLR agonists. Eur. J. Immunol. 2015; 45(10): 2798—809.

21. Kim D., Niewiesk S. Synergistic induction of interferon a through TLR-3 and TLR-9 agonists stimulates immune responses against measles virus in neonatal cotton rats. Vaccine. 2014; 32(2): 265— 70.

22. Mehrad B., Standiford T.J. Role of cytokines in pulmonary antimicrobial host defense. Immunol. Res. 1999; 20(1): 15—27.

23. Mäkelä S.M., Strengell M., Pietilä T.E., Österlund P., Julkunen I. Multiple signaling pathways contribute to synergistic TLR ligand-dependent cytokine gene expression in human monocyte-derived macrophages and dendritic cells. J. Leukocyte biol. 2009; 85(4): 664—72.

24. Sato S., Nomura F., Kawai T., Takeuchi O., Muhlradt P.F., Takeda K. et al. Synergy and cross-tolerance between Toll-like receptor (TLR) 2- and TLR4-mediated signaling pathways. J. Immunol. 2000; 165:7096—101.

25. Yi A.K., Yoon J.G., Hong S.C., Redford T.W., Krieg A.M. Lipopolysaccharide and CpG DNA synergize for tumor necrosis factor- production through activation of NF-B. Int. Immunol. 2001; 13: 1391—404.

26. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K., Foxwell B.M.J., Mengin-Lecreulx D. et al. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur. J. Immunol, 2005; 35(8): 2471—6

27. Netea M.G., Ferwerd G., de Jong D.J., Jansen T., Jacobs L., Kramer M. et al. Nucleotide-binding oligomerization domain-2 modulates specific TLR pathways for the induction of cytokine release. J. Immunol. 2005; 174(10): 6518—23.

28. van Heel D.A., Ghosh S., Hunt K.A., Mathew C.G., Forbes A., Jewell D.P. et al. Synergy between TLR9 and NOD2 innate immune responses is lost in genetic Crohn's disease. Gut. 2005; 54(11): 1553—7.

29. Coleman J.W. Nitric oxide in immunity and inflammation. Int. Immunopharmacol. 2001; 1(8): 1397—406.

30. Fujihara M., Ito N., Pace J.L., Watanabe Y., Russell S.W., Suzuki T. Role of endogenous interferon-beta in lipopolysaccharide-triggered activation of the inducible nitric-oxide synthase gene in a mouse macrophage cell line, J774. J. Biol. Chem. 1994; 269(17): 12773—8.

31. Xie Q.W., Whisnant R., Nathan C. Promoter of the mouse gene encoding calcium-independent nitric oxide synthase confers inducibility by interferon gamma and bacterial lipopolysaccharide. J. Exp. Med.. 1999; 177(6): 1779—84.

Поступила 28.09.16 Принята в печать 03.11.16