CC BY
196
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 612.017.1
Регуляция экспрессии целевого белка (трансгена) в составе ДНК аденовирусного вектора с помощью агонистов Toll-подобных рецепторов
А. В. Багаев1, А. В. Пичугин1, Е. С. Лебедева1, А.А. Лысенко2, М. М. Шмаров2, Д. Ю. Логунов2, Б. С. Народицкий2, Р. И. Атауллаханов1*, Р. М. Хаитов1, А. Л. Гинцбург2 Тосударственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115478, Москва, Каширское ш., 24, корп. 2
2Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 27.08.2014
реферат Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы (rAd) являются эффективным молекулярным инструментом для генной терапии и генной вакцинации. С помощью таких векторов нужные гены можно доставить и экспрессировать в клетках различных эпителиев, печени, в иммунных и кроветворных клетках животных и человека. Успех генной терапии и генной вакцинации зависит от интенсивности продукции целевого белка, кодируемого вектором. В представленной работе изучено влияние агонистов Toll-подобных рецепторов (TLR) на эффективность трансдукции и экспрессии rAd в антиген-представляющих клетках животных и человека. Установлено, что агонисты TLR2, 4, 5, 7, 8 и 9 значительно усиливают продукцию белка в клетках, трансдуцированных rAd со вставкой гена этого белка. Эффект усиления реализуется в дендритных клетках и макрофагах, экспрессирующих цитоплазматический (GFP), мембранный (HA) или секреторный (SEAP) белки. На лабораторных мышах показано усиление экспрессии целевого белка с помощью фармацевтического агониста TLR4. В отличие от агонистов других TLR, агонист TLR3 подавляет продукцию GFP или SEAP в клетках, трансдуцированных rAd со вставкой гена этих белков. Предполагается, что усиление экспрессии целевого белка связано с активацией сигнального пути MyD88 — NF-kB, а подавление - с активацией сигнального пути TRIF — IRF. При активации обоих сигнальных путей агонистом TLR4 доминирует сигнал MyD88 — NF-kB, стимулирующий продукцию белка, кодируемого трансгеном в составе rAd.
ключевые слова агонисты Toll-подобных рецепторов, генная терапия, генная иммунизация, рекомбинант-ные нереплицирующиеся аденовирусные векторы, экспрессия трансгенов.
список сокращении rAd - нереплицирующийся рекомбинантный аденовирусный вектор; TLR - Toll-подобный рецептор; БОЕ - бляшкообразующая единица; ПС - полная культуральная среда; БСА - бычий сывороточный альбумин; PBS - фосфатный буферный раствор; LTA - липотейхоевая кислота; Poly[I : С] - полиинозиновая : полицитидиловая кислота; LPS - липополисахарид; MPL-A - монофосфорильное производное липида А; TNF-a - фактор некроза опухоли a; GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; CLI-095 - известен также, как TAK-242, селективный ингибитор TLR4-сигнализации; SEAP - секреторная эмбриональная щелочная фосфатаза; GFP - зеленый флуоресцентный белок; DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндолдигидрохлорид; HA - гемагглютинин вируса гриппа H1N1; CMV - цитомегаловирус; IL - интерлейкин.
введение
Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы (rAd) применяются для экспрессии трансгена в клетках различного типа. В зависимости от гена rAd могут использоваться в генной
терапии (гены опухолевых супрессоров, факторов роста и др.) или генетической иммунизации (гены протективных антигенов возбудителей). В случае иммунизации антиген вырабатывается трансдуци-рованными клетками иммунизированного организ-
ма в течение 2-3 недель, что приводит к развитию интенсивного иммунного ответа. По такому принципу сконструированы вакцинные препараты против туберкулеза, малярии, гриппа и многих других актуальных инфекций. Большинство препаратов на основе rAd пока находятся на различных стадиях клинического изучения [1-5], и лишь один препарат зарегистрирован и разрешен к применению [6]. Однако уже накоплено достаточно сведений, чтобы считать иммуногены и вакцины на основе rAd безопасными и эффективными.
Иммунные реакции на нужный антиген, кодируемый rAd, можно усиливать с помощью агонистов То11-подобных рецепторов (TLR) [3]. Мы создали оригинальную экспериментальную вакцину против гриппа, в состав которой входят rAd, кодирующие протективные антигены вируса гриппа, и фармацевтический агонист TLR4 - Иммуномакс® [7-9] - выделенный из растений водорастворимый высокомолекулярный кислый полисахарид с молекулярной массой более 1 МДа [10]. Использование Иммуномакса в качестве молекулярного адъюванта позволяет усилить реакции Т-клеток на антигены вируса гриппа и повысить защитные свойства вакцины. Кроме того, включение данного адъюванта в состав вакцины позволяет в 3-10 раз уменьшить дозу rAd, кодирующих антигены вируса гриппа, без потери ее иммуногенных и протективных свойств.
Иммуномакс не оказывает прямого воздействия на Т-клетки. Этот препарат активирует антиген-представляющие клетки, в частности дендритные клетки и макрофаги. В дендритных клетках Иммуномакс индуцирует усиленную экспрессию коактиваторных молекул, а именно: CD80, CD86, CD40, МНС класса II, а также секрецию иммуностимулирующих цитокинов , TNF-a, ^6, 8 и 12 [10]. Этих событий в антигенпредставляющих клетках вполне достаточно для проявления иммуностимулирующего действия Иммуномакса. Однако нельзя исключить, что Иммуномакс усиливает также продукцию антигенов, кодируемых трансгеном в составе rAd.
При иммунизации rAd синтез белка-антигена происходит непосредственно в антигенпред-ставляющих клетках, поэтому мы предположили, что Иммуномакс, наряду с коактиваторными молекулами и цитокинами, может стимулировать и продукцию белка-антигена. Такое влияние препарата могло бы вносить вклад в усиление ответа Т-клеток, распознающих антиген на поверхности антигенпред-ставляющих дендритных клеток.
В представленной работе нами изучена экспрессия белков, гены которых встроены в rAd, в ден-
дритных клетках и макрофагах, на которые воздействовали Иммуномаксом, а также агонистами других TLR. Полученные результаты свидетельствуют, что Иммуномакс в 2-11 раз усиливает интенсивность продукции белка-антигена в дендритных клетках и макрофагах. Усиление экспрессии наблюдалось при использовании rAd, кодирующих мембранный, цитоплазматический и секреторный белки. Подобно Иммуномаксу другой агонист TLR4 - липополисахарид из Escherichia coli - тоже стимулировал экспрессию трансгенных белков, кодируемых rAd. Более того, агонисты других рецепторов TLR, в частности TLR2, 5, 7, 8 и 9, усиливали экспрессию таких белков, тогда как агонист TLR3 не усиливал, а подавлял их продукцию. Сравнение внутриклеточных сигнальных путей от разных TLR позволило предположить, что сигнал, начинающийся с MyD88 и оканчивающийся фактором NF-kB, стимулирует, а сигнальный путь, использующий TRIF и оканчивающийся факторами транскрипции IRF-3 и IRF-7, подавляет продукцию белков, определяемую аденовирусным вектором. Сигнальный путь через MyD88 доминирует над сигналом через TRIF, поэтому при воздействии агониста TLR4, когда используются обе сигнальные ветви (MyD88 и TRIF), наблюдается усиление экспрессии трансгена.
экспериментальная часть
Антитела и реагенты
Использованы следующие моноклональные антитела: CD11b-BD Horizon V450, Ly-6G APC-Cy7 (BD Pharmingen™), CDllc PE, CD19 eFluo450 (eBiosciences), F4/80 APC (BioLegend), Anti Mouse MHC II (I-A)-FITC (eBiosciences). Моноклональные антитела к гемагглютинину вируса гриппа H1N1 (HA) любезно предоставлены А.А. Кущ (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ России).
В работе были использованы агонисты Toll-подобных рецепторов: липотейхоевая кислота (LTA, лиганд TLR2), синтетический аналог двухцепочечной РНК - полиинозиновая : полицитидиловая кивота (Poly[I : С], лиганд TLR3), монофосфорильное производное липида А (MPL-A, лиганд TLR4), флагеллин (лиганд TLR5), имиквимод (лиганд TLR7/8), синтетический олигонуклеотид ODN-CpG 1826 (лиганд TLR9) - все препараты фирмы InvivoGen, а также липополисахарид из E. coli серотип 055:B5 (LPS, лиганд TLR4, Sigma, L-2880). Кроме того, в работе использовали рекомбинантный фактор некроза опухоли a (TNF-a, Sigma, T7539). В специальных экспериментах применяли cLI-095 (InvivoGen) -специфический ингибитор сигнального пути TLR4.
При микроскопии использовали краситель ДНК -дигидрохлорид DAPI (Sigma).
Животные
Мышей линии BALB/c в возрасте 8-10 недель, полученных из питомника «Столбовая», содержали на стандартной диете в стандартных условиях вивария ГНЦ Института иммунологии ФМБА.
Культуры клеток
Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM с 25 мМ HEPES, дополненной коктейлем заменимых аминокислот, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ Р-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы «ПанЭко») при 37оС в увлажненной атмосфере с 5% CO2.
Линию клеток 293/TLR4-MD2-CD14 (InvivoGen), стабильно трансфицированную TLR4 с корецепто-рами CD14 и MD-2, поддерживали in vitro в присутствии селективных антибиотиков бластицидин и гигромицин в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Для мониторинга активности NF-kB клетки трансдуцировали лентивирусным вектором (Cleveland BioLabs), несущим репортерный ген Р-галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотора. Далее клетки культивировали в соответствии с рекомендациями разработчиков в присутствии дополнительного селективного антибиотика пуромицин.
Суспензии первичных клеток селезенки, костного мозга и брюшной полости мышей готовили общепринятыми методами. Дендритные клетки получали in vitro дифференцировкой клеток костного мозга мышей BALB/c в присутствии грануло-цитарного макрофагального колониестимулирую-щего фактора (GM-CSF, granulocyte-macrophage colony stimulating factor). Костный мозг вымывали из бедренных и больших берцовых костей мыши, эритроциты удаляли осмотическим лизисом, ядро-содержащие клетки дважды отмывали фосфатным буферным раствором (PBS, Amresco, E404), после чего культивировали в полной среде с добавлением 10 нг/мл GM-CSF (Sigma) в течение 7 дней как описано в [4]. К окончанию этого срока неадгезионные клетки содержали 70-75% дендритных клеток. Адгезионная часть культуры была на 95% представлена макрофагами. Для получения макрофагов сначала осторожно удаляли неадгезионные клетки, оставшийся монослой адгезионных клеток отмывали PBS (0.5% БСА), затем приливали раствор Версена («ПанЭко») и выдерживали в течение 1 ч при 4оС, после чего макрофаги смывали PBS (0.5% БСА).
Перитонеальные макрофаги получали путем вымывания клеток из перитонеальной полости интакт-ных мышей BALB/c с помощью PBS, дополненного 1% глюкозы, 10 hM HEPES и 0.5% бычьего сывороточного альбумина. Клетки осаждали центрифугированием, суспензировали в ПС, культивировали в течение 18-20 ч при 37oC в атмосфере 5% CO2. Затем не прилипшие к пластику клетки удаляли, осторожно промывая культуральной средой и PBS. Более 90% оставшихся на пластике, адгезионных, клеток были представлены макрофагами.
Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы со вставкой трансгена
Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы rAd-SEAP, rAd-GFP и rAd-HA со вставкой генов секреторной эмбриональной щелочной фоcфатазы (SEAP), зеленого флуоресцентного белка (GFP) или гемагглютинина вируса гриппа H1N1 (HA) получали на основе плазмиды pShuttle-CMV согласно рекомендациям производителя AdEasy Adenoviral vector system (Stratagene, сat. 240009), используя плазмидные конструкции pGREEN (Carolina Biological Supply Company), p310D (pRcCMV-SEAP) и pAL-HA (обе собственного изготовления). Наличие генов белков GFP, SEAP, HA в соответствующих плазмидных конструкциях pShuttle-CMV-GFP, pShuttle-CMV-SEAP, pShuttle-CMV-HA подтверждали рестрикционным анализом с использованием эндонуклеаз EcoRI, NotI и EcoRV и с помощью ПЦР.
Присутствие генов GFP, SEAP и HA в rAd подтверждали методом ПЦР. Титры препаратов rAd-GFP, rAd-SEAP и rAd-HA определяли методом бляшкообразования в культуре клеток линии HEK-293 [11].
Трансдукция клеток нереплицирующимися рекомбинантными аденовирусными векторами
Культуры клеток трансдуцировали rAd-SEAP, rAd-GFP или rAd-HA из расчета 7-200 БОЕ на клетку. Трансдукцию клеток проводили в 50 мкл бессывороточной среды OpTmizer™ (GIBCO) в течение 1 ч, затем в культуры клеток вносили 150 мкл ПС. Трансдуцированные клетки культивировали в присутствии агониста TLR4 Иммуномакса (10 мкг/мл) или без него в течение 1-6 дней. При изучении влияния других агонистов TLR клетки инкубировали в присутствии LTA (1 мкг/мл), Poly[I : С] (10 мкг/мл), LPS (10 мкг/мл), MPL-A (5 мкг/мл), флагеллина (0.1 мкг/мл), имиквимода (1 мкг/мл), ODN-CpG 1826 (10 нг/мл). Кроме того, для активации клеток, минуя TLR, использовали TNF-a (10 нг/мл). Для ингибиро-вания сигнала TLR4 в культуры клеток вносили CLI-095 (1 мкг/мл).
Трансдукция нереплицирующимися рекомбинантными аденовирусными векторами
in vivo
Для трансдукции восприимчивых клеток in vivo в перитонеальную полость мышей BALB/c вводили rAd-SEAP в количестве 108 БОЕ в 200 мкл физиологического раствора вместе с 10 мкг Иммуномакса или без него (по четыре мыши в каждой экспериментальной группе).
Экспрессию введенного трансгена оценивали по концентрации белка SEAP в крови мышей. С этой целью через 3 сут после введения rAd-SEAP у мышей забирали кровь из ретроорбитального синуса, получали сыворотку и измеряли содержание SEAP в образцах сыворотки.
Измерение интенсивности продукции белков SEAP, GFP и HA, кодируемых rAd
Продукцию секреторного белка SEAP в сыворотке крови или культуральной среде определяли согласно [12] с незначительными модификациями. Тестируемую жидкость осветляли центрифугированием при 14000 g в течение 2 мин, затем прогревали при 65оС в течение 5 мин. Субстрат n-нитрофенилфосфат вносили в реакционном буфере (0.5 М CaCO3, 0.5 мМ MgCl2, рН 9.8), оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм. Активность SEAP выражали в мЕ/мл, считая, что 1 мЕ/мл соответствует увеличению оптической плотности на 0.04 ед./мин.
Продукцию GFP в клетках определяли методом проточной цитофлуориметрии на FACS Aria II (BD Biosciences). Интенсивность флуоресценции определяли в диапазоне длин волн 515-545 нм при лазерном возбуждении на волне 488 нм. Популяции клеток идентифицировали, окрашивая суспензию смесью меченных флуорохромом антител к поверхностным белкам CD11b, CD11c, CD19, Ly6G, F4/80, с последующим анализом на цитофлуориметре FACS Aria II. Кроме того, продукцию GFP в дендритных клетках и макрофагах, меченных антителами к CD11c или F4/80 соответственно, подтверждали с помощью конфокальной микроскопии.
Экспрессию мембранного белка HA определяли, окрашивая клетки моноклональными антителами к HA, с последующим анализом методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACS Aria II.
Конфокальная микроскопия
Культуры клеток инкубировали в полной среде на культуральных слайдах (SPL Life Sciences Ltd., Ю. Корея) со съемным дном в виде предметного стекла. После инкубации клетки фиксировали в течение 20 мин в PBS, содержащем 3.7% па-
раформальдегида (Sigma), промывали PBS с 0.5% БСА и окрашивали антителами в течение 1 ч. После дополнительной отмывки в PBS клетки окрашивали DAPI (1 мкг/мл) в PBS для анализа на конфокальном микроскопе Axio Observer.Zl (Carl Zeiss, Германия) с камерой QuantEM 512SC (Photometries, Великобритания).
Статистическая обработка данных
Все результаты представлены в виде средних значений и соответствующих величин стандартного отклонения. Статистическую значимость различий определяли с использованием t-критерия Стьюдента.
результаты
Усиление экспрессии белка, кодируемого трансгеном в составе rAd, при воздействии Иммуномакса
Нереплицирующиеся rAd трансдуцируют эпителиальные клетки и эффективно экспрессируют в них трансген. Для использования rAd с целью иммунизации важно добиться экспрессии нужного белка-антигена в антигенпредставляющих клетках, в частности в дендритных клетках и макрофагах. В данной работе мы установили, что rAd вполне успешно экспрессируются в первичных дендритных клетках и макрофагах мыши. При введении rAd-GFP в культуры клеток селезенки, костного мозга или перитонеальных макрофагов мы наблюдали экспрессию трансгена в дендритных клетках, макрофагах и гранулоцитах селезенки, дендритных клетках и макрофагах, полученных при культивировании клеток костного мозга в присутствии GM-cSF, а также в макрофагах брюшной полости (рис. 1 и 2). Экспрессия rAd в лимфоидных клетках и, в частности, в В-клетках, CD4 и CD8 Т-клетках, NK-клетках не регистрировалась. Природа клеток, экспрессирующих белок GFP, доказана нами путем одновременного окрашивания моноклональными антителами к CD11c - в случае дендритных клеток, F4/80 - макрофагов и Ly-6G - гранулоцитов. В качестве примера представлены микрофотографии дендритных клеток, содержащих на клеточной мембране молекулы CD11c и экспрессирующих GFP в цитозоле (рис. 3А).
Активация дендритных клеток Иммуномаксом одновременно с трансдукцией этих клеток rAd-GFP приводила к усиленной экспрессии белка GFP. При этом увеличивался как процент дендритных клеток, экспрессирующих GFP (рис 1, 2, 3Б, 4А), так и интенсивность его продукции (рис. 4Б). Подобное усиление экспрессии rAd-GFP мы наблюдали и в макрофагах. Усиление экспрессии трансгена
s х
н
ф
с ф
.а х н X
а ч
х
Ф
п
та ■вО
а
х та
ЗЕ
х J
О
с
X
та а
X
н
ф
с
Q
U
F4/80
о со
CD11b
О •-о
CD11b
D
C
C
C
C
C
Среда
м
0.2%
GFP
-+■ GFP
GFP
CD11b
ñ
0.1%
Трансдукция rAd-GFP
rAd-GFP rAd-GFP + Иммуномакс
л
3.5%
JiLr
- tJ 30% _
А
0.1%
46%
i
0.1%
GFP
Рис. 1. Влияние агониста TLR4 (Иммуномакс) на трансдукцию и экспрессию rAd-GFP в различных типах клеток селезенки мыши. Спленоциты мыши трансдуцировали rAd-GFP (5 х 105 БОЕ/мл) и инкубировали в течение 3 сут в присутствии Иммуномакса (10 мкг/мл) или без него. Затем клетки окрашивали смесью меченных флуо-рохромом антител и анализировали на проточном цитометре FACS Aria II. Левая вертикаль - выделение (gating) CD11c+ дендритных клеток, F4/80+ макрофагов, CD11b+Ly-6G+ гранулоцитов и CD19+ B-клеток с указанием процентного содержания клеток этого типа в общей популяции клеток селезенки. В соответствующих рядах по горизонтали представлено содержание дендритных клеток, макрофагов, гранулоцитов и В-клеток с флуоресценцией GFP после трансдукции rAd-GFP и культивирования с Иммуномаксом или без него. Негативный контроль (среда) - культура клеток селезенки без трансдукции
не зависело от тканевой принадлежности дендритных клеток и макрофагов. Оно отчетливо регистрировалось в дендритных клетках селезенки и костного мозга, а также в макрофагах из селезенки, костного мозга или перитонеальной полости (см. рис. 1-4).
Иммуномакс не изменяет тропности rAd к типам клеток, в которых экспрессируется
При изучении экспрессии rAd в культурах клеток селезенки или костного мозга мыши мы обратили внимание на то, что Иммуномакс усиливает экспрес-
ф * £ &
2 §
м ф О -
5
О X н
и О Ы
О X н
и О X X
I—
та ■вО
а
х та
ЗЕ
ф
S ¡
■©■ та о Ф
^ 5 * о
5 -Е < а
ф □
< i
Q
U
а
и
Среда
. Ч ~ ем* jjrii, 80%
ívjjP^
ч> CD11c
F<_«¡,CPi1l>*ufr»rt
F4/80
.Ц>ПЫ1А»1
81%
á
0.6%
C
F4/80
i
0.1%
О 10? 103 10* to5
—* GFP
Трансдукция rAd-GFP
rAd-GFP rAd-GFP + Иммуномакс
Рис. 2. Влияние агониста TLR4 (Иммуномакс) на трансдукцию и экспрессию rAd-GFP в дендритных клетках и макрофагах, дифференцированных in vitro из клеток костного мозга, а также в макрофагах из перитонеальной полости мыши. Клетки трансдуцировали rAd-GFP (5 х 105 БОЕ/мл) и инкубировали в течение 4 сут в присутствии Иммуномакса (10 мкг/мл) или без него. Затем клетки окрашивали смесью меченных флуорохромом антител и анализировали на проточном цитометре FACS Aria II. Левая вертикаль - выделение (gating) CD11c+I-A+ дендритных клеток и CD11b+F4/80+ макрофагов костного мозга, а также CD11b+F4/80+ макрофагов перитонеальной полости с указанием процентного содержания клеток этого типа в общей популяции клеток. В соответствующих рядах по горизонтали представлено содержание дендритных клеток и макрофагов с флуоресценцией GFP после трансдукции rAd-GFP и культивирования с Иммуномаксом или без него. Негативный контроль (среда) - культура клеток без трансдукции
сию трансгена только в клетках тех типов, в которых вектор экспрессировался в отсутствие Иммуномакса. Под влиянием Иммуномакса не изменялась троп-ность вектора к различным типам клеток. В частности, rAd-GFP экспрессировался в дендритных клетках и макрофагах, но не экспрессировался в CD4 и CD8 Т-клетках, В-клетках и ПК-клетках. Под влиянием Иммуномакса экспрессия rAd-GFP усиливалась только в дендритных клетках, макрофагах и гранулоцитах, в других типах клеток вектор по-прежнему не экспрессировался. В качестве примера представлены результаты исследования В-клеток
(см. рис. 1), в которых rAd-GFP не экспрессировался ни до, ни после их активации Иммуномаксом.
Иммуномакс не влияет на репликацию rAd в специальных клетках HEK-293
Усиление экспрессии трансгена в составе rAd под действием Иммуномакса выдвигает естественный вопрос, не будет ли Иммуномакс активировать репликацию самих аденовирусных частиц. Поскольку репликация rAd в обычных клетках невозможна, для размножения rAd используют специальную клеточную линию НЕК-293, в геном которой
л
Среда
. : .J, - A.* > .t. ущщ- 10 мкм 10 мкм 10 мкм
10 мкм 10 мкм v ^ $ 10 мкм
DIC
Merged Red-CD11c Blue-DAPI
Merged Red-CD11c Blue-DAPI Green-GFP
' <
Иммуномакс
< 4 Л
! ЧГ.
fei« . л
100 мкм
V А лЛ _•
/ 4P
т.
Б
1
2
3
0 мкм
Рис. 3. Конфокальная микроскопия дендритных клеток, трансдуцированных rAd-GFP в присутствии Иммуномак-са или без него. А — культуру костномозговых дендритных клеток инкубировали в полной среде в присутствии rAd-GFP (30 БОЕ на клетку). Через 24 ч клетки фиксировали и окрашивали антителами anti-CD11 с-РЕ. Микроскопию проводили в буфере PBS с DAPI (1 мкг/мл) на конфокальном микроскопе Axio Observer.Z1 (Carl Zeiss, Германия) с камерой QuantEM 512SC (Photometries, Великобритания) с использованием системы лазеров 405. Слева направо представлены изображения клеток в режимах: DIC - дифференциально-интерференционный контраст (1); наложение каналов anti-CD11c-PE (красный) и DAPI (синий) (2); наложение каналов anti-CD11c-PE (красный), GFP (зеленый), DAPI (синий) (3). Б — культура костномозговых дендритных клеток после 24 ч инкубации с rAd-GFP с добавлением Иммуномакса (10 мкг/мл) или без него. На фотографиях представлены наложения каналов GFP (зеленый) и DAPI (синий) с увеличением х20 и Х200
встроены гены области Е1 аденовируса, удаленные из аденовирусного вектора.
Мы проверили, как Иммуномакс влияет на репликацию rAd в культуре клеток линии НЕК-293-^И4/ MD2. В предварительных экспериментах было показано, что Иммуномакс действует через TLR4, активируя продукцию репортерного белка в клетках HЕK-293-TLR4/MD2. Этот эффект Иммуномакса подавляется CLI-095, специфическим ингибитором TLR4-сигнального пути. Как и в клетках НЕК-293, в клетках HЕK-293-TLR4/MD2 происходит активная репликация rAd с развитием через 2-4 дня цитопа-тического эффекта. Мы титровали образец rAd-GFP в клетках линии HЕK-293-TLR4/MD2 в присутствии Иммуномакса или без него. Исходный образец rAd-GFP вносили в три лунки 96-луночной пластиковой панели с 40-50% конфлуентным монослоем клеток HЕK-293-TLR4/MD2. Титрование вируса проводили в 24 последовательных разведениях с шагом разве-
дения в 5 раз. В культурах клеток, где происходила репликация rAd, можно было наблюдать продукцию белка GFP и гибель клеток в течение нескольких дней. Репликация rAd наблюдалась, начиная с максимальной концентрации rAd, и при его последовательных разведениях, вплоть до 13-го. В присутствии Иммуномакса и в его отсутствие (контрольные культуры) последнее разведение rAd-GFP, при котором отмечена экспрессия GFP и цитопатический эффект, составили 513, т.е. Иммуномакс не влиял на репликацию rAd в клетках HЕK-293-TLR4/MD2, имеющих рецепторы TLR4 и отвечающих на Иммуномакс активацией NF-kB.
Иммуномакс усиливает экспрессию трансгенов, кодирующих цитоплазматический, секреторный или мембранный белки
Выше было описано усиление Иммуномаксом экспрессии трансгена, входящего в состав rAd и ко-
А Костномозговые
дендритные клетки
50л О Среда
+ Иммуномакс *
0 ? 22 б? 200
rAd-GFP (БОЕ на клетку)
12-1 1086420
i-1-1-1 i—
0 ? 22 б? 200
rAd-GFP (БОЕ на клетку)
"-S
%
Макрофаги перитонеальной полости
100л О Среда
♦ Иммуномакс ■ LPS '
G
и
к
т
е
л
К
0 ? 22 б? 200
rAd-GFP (БОЕ на клетку)
т
0 ? 22 б?
rAd-GFP (БОЕ на клетку)
~г 200
%
G
и
к
т
е
л
К
12-i
9-
3-
0-Дни
15-
F
5-
Макрофаги костного мозга
О Среда ■ Иммуномакс
—i-1-1-1-1
3 4 б б
после трансдукции rAd-GFP
3 4 б б Дни после трансдукции rAd-GFP
Б
*
Рис. 4. Влияние агониста TLR4 (Иммуномакс) на экспрессию GFP в дендритных клетках и макрофагах в зависимости от дозы rAd-GFP или времени после трансдукции клеток. Костномозговые дендритные клетки и пери-тонеальные макрофаги трансдуцировали rAd-GFP и инкубировали в течение 24 ч в присутствии Иммуномакса (10 мкг/мл), LPS (3 мкг/мл) или без активаторов (среда). Макрофаги костного мозга трансдуцировали rAd-GFP в присутствии Иммуномакса (10 мкг/мл) или без него, а затем инкубировали в течение 6 дней. Образцы клеток отбирали через 3, 4, 5 и 6 дней. Клетки анализировали на проточном цитометре FACS Aria II после окрашивания смесью меченных флуорохромом антител. По осям абсцисс - доза rAd-GFP, использованная для трансдукции клеток, или дни после трансдукции (правая вертикаль). По осям ординат - процент GFP-позитивных клеток (A); средняя интенсивность флуоресценции (MFI), нормированная на значение в контроле без активатора (Б). Представлены средние значения и стандартные отклонения по трем экспериментам. Здесь и на рис. 5 и 6 статистическая значимость отличий P < 0.05 обозначена *
дирующего цитоплазматический белок GFP. Мы установили, что Иммуномакс также усиливает экспрессию трансгенов, кодирующих секреторный и мембранный белки. В этих экспериментах использовали rAd-SEAP и rAd-HA, кодирующие секреторную эмбриональную фосфатазу и мембранный гемагглютинин вируса гриппа соответственно. Экспрессию SEAP оценивали по его концентрации в культуральной жидкости, а экспрессию HA в клеточной мембране измеряли методом проточной ци-тометрии клеток, меченных моноклональными антителами к HA.
На рис. 5А,Б представлены результаты изучения экспрессии rAd-SEAP в дендритных клетках и перитонеальных макрофагах мыши. Из представленных данных видно, что Иммуномакс усиливает
экспрессию секреторного белка SEAP, кодируемого rAd-SEAP. В опытах на моноцитах человека, транс-дуцированных rAd-HA, Иммуномакс тоже вызывал усиление экспрессии мембранного белка HA, кодируемого вектором. Здесь важно отметить, что усиление экспрессии трансгена наблюдалось не только в клетках мыши, но и человека.
Усиление экспрессии rAd Иммуномаксом не только
in vitro, но и in vivo
Принципиально важно было понять, можно ли индуцировать в организме животного описанное выше усиление экспрессии трансгена. Повышение продукции нужного белка было бы весьма полезным как при иммунизации rAd, так и при проведении генной терапии.
Б
я,
I н
I - H
ФР Иммуномакс
Рис. 5. Влияние агониста TLR4 (Иммуномакс) на экспрессию в культурах клеток in vitro и в организме мышей секреторного белка (SEAP), кодируемого в ДНК аденовирусного вектора. A - костномозговые дендритные клетки и перитонеальные макрофаги мыши трансдуцировали rAd-SEAP (5 х 105 БОЕ/мл) и инкубировали в течение 4 сут в присутствии Иммуномакса в указанных концентрациях. Интенсивность продукции белка SEAP определяли по его содержанию (мЕ/мл) в культуральной жидкости. Б - концентрация белка SEAP в крови мышей через 3 дня после введения rAd-SEAP совместно с Иммуномаксом или без него. Опытным мышам (n = 4) в перитоне-альную полость вводили rAd-SEAP в количестве 108 БОЕ на мышь с 10 мкг Иммуномакса в 200 мкл физиологического раствора NaCl. Контрольным мышам (n = 4) вместо Иммуномакса вводили 200 мкл физиологического раствора (ФР). Через 3 сут определяли содержание SEAP в сыворотке крови мышей
А
л м
P A
8-1
6-
4-
2-
Костномозговые дендритные клетки
0 0.01 0.1 1 10 Иммуномакс, мкг/мл
л м
P A
1.0-1 0.80.60.402-
0.0-
Макрофаги
перитонеальной полости *
0 0.01 0.1 1 10 Иммуномакс, мкг/мл
Мы исследовали влияние Иммуномакса на экспрессию трансгена у мышей BALB/c. В качестве вектора использовали rAd-SEAP, который вводили внутрибрюшинно в дозе 108 БОЕ в 200 мкл физиологического раствора. Интенсивность синтеза белка SEAP определяли по его концентрации в крови животных через 3 дня после инъекции rAd-SEAP. Опытным мышам вместе с rAd-SEAP вводили Иммуномакс (10 мкг/мышь). Контрольным мышам вместе с вектором вводили физиологический раствор. Результаты, представленные на рис. 5Б, свидетельствуют, что введение Иммуномакса приводило к статистически значимому повышению продукции в организме мыши белка SEAP, кодируемого вектором rAd-SEAP.
Усиление экспрессии rAd
в антигенпредставляющих клетках происходит под влиянием агонистов TLR2, 4, 5, 7/8 и 9. Агонист TLR3 угнетает экспрессию rAd
Иммуномакс является агонистом TLR4, который усиливает экспрессию трансгена в составе rAd в дендритных клетках и макрофагах. Было интересно узнать, оказывает ли подобное действие другой агонист TLR4, а именно LPS. Кроме того, следовало изучить возможное влияние агонистов других TLR на экспрессию трансгенов, введенных в клетки в составе rAd. На рис. 4 и 6 представлены данные, доказывающие, что LPS усиливает экспрессию трансгенов, как и Иммуномакс. Интересно, что монофосфориль-
ное производное липида А (MPL-A), минимальное действующее начало LPS, тоже активировало экспрессию rAd-GFP. Более того, агонисты TLR2, 5, 7/8 и 9, подобно агонистам TLR4, стимулировали экспрессию генов SEAP и GFP в составе rAd-SEAP и rAd-GFP соответственно (рис. 6А,Б). Повышение экспрессии агонистами TLR2, 4, 5, 7/8 и 9 варьировало в разных экспериментах в 2-11 раз (P < 0.05).
Следует отметить, что усиление экспрессии rAd под действием агониста TLR не было обусловлено образованием комплекса rAd с агонистом или облегчением поступления rAd в клетки. Это было показано в опытах с отмыванием rAd перед внесением в культуру клеток агонистов TLR4 (Иммуномакс, LPS) или, наоборот, путем отмывания агониста TLR4 перед трансдукцией клеток rAd. В обоих вариантах эффект усиления экспрессии rAd не отличался от эффекта, наблюдаемого при одновременном добавлении к клеткам rAd и агониста TLR (рис. 7А,Б).
Совершенно неожиданным оказалось действие агониста TLR3, который, в отличие от агонистов TLR2, 4, 5, 7/8 и 9, вызывал не усиление, а угнетение продукции белка, кодируемого rAd-вектором. Ингибирующее действие TLR3 проявлялось при экспрессии rAd-SEAP и rAd-GFP (рис. 6А,Б).
Активация NF-kB, минуя TLR, тоже приводит к усилению экспрессии трансгена
Все TLR, кроме TLR3, передают внутриклеточный сигнал через адапторную молекулу MyD88,
л
60
о *
н
ш с ы
«НИ
Q.
<
10-
1-
Имиквимод
LTA
тз <
(Ч
ш ю .0 с
о а
н X
о
та
д
<и а U
< и
о
и
к
та
м о
х
м м И
00 Q.
О-
ЗЕ
X
и
с с ш
та с
е
д
о
м
и
в
к
и
м
И
0
а
U
1
Z Q
О
ODN-CpG о
ммуномакс Флагеллин
Poly[I : C]
и к
н
е л
80-
60-
40-
20-
Ю-6 1(И 10^ 10-2 10-1 10° 10' 102 Концентрация лиганда, мкг/мл
*****
LTA
Иммуномакс LPS
Флагеллин Имиквимод
ODN-CpG
■Среда
Poly[I : C]
"1-1-Г"
0 22 67 200
rAd-GFP (БОЕ на клетку)
Рис. 6. Влияние агонистов Toll-подобных рецепторов на трансдукцию и экспрессию rAd-SEAP и rAd-GFP в макрофагах мыши. Макрофаги перитонеальной полости мыши трансдуцировали (A, В) Ad-SEAP 5 х 107 БОЕ/мл или (Б) Ad-GFP 5 х 107 БОЕ/мл, или (Г) Ad-GFP в различной концентрации, а затем инкубировали в течение 4 сут в присутствии агонистов различных TLR. По окончании инкубации определяли содержание SEAP в культуральной жидкости (A, В) или процент GFP-позитивных клеток (Б, Г). В экспериментах (A, Б, В, Г) использованы следующие лиганды: LTA (1 мкг/мл), Poly[I : C] (10 мкг/мл), LPS (10 мкг/мл), MPL-A (5 мкг/мл), флагеллин (1 мкг/мл), имиквимод (1 мкг/мл), ODN-CpG 1826 (10 нг/мл), Иммуномакс (10 мкг/мл). Изменение концентрации лиган-дов (В) отражено по оси абсцисс. Представлены средние значения и стандартные отклонения
Б
В
что, в конечном счете, приводит к активации фактора NF-kB. Мы предположили, что усиление экспрессии трансгена агонистами ТLR определяется активацией сигнальной оси MyD88 ^ NF-kB. Это
предположение было проверено двумя способами -блокированием передачи сигнала с ТLR на MyD88 и активацией NF-kB в обход ТLR. Передачу сигнала с ТLR4 на MyD88 мы блокировали с помощью
л
о
X X н
ш с ы
О
X X н
ш с
60-
40
20-
п
Иммуномакс -LPS -Вирус отмыт -
О
и к т
ш с ы
зон ,—*—;
20-
10-
*
i-1
Рис. 7. Усиление экспрессии rAd-GFP при последовательном (раздельном) использовании rAd-GFP и аго-нистов TLR4. А - перитонеальные макрофаги (2 х 104 на лунку) инкубировали в полной культуральной среде в присутствии Иммуномакса (10 мкг/мл) в течение 4 ч, затем клетки трижды отмывали PBS, после чего в культуры вносили rAd-GFP (70 БОЕ на клетку). Через 24 ч культивирования при 37оС в СО2-инкубаторе культуральную жидкость заменяли на раствор Вер-сена («ПанЭко») и культуры оставляли на 1 ч при 4оС, затем клетки смывали PBS c 0.5% БСА и анализировали содержание GFP-позитивных клеток на цитофлуори-метре FACS Aria II. Б - перитонеальные макрофаги (2 х 104 на лунку) инкубировали в течение 2 ч в полной культуральной среде с добавлением rAd-GFP (70 БОЕ на клетку), после чего часть лунок трижды отмывали PBS, а затем вносили полную культуральную среду с Иммуномаксом (10 мкг/мл) или LPS (3 мкг/мл). Контролем служили аналогичные культуры без активатора. Через 24 ч клетки снимали раствором Версена и определяли содержание GFP-позитивных клеток на цитофлуориметре FACS Aria II
специфического ингибитора CLI-095. Активацию NF-kB, минуя TLR, осуществляли с помощью ци-токина TNF-a, который действует на NF-kB через рецепторы TNF.
Полученные данные представлены на рис. 8 и 9. Как и предполагалось, ингибитор CLI-095 отменяет вызванные Иммуномаксом или LPS эффекты усиления экспрессии rAd-GFP (рис. 8). Активация перитонеальных макрофагов рекомбинантным TNF-a (10 нг/мл) вызывала такое же усиление экспрессии SEAP и GFP (рис. 9), как и воздействие Иммуномаксом. Последнее означает, что активация TLR-путей не обязательна, достаточно активировать в клетках NF-kB, чтобы индуцировать усиленную экспрессию трансгенов в составе rAd.
Иммуномакс LPS CLI-095
I I
+
+ + +
Рис. 8. Селективный ингибитор TLR4-сигнала (CLI-095) отменяет усиление экспрессии rAd-GFP, вызванное агонистами TLR4. Перитонеальные макрофаги инкубировали в течение 1 ч в полной культуральной среде с добавлением CLI-095 (1 мкг/мл) или без него, после чего в среду добавляли rAd-GFP (70 БОЕ на клетку) и Иммуномакс (10 мкг/мл) или LPS (3 мкг/мл). Контролем служили аналогичные культуры без активатора. Через 24 ч клетки снимали раствором Версена и анализировали содержание GFP-позитивных клеток на цитофлуориметре FACS Aria II
обсуждение
Рекомбинантные нереплицирующиеся аденовирусные векторы трансдуцируют эпителиальные клетки, а также дендритные клетки и макрофаги. Клетки двух последних типов являются профессиональными антигенпредставляющими клетками, потому они представляют особый интерес при иммунизации rAd. Экспрессия кодируемых rAd целевых белков в антигенпредставляющих клетках определяет успех вакцинных препаратов на основе rAd. Для эффективной индукции клеточного и гуморального иммунного ответа на белковый антиген необходимо выполнение, как минимум, двух критических условий. Во-первых, на поверхности антигенпредставляющих клеток должна происходить экспрессия пептидных фрагментов белка-антигена в комплексе с молекулами MHC классов I и II. Во-вторых, на поверхности тех же клеток должны экспрессироваться коактива-торные молекулы CD80, CD86 и CD40, обеспечивающие активацию специфических к антигену Т-клеток
Б
5 щ
О
Ф 20
Рис 9. Цитокин Т^-а усиливает экспрессию белков GFP и SEAP в макрофагах, трансдуцированных rAd со вставкой генов GFP и SEAP. Перитонеаль-ные макрофаги мыши трансдуцировали rAd-SEAP (5 х 107 БОЕ/мл) или ^^Р (5 х 107 БОЕ/мл), а затем инкубировали в течение 4 дней в присутствии Иммуномакса (10 мкг/мл) или Т^-а (10 нг/мл). Контролем служили аналогичные культуры без активатора. По окончании инкубации определяли содержание SEAP в культуральной жидкости или процент GFP-позитивных клеток
при контакте с антигенпредставляющей клеткой. Первое условие выполняется, если целевой антиген производится дендритными клетками и макрофагами, трансдуцированными rAd. Для выполнения второго условия необходима активация дендритных клеток и макрофагов через рецепторы или иным образом.
В нашей работе мы показали, что белки, кодируемые трансгенами в составе rAd-векторов, экс-прессируются в дендритных клетках и макрофагах (рис. 1-3). Дополнительная активация антигенпред-ставляющих клеток с помощью агониста ТLR4 приводит к усиленной экспрессии коактиваторных молекул CD80, CD86 и CD40. Кроме того, как показано в нашей работе, под влиянием агониста ТLR4 происходит усиление экспрессии целевого белка (рис. 1-4). Усиленная продукция белка-антигена, наряду с экспрессией коактиваторных молекул CD80, CD86 и CD40, может способствовать повышению эффективности иммунных реакций, когда для иммунизации используется сочетание rAd и агониста ТLR4. Ранее мы показали, что сочетанная иммунизация rAd-HA, кодирующим гемагглютинин вируса гриппа, с фармацевтическим агонистом ТLR4 (Иммуномакс) позволяет повысить эффективность вакцинации против вирусов гриппа А и В [7].
Векторы rAd могут использоваться не только для вакцинации, но и для генной терапии. В этом случае введение в организм больного rAd со вставкой трансгена обеспечивает продукцию терапевтического белка, как минимум, в течение 2-3 недель. Показанная нами возможность усиления продукции белка, кодируемого геном, встроенным в состав rAd, путем дополнительного введения агониста ТLR4 может быть важна для повышения эффективности генной терапии с помощью rAd. Возможно, что сочетание rAd с агонистом ТLR4 позволит получить терапевтический белок в более высоких концентрациях, чем при использовании только rAd, или получать белок в нужной концентрации при введении меньшего количества rAd.
Молекулярная сигнализация через То11-подобные рецепторы была предметом детального изучения в течение последних 15 лет. Результаты этих исследований привели к пониманию внутриклеточных сигнальных событий, индуцируемых воздействием лигандов ^П/2, ТLR2/6, ТLR3, ТLR4, ТLR5, ТLR7/8, ТLR9 в клетках мыши и человека [13, 14]. Оказалось, что от ТLR идут два типа сигнальных каскадов. Один начинается с адапторных молекул, в число которых обязательно входит MyD88, и заканчивается активным фактором NF-kB. Другой начинается с адапторных молекул, среди которых обязательно должен быть ТRIF, и заканчивается факторами транскрипции семейства IRF, в частности
Сигнальный путь MyD88 — NF-kB используется при воздействии агонистов на рецепторы ТLR1/2, ТLR2/6, ТLR5, ТLR7, ТLR8 и ТLR9. Сигнальный путь ТRIF — IRF действует при активации ТLR3. Отличительная особенность ТLR4 - использование обоих сигнальных путей. Сразу после действия агониста ТLR4 передает сигнал с внешней клеточной мембраны по пути MyD88 — NF-kB. Чуть позже, после эндоцитоза лиганд-рецепторных комплексов, ТLR4 использует вторую сигнальную цепь ТRIF — IRF.
В нашей работе обнаружено, что агонисты различных ТLR стимулируют продукцию белков, ген которых встроен в rAd. Усиление экспрессии трансгена мы наблюдали при использовании агонистов ТLR2, ТLR4, ТLR5, ТLR7/8 и ТLR9 (рис. 6А,Б). Противоположным оказалось влияние агониста ТLR3. При воздействии Ро1у[1 : С] одновременно с трансдукцией дендритных клеток и макрофагов rAd-GFP или rAd-SEAP подавлялась продукция GFP и SEAP (рис. 6А,Б). Сравнивая внутриклеточные сигнальные пути, идущие от разных ТLR, мы предположили, что активация NF-kB может отвечать за усиленную продукцию, а активация IRF лежит
^1/2, ^2/6, TLR5
Усиление экспрессии трансгена
С-?
TRIF \
I
V
IRF
Усиление экспрессии трансгена
Подавление экспрессии трансгена
Рис. 10. Возможный механизм усиления или подавления агонистами различных экспрессии белка, кодируемого трансгеном в составе аденовирусного вектора
в основе подавления продукции белка, кодируемого трансгеном в составе rAd.
Особый случай - агонисты TLR4. Поскольку при использовании агонистов TLR4 происходит усиление продукции белков, кодируемых rAd, мы предполагаем, что сигнальная ветвь MyD88 — NF-kB доминирует над сигнальной ветвью TRIF — IRF (рис. 10).
Предположение о стимулирующей роли сигнальной оси MyD88 — NF-kB отчасти подтверждается нашими результатами. CLI-095, селективный блокатор передачи сигнала с TLR4 на адапторную молекулу MyD88, отменяет повышение продукции белка, кодируемого rAd, под действием агонистов TLR4 (рис. 8). В свою очередь, активация NF-kB «в обход» TLR приводит к усиленной экспрессии трансгенов в составе rAd. Так, при активации клеток цитокином TNF-a одновременно с трансдукцией rAd-SЕAP или rAd-GFP мы наблюдали повышение продукции SЕAP и GFP соответственно (рис. 9). Известно, что сигналы TNF-a передаются через рецепторы TNFR1 и TNFR2. Внутриклеточный сигнальный путь заканчивается активацией NF-kB. Следовательно, активация NF-kB, минуя рецепторы TLR, также приводит к усилению экспрессии трансгена, что не доказывает, но говорит в пользу предположения о стимуляции продукции белка, кодируемого этим геном под действием NF-kB.
Использованные нами конструкции rAd-GFP, rAd-SЕAP и rAd-HA содержали ген соответствующего белка под контролем реагирующего на NF-kB CMV-промотора с четырьмя сайтами, узнаваемыми NF-kB [15]. Вполне логично предположить, что дополнительная активация NF-kB агонистами TLR2,
TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 и TLR9 может усиливать транскрипцию генов, контролируемых CMV-промотором.
В принципе, TLR-сигнализация может влиять на продукцию белка, воздействуя на транскрипцию, трансляцию или другие важнейшие процессы в клетке. Точные механизмы, приводящие к усилению экспрессии трансгенов при активации TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 и подавлению продукции белка, кодируемого трансгеном в составе rAd, при активации TLR3, еще предстоит установить.
Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы используются не только для иммунизации, но и в генной терапии. Описанные в нашей работе эффекты агонистов TLR на экспрессию трансгенов в составе аденовирусных векторов намечают перспективное направление - разработку способов направленной регуляции экспрессии трансгенов в организме. В идеале могут быть разработаны методы, которые позволят после введения трансгена в организм больного усиливать или подавлять экспрессию его белка-продукта в зависимости от поставленной задачи.
заключение
В нашей работе изучено влияние агонистов ^П-подобных рецепторов на эффективность трансдук-ции и экспрессии rAd в антигенпредставляющих клетках животных и человека. Установлено, что агонисты TLR2, 4, 5, 7, 8 и 9 значительно усиливают продукцию трансгенного белка в клетках, трансдуциро-ванных rAd со вставкой соответствующего трансгена. Эффект усиления наблюдается в дендритных клетках и макрофагах, экспрессирующих цитоплазма-
тический (GFP), мембранный (HA) или секреторный (SEAP) белки. В экспериментах на лабораторных мышах показано, что усиление экспрессии целевого белка с помощью фармацевтического агониста TLR4 происходит и в организме животного. В отличие от агонистов других TLR, агонист TLR3 подавляет продукцию белка (GFP или SEAP) в клетках, транс-дуцированных rAd со вставкой соответствующего трансгена.
Молекулярные механизмы усиления и подавления экспрессии rAd в антигенпредставляющих клетках, активированных различными агонистами TLR, еще предстоит изучить. В представленной работе приведены данные в пользу предположения, согласно которому усиление экспрессии rAd происходит в результате активации фактора транскрипции NF-kB, а подавление обусловлено активацией факторов транскрипции серии IRF. •
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Arama C., Assefaw-Redda Y., Rodriguez A., Fernández C., Corradin G., Kaufmann S.H., Reece S.T., Troye-Blomberg M. // Vaccine. 2012. V. 30. № 27. P. 4040-4045.
2. Hoft D.F., Blazevic A., Stanley J., Landry B., Sizemore D., Kpamegan E., Gearhart J., Scott A., Kik S., Pau M.G., et al. // Vaccine. 2012. V. 30. № 12. P. 2098-2108.
3. Scallan C.D., Tingley D.W., Lindbloom J.D., Toomey J.S., Tucker S.N. // Clin. Vaccine Immunol. 2013. V. 20. № 1. P. 85-94.
4. Sharma A., Tandon M., Bangari D.S., Mittal S.K. // Curr. Drug Ther. 2009. V. 4. № 2. P. 117-138.
5. INGN 201: Ad-p53, Ad5CMV-p53, adenoviral p53, p53 gene therapy-introgen, RPR/INGN 201. // Drugs R D. 2007. V. 8. № 3. Р. 176-187.
6. Pearson S., Jia H., Kandachi K. // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. № 1. P. 3-4.
7. Атауллаханов P.P., Шмаров М.М., Седова Е.С., Логунов Д.Ю., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М. // Патент № W02013129961 A1 РФ. C07K16/10, A61P31/16, C12N15/44, C07K14/11, A61K39/145. 2012.
8. Shmarov M.M., Sedova E.S., Verkhovskaya L.V., Rudneva I.A., Bogacheva E.A., Barykova Y.A., Shcherbinin D.N., Lysenko A.A., Tutykhina I.L., Logunov D.Y., et al. // Acta Naturae. 2010. V. 2. № 1. P. 111-118.
9. Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Шишкова Н.М., Мастер-нак Т.Б., Малкина Е.Ю., Ульянова Л.И., Стеценко О.Н. // Иммунология. 2005. № 2. С. 111-120.
10. Мельникова Т.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М. // Заявка на патент RU 2013151824, приоритет 21.11.2013.
11. Graham F.L., Prevec L. // Methods in Mol. Biol. 1991. V. 7. P. 109-127.
12. Berger J., Hauber J., Hauber R., Geiger R., Cullen B.R. // Gene. 1988. V. 66. № 1. P. 1-10.
13. Newton K., Dixit V.M. // Cold Spring Harb. Perspect. Biol.
2012. V. 4. № 3. a006049. P. 1-19. doi: 10.1101/cshperspect.a006049
14. Lim K.H., Staudt L.M. // Cold Spring Harb. Perspect. Biol.
2013. V. 5. № 1. a011247. doi: 10.1101/cshperspect.a011247.
15. Lee Y., Sohn W.J., Kim D.S., Kwon H.J. // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. № 6. P. 1094-1105.
