CC BY
85
ORIGINAL ARTICLE
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.248-092.9
Бабахин А.А.1, Ласкин А.А.1, Никонова А.А.1, Камышников О.Ю.1, Царев С.В.1, Шиловский И.П.1, Маркина А.А.1, Апарин П.Г.1, Вонг Х.2, Хаитов М.Р.1
МОДЕЛИРОВАНИЕ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ С НЕЙТРОФИЛЬНЫМ ФЕНОТИПОМ ВОСПАЛЕНИЯ
1 ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г Москва, Россия;
2 Нанкинский университет, 210008, г. Нанкин, Китай
Введение. По типу воспаления бронхиальная астма подразделяется на эозинофильную, нейтрофильную и смешанную (эозинофилыно-нейтрофилыную). Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что воздействие липополисахаридов (ЛПС) грамотрицательных бактерий может влиять на развитие и тяжесть астмы. Целью данной работы было создание мышиной модели нейтрофильной астмы с использованием для челленджирования ЛПС совместно с аллергеном.
Материал и методы. Мышей BALB/c разделили на 7 групп. Группу 1 иммунизировали три раза с двухнедельными интервалами в/б овальбумином (ОА) в смеси с гидрокисью алюминия Al(OH)3 и челленджировали (разрешали) на 41-, 42- и 43-й дни только ОА. Группу 2 иммунизировали п/к три раза с двухнедельными интервалами; 1-й раз — овальбумином в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), 2-й и 3-й раз — овальбумином в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) и челленджировали аэрозольно ОА в смеси с ЛПС, полученным из S. sonnei. Группы 3 и 4 иммунизировали так же, как и группу 2, однако аэрозольно челленджировали ОА в смеси с ЛПС, полученными из K. pneumoniae и C. auroginosa соответственно. Группа 5 служила «отрицательным контролем», когда иммунизацию и челленджирование проводили фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ). Группы 6 и 7 были однократно иммунизированы ОА в смеси с ПАФ и аэрозольно челленджированы в дни 22-й, 23-й только ОА (группа 6) или ОА в смеси с ЛПС, полученным из E. coli (группа 7). Через 24 ч после последнего челленджирования во всех группах измеряли гиперреактивность бронхов в ответ на метахолин с помощью плетизмографии всего тела. Через 48 ч после последнего челленджирования во всех группах собирали бронхо-альвеолярно лаважную жидкость (БАЛ) для дифференцированного подсчета клеток и извлекали лёгкие для гистологического анализа. Анти-ОА IgE, IgG1, IgG2a в индивидуальных сыворотках мышей всех групп, собранных после челленджирования, определяли с помощью стандартного иммуноферментного анализа (ИФА).
Результаты. Гиперреактивность бронхов в ответ на возрастающие концентрации метахолина плавно возрастала в группах 1, 2, 3, 4, 6, 7 по сравнению с контрольной группой 5. Анти-ОА IgE был на высоком уровне во всех экспериментальных группах, если сравнивать с контрольной группой 5, однако в группах 2, 3 и 4 уровень анти-ОА IgE оказался несколько ниже такового в группе 1. Анти-ОА IgG1 и IgG2a отмечены на высоком уровне в группах 1, 2, 3 и 4, если сравнивать с группой 5. Анализ клеточного состава БАЛ в группе 1 показал повышенное содержание эозинофилов в сравнении с группой 5. В то же время в БАЛ групп 2, 3 и 4 отмечалось существенное повышение количества нейтрофилов по сравнению с группами 1 и 5. Картина общего аллергического воспаления была ярко выражена в группах 1—4 и 6, 7. Перибронхиальная и периваскулярная клеточная инфильтрация с преимущественным содержанием эозинофилов наблюдалась в группе 1, тогда как в группах 2, 3 и 4 содержание нейтрофилов в инфильтратах было существенно выше такового в контрольной группе 5 и в группе 1.
Выводы. Полученные данные свидетельствуют о том, что иммунизация мышей аллергеном в смеси с ПАФ и челленджирование тем же аллергеном одновременно с ЛПС ведет к формированию нейтрофильного фенотипа аллергического воспаления в лёгких.
Ключевые слова: бронхиальная астма; моделирование астмы; нейтрофильное воспаление; липополисахариды. Для цитирования: Бабахин А.А., Ласкин А.А., Никонова А.А., Камышников О.Ю., Царев С.В., Шиловский И.П., Маркина А.А., Апарин П.Г., Вонг Х., Хаитов М.Р. Моделирование бронхиальной астмы с нейтрофильным фенотипом воспаления. Immunologiya. 2017; 38(4): 199-205. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-199-205
Babakhin A.A.1, Laskin A.A.1, Nikonova A.A.1, Kamishnikov O.Yu.1, Tsarev S.V.1, Shilovsky I.P.1, Markina A.A.1, Aparin P.G.1, Wang H.2, Khaitov M.R.1
MODELLING OF BRONCHIAL ASTHMA WITH NEUTROPHILIC PHENOTYPE OF INFLAMMATION
1 NRC — Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russia;
2 School of Medicine, Nanjing University, Nanjing Shi, Jiangsu Sheng, China
The aim of this study was to create a mouse model of neutrophilic asthma using model allergen ovalbumin (OVA) and different types of lipopolysaccharides (LPS). Mice BALB/c were divided into 7 groups. Group 1 was i.p. immunized with mixture of OVA and Al(OH)3 3 times in two week intervals and challenged on days 41, 42, 43 with OVA only. Group 2 was s.c. immunized with mixture of OVA and Complete Freund's adjuvant (CFA) and Incomplete Freund's adjuvant (IFA) 3 times in two week intervals and then challenged on days 41, 42, 43 by aerosol administration with mixture of OVA and LPS obtained from S. sonnei. Groups 3 and 4 were sensitized by the same manner but challenged with mixture of OVA and
Для корреспонденции: Бабахин Александр Александрович, E-mail: aa.babakhin@nrcii.ru
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
LPSs obtained from K. pneumonia and C. auroginosa, respectively. Group 5 was used as a negative control where mice were immunized and challenged with PBS only. Groups 6 and 7 were s.c. immunized with mixture of OVA and CFA and challenged on days 22 and 23 with OVA only (group 6) or OVA together with LPS obtained from E.coli (group 7). Twenty-four hours after the final challenge, airway hyperresponsiveness (AHR) to methacholine was measured using whole body plethysmography. 48 hours after the final challenge bronchoalveolar lavage (BAL) was collected for cells differential count and lungs were removed for histological examination. Anti-OVA IgE, IgG1 and IgG2a in sera collected after the challenge were detected by ELISA. AHR to increasing concentrations of methacholine in groups 1—4 and 6, 7 was moderately increased in compare to control group 5. Anti-OVA IgE was at high level in all experimental groups in comparison to control group 5. At the same time in groups 2, 3, 4 anti-OVA IgE was lower than that of group 1. Anti-OVA IgG1 and IgG2a were at highest levels in groups 1, 2, 3, 4 if compare to group 5. Analysis of cell composition in BAL demonstrated an increase of eosinophils in group 1 compared to control group 5. While in groups 2, 3, 4 a significant increase of neutrophils in compare to groups 1 and 5 was observed. General presentation of allergic inflammation in the lungs of mice groups 1—4 and 6, 7 was more pronounced as compared to control group 5. Peribronchial and perivascular infiltration with eosinophils observed in group 1 only while in groups 2, 3, 4 the number of neutrophils in peribronchial and perivascular infiltrates was significantly increased in compare to control group 5 or group 1. These data indicate that sensitization of mice with allergen together with CFA and consequently challenge with specific allergen together with LPSs leads to formation of neutrophilic type of allergic inflammation in the lungs.
Keywords:
For citation: Babakhin A.A., Laskin A.A., Nikonova A.A., Kamishnikov O.Yu., Tsarev S.V., Shilovsky I.P., Markina A.A., Aparin P.G., Wang H., Khaitov M.R. Modelling of bronchial asthma with neutrophilic phenotype of inflammation. Immunologiya. 2017; 38(4): 199-205 .DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-199-205 For correspondence: Babakhin Aleksandr Aleksandrovich, E-mail: aa.babakhin@nrcii.ru
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. work is performed under the grant RFBR № 16-54-53089.
Received 04.03.17 Accepted 14.04.17
введение
Гетерогенность бронхиальной астмы (БА) в настоящее время — общепризнанный факт [1]. Фенотипы БА классифицируются по клинико-биологическим параметрам или на основании кластерного анализа. При клинико-биологическом анализе фенотипы разделяют по тяжести и характеру течения астмы, по этиологическим и триггерным факторам болезни (атопическая, аспириновая и т. д.), типу воспаления (эозинофильная астма (ЭА), нейтрофильная (НА), смешанная эозинофильно-нейтрофильная и редко встречающаяся малогранулоцитарная) [2—4]. Основу патогенеза любого фенотипа астмы составляет воспаление дыхательных путей. Тип воспаления не определяется этиологическим фактором. Например, эозинофильное воспаление выявляют при ато-пической, неатопической, аспириновой, профессиональной астме. Нейтрофильное воспаление может развиться в ответ на инфекционное поражение (бактериальное, вирусное) либо вследствие воздействия внешних повреждающих факторов (аэрополлютантов, табачного дыма, озона, агрессивных профессиональных факторов) [5]. Нейтрофильное и эо-зинофильное воспаления имеют некоторые общие черты, но отличаются от воспаления при хронической обструктивной болезни лёгких [6].
НА ассоциируется с агрессивным течением заболевания, значительной деструкцией тканей и характеризуется низким ответом на терапию кортикостероидами (ГКС). Так, выраженное нейтрофильное воспаление находят при аутопсии пациентов с летальным исходом обострения астмы [2]. Ней-трофильное воспаление приводит к развитию эмфиземы лёгких [7, 8]. Значительное снижение эффективности ГКС при НА подтверждается многими авторами [9—11]. Более того, терапия ГКС, особенно системными, сама провоцирует развитие нейтрофильного воспаления за счёт вызываемого кор-тикостероидами торможения апоптоза нейтрофилов [12, 13].
Фенотипом астмы с преобладающим нейтрофильным воспалением является сочетание «астма-ХОБЛ», а также «астма у курящего пациента» [14], «менопаузальный» фенотип (неаллергическая астма тяжёлого течения, с поздним дебютом, совпадающим с периодом угасания репродуктивной функции женщины), сочетание астмы и ожирения [15]. При ней-трофильном типе воспаления повышен уровень ГЬ-8, ГЬ-17,
нейтрофильной эластазы и высокомолекулярной формы ма-триксной металлопротеиназы-9 [16, 17]. Значительную роль в поддержании воспаления играют Th-17-клетки [18].
Для изучения патогенеза и оценки новых подходов в терапии «нейтрофильной» БА совершенно очевидна необходимость создания экспериментальных моделей НА на животных, отличающихся по фенотипу от моделей «эози-нофильной» БА. Цель данного исследования — разработка мышиной модели «нейтрофильной» БА (НА).
Материал и методы
Экспериментальные данные получены с использованием мышей-самок линии BALB/c из питомника ГУНЦБМТ «Столбовая». В начале эксперимента возраст мышей составлял 8 нед при весе 18—20 г Вся работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Мин-здравсоцразвития РФ от 19.06.2003 г. № 267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации» и «Положением об этическом отношении к лабораторным животным ГНЦ Института иммунологии ФМБА России».
В течение всего эксперимента мыши находились в «клетках для содержания лабораторных животных Т-3» (производство Россия), по 10 животных в клетке, со стерилизованной мелкой стружкой в качестве подстила, в соответствии с нормами размещения. Температура воздуха в виварии 23°C, относительная влажность — 40—60%, световой режим — (12:12 ч). Во время эксперимента мышам был обеспечен неограниченный доступ к воде (ГОСТ 2874—82 Вода питьевая). Гигиенические требования и контроль за качеством гранулированного корма (производства ООО «Лабораторкорм», Россия), в качестве которого использовали полнорационный экструдированный комбикорм (рецепт ПК-120) для содержания лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков), были зафиксированы в сертификате соответствия № РОСС RU. ПР 98. В 01272, ГОСТ Р 51849—2001 Р.5.
Мышей BALB/c иммунизировали овальбумином (ОА) (Sigma) внутрибрюшинно (в/б) или подкожно (п/к) в различных дозах, однократно или трехкратно с двухнедельным интервалом в смеси с Al(OH)3 (Sigma), либо с полным адъюван-том Фрейнда (ПАФ), либо с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) (оба Sigma).
Сухие препараты ЛПС Shigella sonnei (S. sonnei) и
ORIGINAL ARTICLE
10 9 8 7 6 5 4 3 2
ШГруппа 1
5 Группа 2
£ Группа 3
$ Группа 4
Й Группа 5
$ Группа 6
Ж Группа 7
*
. I 1
Г
к
PBS 6,25 12,50 25,00
Концентрация метахолина, мг/мл
Рис. 1. Гиперреактивность бронхов у мышей BALB/c с НА.
Escherichia coli (E. coli) O: 55 были получены из инактиви-рованной фенолом клеточной культуры S. sonnei, фаза 1, и E. coli O: 55 соответственно по методу фенольной экстракции, предложенной O. Westphal [19]. ЛПС энтеробактерий (мЛПС) обработали РНКазой и ДНКазой и далее — протеи-назой К для удаления нуклеиновых кислот и белковых примесей соответственно.
Очищенные препараты wЛПС S. sonnei и E. coli O: 55 далее были подвергнуты препаративному ультрацентрифугированию (29 000 об/мин) в течение 3 ч. После лиофилизации супернатанта с высоким выходом были получены препараты, которые, по данным SDS-электрофореза, содержали в основном высокомолекулярные ЛПС, т. е. ЛПС с достаточно длинными (10—15 повторяющихся звеньев) О-полисахаридными цепями.
wЛПС S. sonnei был подвергнут мягкому щелочному гидролизу с целью модификации (дезацилированию) wЛПС по липиду А, обеспечивающей неизменность первичной структуры О-полисахарида, что было подтверждено данными 13С-ЯМР-спектроскопии, из которых следовало, что структура повторяющихся полисахаридных цепей соответствует описанной в литературе [20].
Структуру липида А, модифицированного ЛПС (мЛПС) S. sonnei оценивали с помощью масс-спектрометрии. Согласно проведённому анализу, препарат мЛПС S. sonnei содержал в основном триацильные производные липида А, с небольшой примесью ди- и тетраацильных производных,
Для оценки параметров эндотоксичности мЛПС S. sonnei использовали тест на пирогенность на кроликах (3 особи в группе), так как пирогенность является ключевым критерием безопасности (низкой эндотоксичности) ЛПС грамо-трицательных бактерий. Препарат считается апирогенным, если не вызывает подъём температуры ни у одного из трёх подопытных кроликов более чем на 0,6°C по сравнению с исходной температурой, а сумма подъёмов температур у трёх подопытных кроликов не превышает 1,4°C [21].
При проверке пирогенности in vivo мЛПС S. sonnei в дозе 0,025 мкг/кг не вызывал подъёма температуры ни у одного из трёх подопытных кроликов более чем на 0,1°C по сравнению с исходной температурой, а сумма подъёмов температур у трёх подопытных кроликов не превышала ± 0,7°C. Таким образом с помощью модификации липида А удалось получить апирогенный низкоэндотоксичный ЛПС (НЭТ-ЛПС) S. sonnei.
В работе также использовали стандартные коммерческие препараты ЛПС, полученные по методу Westphal —
wЛПС Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa (оба Sigma—Aldrich, США).
Мыши были разделены на 7 групп. Группу 1 иммунизировали в/б трижды: 1-й и 2-й раз 20 мкг/мышь ОА в смеси с Al(OH)3 (2 мг/мышь), 3-й раз — 10 мкг/мышь ОА в смеси с 2 мг/мышь Al(OH)3. На 41, 42 и 43-й дни проводили челленджирование овальбумином (ОА) аэрозольно в концентрации 1%.
Группу 2 иммунизировали в/б трижды: 1-й раз 20 мкг/ мышь ОА в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), 2-й раз — 20 мкг/мышь ОА в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ), 3-й раз 10 мкг/мышь ОА в смеси с НАФ. На 41-, 42- и 43-й дни проводили челленджирование аэрозольно ОА в концентрации 0,1% в смеси с НЭТ-ЛПС S. sonnei.
Рис. 2. Уровни анти-ОА IgE (а), IgG1 (б), IgG2а (в) антител у мышей BALB/c с НА после челленджирования ОА в смеси с различными ЛПС.
1:10; для IgG1 — 1:50 000; для IgG2a
Разведения сывороток для ^Е — 1:800.
Здесь и на рис. 3—5: * — достоверное отличие от 5-й группы ф < 0,05); # — достоверное отличие от 1-й группы ф < 0,05).
Иммунология. 2017; 38(4)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-199-205 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рис. 3. Общая клеточность БАЛ у мышей BALB/c с НА.
Группу 3 иммунизировали так же, как и группу 2, и чел-ленджировали аэрозольно ОА в концентрации 0,1% в смеси с w.nC K. Pneumoniae.
Группу 4 иммунизировали так же, как и группу 2, и чел-ленджировали аэрозольно ОА в концентрации 0,1% в смеси с w.nC P. Aeruginosa.
Группа 5 — отрицательный контроль; мыши были иммунизированы и челленджированы аэрозольно фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) в те же сроки, что и в группах 1—4.
Группа 6 была иммунизирована п/к 20 мкг/мышь ОА в смеси с ПАФ и на 22-й и 23-й дни — челленджирована аэро-зольно ОА в концентрации 0,1%.
Группа 7 была иммунизирована так же, как и группа 6, и челленджирована аэрозольно в те же сроки ОА в концентрации 0,1% в смеси с w.nC E.coli O: 55.
Для аэрозольного челленджирования использовали пластиковую камеру объёмом 5 л, скорость потока воздуха в небулайзере — 6 л/мин, размер аэрозоля — 3—4 время экспозиции — 30 мин. Концентрация названных ЛПС в небулайзере, при челленджировании совместно с ОА составляла 0,004% (вес/объём). Спустя 24 ч после последнего челленджирования (разрешения) в группах 1—7 измеряли гиперреактивность бронхов (ГРБ) в ответ на различные концентрации метахолина с помощью плетизмографии всего тела [22]. Через 48 ч после последнего челленджирования во всех группах забирали бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ) для оценки общего количества клеток и для дифференцированного подсчёта провоспалительных клеток. Правое лёгкое от каждой мыши помещали в 10% раствор формалина для дальнейшего гистологического исследования. Гистопатоло-гические изменения в лёгких были оценены с помощью полуколичественной бальной системы [23]. Анти-ОА IgE, IgG1 и IgG2a антитела определяли по стандартной методике с по-
мощью твёрдофазного ИФА в индивидуальных сыворотках, полученных после челленджирования.
Данные обрабатывали с использованием программы Статистика 10.0 и представляли в виде M ± m. Для оценки различий между независимыми выборками применяли непараметрический критерий Манна—Уитни, между зависимыми выборками использовали критерий Вилкоксона. Достоверными различиями сравниваемых параметров считали значе-нияp < 0,05.
результаты
Анализ данных по гиперреактивности бронхов свидетельствует о том, что ГРБ у мышей групп 1—4 и 7 существенно выше таковой у мышей группы отрицательного контроля (группа 5). Максимальные показатели sRaw отмечались на концентрацию метахолина 25 мг/мл, причём при этой концентрации достоверные отличия были в группе 2 (рис. 1).
Анализ анти-ОА антителообразования показал, что уровень анти-ОА IgE в группе 1 был максимальным и сходным с таковым в группах 6 и 7 (существенно выше, чем в группе 5). В то же время уровни анти-ОА IgE в группах 2—4 были существенно ниже, чем в группе 1, однако выше, чем в группе 5 (рис. 2, а).
При изучении уровней анти-ОА IgG1 показано, что в группах 1—4 наблюдался максимальный уровень, достоверно выше, чем в группе 5. В группах 6 и 7 уровень анти-ОА IgG1 был заметно ниже, чем в группах 1—4, но достоверно выше, чем в группе 5. Это связано, вероятно, с тем, что мышей в группах 1—4 иммунизировали 3 раза, а в группах 6 и 7 — 1 раз (рис. 2, б).
Что касается анти-ОА IgG2a антительного ответа, то видно, что в группах 1—4 его уровень довольно высокий и значительно выше контроля. В группах 6, 7 также наблюдается уровень анти-ОА IgG2a выше, чем в группе 5, однако несколько ниже, чем в группах 1—4 (рис. 2, в).
Общее количество клеток в образцах БАЛ (в 1 мм3) (так называемая клеточность) в группах 1—4, 6, 7 было значительно выше, чем в группе 5. В то же время уровень клеточ-ности в группах 1, 2 и 7 почти в 2 раза превышал таковой в группах 3, 4 и 6 (рис. 3).
При дифференцированном подсчёте относительного числа клеток (в процентах) БАЛ у мышей разных групп выявлено, что максимальное количество эозинофилов отмечалось в группе 1 (иммунизация ОА с Al(OH)3 и челленджирование 1% ОА), если сравнивать с группой 5, что свидетельствовало о выраженном эозинофильном аллергическом воспалении. При дифференцированном подсчёте клеток в БАЛ мышей из групп 2—4 (иммунизированных ОА в смеси с ПАФ/НАФ и челлен-джированных 0,1% ОА с ЛПС) было выявлено, наоборот, повышенное содержание нейтрофилов. Что касается лимфоцитов, то их число было существенно выше в группах 2—4, 6 и 7, чем в контрольной группе 5. Число макрофагов было снижено существенно во всех экспериментальных группах относительно показателей контрольной группы 5 (таблица).
Общая гистологическая картина воспаления в лёгких,
Клеточный состав БАЛ (M ± m) у мышей с нА, %
Показатель Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 Группа 6 Группа 7
Нейтрофилы 4,2 ± 0,49 50,3 ± 14,22*# 35,8 ± 3,09*# 47,8 ± 6,27*# 2,3 ± 1,65 0,8 ± 0,58# 9,6 ± 1,29*#
Макрофаги 9,8 ± 3,02* 20,5 ± 8,23* 22,4 ± 3,4*# 7,6 ± 1,86* 83,6 ± 6,95 34,2 ± 6,55*# 14 ± 2,35*
Лимфоциты 22,4 ± 3,17 29 ± 13,95 40,8 ± 4,45*# 44,4 ± 5,64*# 18 ± 4,95 63 ± 7,4*# 71,2 ± 3,97*#
Эозинофилы 63,6 ± 2,44*# 0,3 ± 0,25# 1 ± 0,32# 0,2 ± 0,2# 0,3 ± 0,25 2 ± 1,05# 5,2 ± 3,07#
Эпителиальные цилиндриче- 0,2 ± 0,2 3 ± 2,68 2 ± 0,63 2 ± 1,38 20 ± 7,88 2,0 ± 2,0 0,2 ± 0,2
ские клетки
Примечание. * — достоверные отличия от группы 5 (p < 0); # — достоверные отличия от группы 1 (p < 0,05).
ORIGINAL ARTICLE
Рис. 4. Общая картина воспаления в лёгких у мышей BALB/c с НА.
представленная в баллах, была значительно выражена во всех экспериментальных группах, однако наибольшие изменения наблюдались в группах 1 и 4. Слизистая метаплазия эпителия бронхов была наиболее выражена в группах 1, 3, 4. Гиперплазия эпителия бронхов была выражена в группах 1—4 (рис. 4).
Что касается перибронхиальной/периваскулярной инфильтрации провоспалительными клетками, то выраженная эозинофильная инфильтрация по сравнению с контрольной группой 5, наблюдалась только в группе 1. Значительная нейтрофильная перибронхиальная/периваскулярная инфильтрация отмечена в группах 2—4. В группах 6 и 7 периброн-хиальная/периваскулярная инфильтрация отсутствовала. Периваскулярная/перибронхиальная инфильтрация лимфоцитами была значительно выражена в группах 1—4 (рис. 5).
Обсуждение
БА — гетерогенное заболевание дыхательных путей, включающее несколько клинических фенотипов. Традиционно фенотип астмы классифицируется в соответствии с клеточным профилем воспаления: ЭА, НА, смешанная грануло-цитарная астма (СГА) и малогранулоцитарная астма [24].
Полученная нами модель НА (группы 2—4), базируется на концепции применения для сенсибилизации совместно с аллергеном полного адъюванта Фрейнда и для челленджирования — ЛПС совместно со специфическим аллергеном. Трехкратная парентеральная сенсибилизация аллергеном с ПАФ и НАФ и трехкратное аэрозольное челленджирование аллергеном совместно с ЛПС приводят к существенному сдвигу в клеточной композиции БАЛ и в клеточном составе перибронхиальных/периваскулярных инфильтратов в лёгких в пользу нейтрофилов по сравнению с моделью трехкратной сенсибилизации аллергеном с А1(ОН)3 и челленджированием только аллергеном, при котором основными клетками, мигрирующими в очаг аллергического воспаления, являются эозинофилы.
В патогенез бронхиальной астмы вовлечены многие типы клеток. Вклад тучных клеток, лимфоцитов и эозинофилов в развитие БА установлен. Согласно литературным данным, примерно 50% случаев БА связаны с эозинофильным воспалением, тогда как другие 50% случаев — с инфильтрацией в бронхи и ткань лёгких нейтрофильных лейкоцитов [25]. Нейтрофилы — по-лиморфонуклеарные клетки, играющие существенную роль в иммунной системе, действуя как 1-я линия за-
щиты организма от бактериальной и грибковой инфекции. Их роль в воспалительном процессе не ограничена только фагоцитозом, секрецией энзимов или других цитотоксических агентов. Нейтрофилы способны выделять медиаторы, осуществляющие глубокий эффект на воздухоносные пути больных БА, включая один из основных медиаторов аллергии — гистамин, который в местах аккумуляции нейтрофилов способен осуществлять гистамин-зависимое иммуномодулирующее влияние, поддерживая аллергическое воспаление [26]. Существует достаточное количество данных, свидетельствующих об участии нейтрофилов в аллергическом процессе в целом и в патогенезе БА в частности. БА с преимущественной инфильтрацией в лёгкие нейтрофилов резистентна к терапии кортикостероидными препаратами [27].
Совершенно очевидно, что для изучения патогенеза и разработки новых подходов в терапии НА необходимо создание экспериментальных моделей НА на животных, отличающихся по фенотипу от моделей ЭА. Имеются публикации, в которых описаны подходы к получению экспериментальной модели НА, отличной от модели ЭА. В частности, P. Bogaert и соавт. [28] получили выраженное ней-трофильное воспаление при сенсибилизации мышей оваль-бумином в смеси с адъювантом Фрейнда, однако, в отличие от нашей модели, авторы осуществляли челленджирование только ОА, тогда как в нашем случае — совместно с ЛПС (к тому же, полученная инфильтрация нейтрофилами БАЛ более выраженна, чем у данных авторов). Авторы статьи высказали также предположение (которое мы разделяем), что появление эозинофильного или нейтрофильного воспаления предопределяется уже на стадии сенсибилизации, когда используются классические Th2- или ТЫ-адьюванты (в нашем случае — Al(OH)3 и ПАФ соответственно).
В другом исследовании по моделированию эозинофиль-ной и нейтрофильной астмы M. Bergquist и соавт. [29] показали возможность индукции нейтрофильного воспаления в лёгких мышей, сенсибилизированных ОА с Al(OH)3, после челленджирования аллергеном (ОА) совместно с ЛПС, полученным из E. coli. В сравнительном плане в нашем случае нейтрофильное воспаление было более выраженным (груп-
Рис. 5. Перибронхиальное/периваскулярное воспаление у мышей BALB/c с НА.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
пы 2—4), вероятно, в связи с тем, что нами осуществлялась более длительная сенсибилизация ОА совместно с ПАФ, тогда как Bergquist и соавт. сенсибилизировали мышей ОА с Al(OH)3 всего дважды и с интервалом в 1 нед. Авторы также показали возможность дополнительной дифференцировки двух различных фенотипов воспаления при БА (эозинофиль-ного и нейтрофильного) на основании протеомного анализа бронхоальвеолярного лаважа.
Сходные с нашими результаты по моделированию НА с использованием для челленджирования ЛПС, полученного из Salmonella enterica, продемонстрировали S. Hadebe и соавт. [30]. Авторы сенсибилизировали мышей ОА с Al(OH)3 дважды с интервалом 7 дней и челленджировали либо только ОА, либо ОА с ЛПС или ß-глюканом (компонент клеточной стенки грибов). Авторы показали, что челленджирование сенсибилизированных мышей специфическим аллергеном совместно с ЛПС (или ß-глюканом) ведёт к выраженному нейтрофильному воспалению в лёгких с гистологически выраженной гиперплазией эпителия, сходной с той, которая получена в нашей работе, причём при челленджировании ОА одновременно с двумя компонентами ЛПС и ß-глюканом воспаление не ограничивалось только перибронхиальной и периваскулярной нейтрофильной инфильтрацией, а отягощалось воспалением альвеол. Вместе с тем так же, как и мы, авторы не наблюдали сколь-либо выраженного изменения характерной картины гиперреактивности бронхов в ответ на ингаляцию метахолина.
В исследованиях нам не удалось выявить характерные признаки НА в группах 6 и 7 по сравнению с группами 2, 3 и 4. Прежде всего это касается клеточной композиции БАЛ, когда, например, в группе 6 имеет место в основном лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация в просвет бронхов, а количество нейтрофилов и эозинофилов находится на сходном для обеих групп крайне низком уровне (1—2%). Клеточный состав БАЛ в группе 7 характеризовался примерно одинаковым невысоким содержанием нейтрофилов и эозинофилов (соответственно 5,2 ± 3,07 и 9,61 ± 1,29) что может свидетельствовать о том, что в данном случае мы, возможно, имеем дело с моделью смешанной формы — эозинофильно-нейтрофильной астмы. Перибронхиально-периваскулярная инфильтрация была нулевой в группах 6 и 7. Вероятно, это связано с особенностями иммунизации и челленджирования, когда при одинаковой иммунизации обеих групп (однократная п/к иммунизация ОА с ПАФ) челленджирование осуществляли в группе 6 — дважды только аллергеном, а в группе 7 — дважды аллергеном в смеси с ЛПС, полученным из E. coli. Скорее всего, в данном случае имеется недостаточная дозовая нагрузка по ОА при п/к сенсибилизации и по ЛПС при челленджировании для получения признаков НА. В этом отношении группы 2—4, получившие достаточное количество сенсибилизирующих инъекций и аэрозольных разрешающих введений (челленджирований), демонстрируют убедительные показатели (БАЛ и гистологическая картина), характеризующие полученную модель как модель НА.
Таким образом, ключевой момент в моделировании НА — челленджирование сенсибилизированных животных аллергеном в смеси с ЛПС. Вместе с тем в некоторых работах изучено влияние ЛПС на стадии сенсибилизации аллергеном. Показано, что низкие дозы ЛПС (0,1 мкг) при ингаляционном введении (интраназально) совместно с аллергеном (ОА) индуцируют №2-воспалительный ответ (без вовлечения MyD88 пути сигнальной трансдукции), тогда как высокие дозы ЛПС (100 мкг) — индуцируют ТЫ-ответ на аллерген [31]. Это подтверждает концепцию о том, что контаминация аэроаллергенов различными количествами ЛПС ведёт к развитию различных фенотипов воспаления воздухоносных путей [32]. В различных моделях на животных
показано, что экспозиция аллергена с бактериальными ЛПС может отрицательно регулировать №2-лёгочный ответ [33]. Показано, что высокие дозы ЛПС не способны индуцировать ТЬ2-клеточный ответ к аллергену, но индуцируют продукцию IL-12 и Thl-ответ. Напротив, низкие дозы ЛПС не достаточны для индукции Thl-клеточного ответа на аллерген, но достаточны для индукции №2-клеточного воспаления; т. е. различные уровни ЛПС (или контаминации аллергена ЛПС) при экспозиции с аллергеном вызывают различный тип Th-клеточного воспалительного ответа, что может объяснить появление различных фенотипов воспаления воздухоносных путей у человека.
В недавних исследованиях при биопсии бронхов был сделан вывод, что IL-17 осуществляет рекрутирование нейтро-филов в воздухоносные пути, полагая тем самым, что нейтро-фильный астматический ответ более сложен, чем считалось ранее [34]. IL-17 управляет ответом ТЫ7-лимфоцитов, которые обеспечивают защиту от инфекции на поверхности слизистых. В последующих работах было показано, что ТЫ7-линия T-клеток играет роль в контроле лёгочных бактериальных инфекций, в частности при инфекции, вызванной Klebsiella pneumoniae. Более того, ТЫ7-цитокины IL-17A, IL-17F, а также IL-22 ассоциированы с умеренными и тяжёлыми проявлениями астмы, при которых происходит увеличение массы гладкомышечной ткани, продукции слизи и непрямое рекрутирование нейтрофилов в воздухоносные пути путём индуцирования продукции хемокинов CXCL1 и IL-8 эпителиальными клетками [35]. Интересно отметить, что цитоки-новый профиль и присутствие микробных продуктов в месте инфекции могут определять продолжительность жизни ней-трофилов. Показано, что активация «паттерн» распознающих рецепторов (PRRs) на поверхности нейтрофилов, таких как TLR 1, 2, 4, 5, 6, 8 и 9, приводит к увеличению срока выживания нейтрофилов, при этом важное значение играет сигнальная трансдукция, связанная с нуклеиновым фактором (NF)-kB и митоген-активированной протеинкиназой (MAPK) [36]. Возможно, «паттерн» распознающая функция нейтро-филов может оказаться наиболее важной, напрямую связанной с определением представителей микробиоты лёгких и выживанием нейтрофилов в воздухоносных путях.
Несмотря на условное деление астмы на несколько фенотипов, основанное на клеточной характеристике воспаления, остается много вопросов относительно их стабильности во времени, особенно у детей. В недавних исследованиях показана возможность дифференцировать различные фенотипы астмы на основании экспрессии генов больного, которые связаны с разными фенотипами [37]. Поэтому появляются предложения о замене собирательного термина «астма», объединяющего широкий спектр внутренне связанных, но различных по сути состояний, на какой-то новый, отвечающий современным представлениям о данной патологии [38].
Заключение
Таким образом, разработанная нами модель нейтрофиль-ной бронхиальной астмы на лабораторных мышах линии BALB/c с использованием для сенсибилизации адъюванта Фрейнда и для челленджирования различных ЛПС имеет все необходимые характеристики данного фенотипа астмы у человека, а также более выраженные и стабильные показатели модели, чем в примерах других авторов. Модель может быть полезна как для изучения патогенеза этого подтипа астмы человека, так и для доклинической оценки эффективности и безопасности новых терапевтических противоастматических средств.
Финансирование. Работа выполнена в рамках гранта РФФИ № 16-54-53089.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
1. Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., Петрова М.А. Многоликая бронхиальная астма. Диагностика, лечение и профилактика. СПб.: Нордмедиздат; 2011.
3. Хаитов М.Р., Акимов В.С. Генетическая предрасположенность к развитию бронхиальной астмы и атопии, подходы к идентификации новых генов, ассоциированных с развитием бронхиальной астмы и атопии. Российский аллергологический журнал. 2004; 3: 67—74.
4. Крючков Н.А., Бабахин А.А., Башкатова Ю.Н., Козмин Л.Д., Барсигян Г.Г., Хаитов М.Р. Краткосрочная безадьювантная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у лабораторных мышей с использованием пыльцы тимофеевки. Российский аллергологический журнал. 2008; 4: 37—45.
22. Бабахин А.А., Ласкин А.А., Камышников О.Ю., Шершакова Н.Н., Шиловский И.П., Бержец В.М., Гущин И.С., Хаитов М.Р. Экспериментальная мышиная модель бронхиальной астмы, индуцированная аллергенным экстрактом из клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus. Российский аллергологический журнал 2015; 6: 25—33.
references
1. Fedoseev G.B., Trofimov V.I., Petrova M.A. The many faces of bronchial asthma. Diagnosis, treatment and prevention. [Mnogolikaya bronkhial'naya astma. Diagnostika, lechenie i profilaktika]. Saint Petersburg: Nonmedical; 2011. (in Russian)
2. Wenzel S.E. Asthma: defining of the persistent adult phenotypes. Lancet. 2006; 368: 804—13.
3. Khaitov M.R.,Akimov V.S. Genetic predisposition to the development of asthma and atopy, approaches to identifying new genes associated with the development of asthma and atopy. Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal. 2004; 3: 67—74. (in Russian)
4. Kruchkov N.A. Babakhin A.A., Bashkatova Yu.N., Kozmin L.D., Barsigyan G.G., Khaitov M.R. Without adjuvant model of short-term IgE-dependent bronchial asthma in mice with the use of pollen Timothy. Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal. 2008; 4: 37—45. (in Russian)
5. Dauwes J., Gibson P., Pekkanen J., Pearce N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 2002; 57: 643—8.
6. Tsoumaki Don M., Papadopoulou E., Tzanakis N., Sifakis N.M. Airway inflammation and cellular stress in noneosinophilic atopic asthma. Chest. 2006; 129(5): 1194—202.
7. Zhang Y., Nong G. Research progress of non eosinophilic asthma. J. Appl. Clin. Pediatrics. 2007; 10: 790—2.
8. Lee B.J., Moon H.G., Shin T.S. et al. Protective effects of basic fibroblast growth factor in the development of emphysema induced by interferon-Y. Exp. Molec. Med. 2011; 43(4): 169—78.
9. Green R.H., Brightling C.E., Woltmann G. et al. Analysis of induced sputum in adults with asthma: identification of a subgroup with isolated sputum neutrophilia and poor response to inhaled corticosteroids. Thorax. 2002; 57: 875—79.
10. Berry M., Morgan A., Shaw D.E. et al. Pathological features and inhaled corticosteroid response of eosinophilic and noneosinophilic asthma. Thorax. 2007; 62: 1043—49.
11. Jae-Woo Jung, Sae-Hoon Kim, Jae Woo Kwon et al. Clinical characteristics and long-term outcomes related to sputum eosinophilia in Korean asthmatics. Asia Pac. Allergy. 2011; 1(1): 16—24.
12. Cox G. Glucocorticoid treatment inhibits apoptosis in human neutrophils. Separation of survival and activation outcomes. J. Immunol. 1995; 154: 4719—25.
13. Nguyen L.T., Lin S., Oates T., Chung K.F. Increase in airway neutrophilia after oral but not inhaled corticosteroid therapy in mild asthma. Respir. Med. 2005; 99: 200—7.
14. Contoli M., Kraft M., Hamid Q. et al. Do small airway abnormalities characterize asthma phenotypes? In search of proof. Clin. Exp. Allergy. 2012; 42(8): 1150—60.
15. Berthon B., Macdonald-Wicks L.K., Gibson P.G. et al. Investigation of the association between dietary intake, disease severity and airway inflammation in asthma. Respirology. 2013; 18(3): 447—54.
16. Simpson J.L., Scott R.J., Boyle M.J. et al. Differential Proteolytic Enzyme Activity in Eosinophilic and Neutrophilic Asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2005; 172: 559—65.
ORIGINAL ARTICLE
17. Cundall M., Sun Y., Miranda C. et al. Neutrophil-derived matrix metalloproteinase-9 is increased in severe asthma and poorly inhibited by glucocorticoids. J. Allergy Clin. Immunol. 2003; 112: 1064—71.
18. Cosmi L., Liotta F., Maggi E., Romagnani S., Annunziato F. Th17 cells: new players in asthma pathogenesis. Allergy. 2011; 66(8): 989—98.
19. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharide extraction with phenol: water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 1965; 5: 83—91.
20. Kenne L., Lindberg B., Peterson K. Structural studies ofthe O-specific side-chains of the Sgigella sonnei phase I lipopolysaccharide. Carb. Res. 1980; 78: 119—26.
21. Dixon D.R., Darveau R.P. Lipopolysaccharide heterogeneity: innate host responses to bacterial modification of lipid A structure. J. Dent. Res. 2005; 84(7): 584—95.
22. Babakhin A.A., Laskin A.A., Kamyshnikov O.Yu., Shershakova N.N., Shilovskiy I.P., Bergets V.M., Gushchin I.S., Khaitov M.R. Experimental murine model of asthma induced by allergen extract of house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus. Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal. 2015; 6: 25—33. (in Russian)
23. Ennis D.P., Cassidy J.P., Mahon B.P. Acellular pertussis vaccine protects against exacerbation of allergic asthma due to Bordetella pertussis in a murine model. Clin. Diagnostic. Lab. Immun. 2005; 3: 409—17.
24. Gibson P.G. Inflammatory phenotypes in adult asthma: clinical applications. Clin. Resp. J. 2009; 3(4): 198—206.
25. Dauwes J., Gibson P., Pekkanen J., Pearce N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 2002; 57: 643—8.
26. Alcaniz L., Vega A., Chacon P., Bekay R.El., Ventura I., Aroca R. et al. Histamine production by human neutrophils. FASEB J. 2013; 27: 2902—10.
27. Monteseirin L. Neutrophils and asthma. J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 2009; 19(5): 340—54.
28. Bogaert P., Naessens T., De Koker S., Hennuy B., Hocha J., Smet M. et al. Inflammatory signatures for eosinophilic vs. neutrophilic allergic pulmonary inflammation reveal critical regulatory chechpoints. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2011; 300: L679—L690.
29. Bergquist M., Jonasson S., Hjoberg J., Hedenstierna G., Hanrieder J. Comprehensive multiplexed protein quantitation delineates eosinophilic and neutrophilic experimental asthma. BMC Pulmonary Med. 2014; 14: 110—21.
30. Hadebe S., Kirstein F., Chen K., Drummond R.A. et al., Microbial ligand costimulation drives neutrophilic steroid-refractory asthma. PLoS ONE. 2015; 10(8): e0134219. Doi:10.1371/journal. pone.0134219.
31. Eisnbarth S.C., Piggott D.A., Huleatt J.W., Visintin I., Herrick C.H., Bottmly K. Lipopolysaccharide-enhanced, toll-like receptor 4-dependent T helper cell type 2 response to inhaled antigen. J. Exp. Med. 2002; 196(12): 1645—51.
32. Wan G.H., Li C.S., Lin R.N. Airborne endotoxin exposure and the development of airway antigen-specific allergic responses. Clin. Exp. Allerg. 2000; 30: 426—32.
33. Tulic T.K., Wail J.L., Holt P.G., Sly P.D. Modification of the inflammatory response to allergen challenge after exposure to bacterial lipopolysaccharide. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 2000; 22: 604—12.
34. Doe C., Bafadhel M., Siddiqui S., Desai D., Mistry V., Rugman P. et al. Expression of the T helper 17-associated cytokines IL-17A and IL-17F in asthma and COPD. Chest. 2010; 138: 1140—47.
35. Newcomb D.C., Peebles R.S. Th17-mediated inflammation in asthma. Curr. Opin. Immunol. 2013; 25: 755—60.
36. Thomas C.J., Schroder K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends Immunol. 2013; 34: 317—28.
37. Baines, K.J., Simpson J.L., Wood L.G., Scott R.J., Gibson P.G. Transcriptional phenotypes of asthma defined by gene expression profiling of induced sputum samples. J. Allergy Clin. Immunol. 2011; 127: 153—160.
38. Ray A., Ray A., Oriss T.B., Wenzel S.E. Emerging molecular phenotypes of asthma. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2015; 308: L130—L140.
Поступила 04.03.17 Принята в печать 14.04.17
