CC BY
102
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2012
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.248-056.43-085.373-092.9
А. А. Бабахин1, И. П. Шиловский1, И. В. Андреев1, Л. Д. Козмин1, И. П. Хобаковский2,
А. И. Мартынов1, М. Р. Хаитов1
экспериментальная аллергенспецифическая иммунотерапия аллерговакциной «тимпол» на модели IGE-зАвисимой бронхиальной астмы у мышей
1ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России (115478, г Москва, Каширское ш., 24, к. 2);
2ООО “Ковариант”, г Москва
На модели IgE-зависимой мышиной бронхиальной астмы изучали эффективность экспериментальной инъекционной аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) различными дозами аллерготропина “Тимпол” - конъюгата аллергои-да пыльцы тимофеевки (G6) и иммуномодулятора полиоксидония. Показано, что у животных, получавших низкие суммарные дозы Тимпола (4, 40 мкг/кг), уровни анти^6-1дЕ-антител (Ат) в ходе АСИТ и после интраназальных аппликаций G6 были существенно ниже, чем у получавших высокие (400, 4000 мкг/кг). При обработке мышей Тимполом в низких дозах уровни анти^6-1дЕ-Ат в ходе АСИТ возрастали и были сопоставимы с таковыми при обработке высокими дозами. Во всех группах при АСИТ Тимполом в отличие от группы, получавшей физиологический раствор в гистологической картине легких наблюдалось снижение признаков аллергического воспаления (периваскулярного и перибронхиально-го), а также снижение относительного числа эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже и относительного количества нейтрофилов и моноцитов в периферической крови. При АСИТ Тимполом отмечено также снижение гиперреактивности бронхов в ответ на введение метахолина. По совокупности данных наиболее эффективными суммарными дозами Тимпола являются 4 и 40 мкг/кг. АСИТ Тимполом может быть эффективным подходом для снижения признаков аллергического воспаления при атопической бронхиальной астме человека легкой и средней степени тяжести.
Ключевые слова: аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ), экспериментальная бронхиальная астма, Тимпол
A.A. Babakhin, I.P. Shilovsky, I.V. Andreev, L.D. Kozmin, I.P. Khodakovsky, A.I. Martynov, M.R. Khaitov EXPERIMENTAL ALLERGEN-SPECIFIC IMMUNOTHERAPY WITH THE USE OF A TIMPOL ALLERGOVAC-CINE AS EXEMPLIFIED BY THE MURINE MODEL OF IGE-DEPENDENT BRONCHIAL ASTHMA
The murine model of IgE-dependent bronchial asthma was employed to study the efficacy of experimental injection allergen-specific immunotherapy (ASIT) using different doses of the allergotropin timpol, a conjugated allergoid of timothy grass pollen (G6), and the immunomodulator polyoxidonium. It was shown that the animals administered low total doses of timpol (4 and 40 mcg/kg) had significantly lower levels of anti-G6 IgE antibodies (Ab) during the period of immunotherapy and after the intranasal applications of G6 than the mice given high doses of the allergotropin (400 and 4,000 mcg/ kg). The low-dose treatment of the mice with timpol eventually resulted in the increased levels of anti-G6 IgE antibodies comparable with those in the animals treated with high doses of the same preparation. The histological picture of the lungs in all the animals treated with timpol, unlike those receving the physiological solution, was characterized by the improvement of the signs of allergic inflammation (both preivascular and peribronchial) and the reduction of the relative number of eosinophils in the broncho-alveolar lavageas well as the relative number of neutrophils and monocytes in the peripheral blood. Moreover, the treatment with timpol diminished bronchial hyperactivity in response to the administration of metacholine. Teken together, the results of the study indicate that timpol produces the best therapeutic effect at the total dose of 4 and 40 mcg/ml. It is concluded that ASIT with the use of timpol provides an efficacious tool for the elimination of the signs of allergic inflammation in the patients suffering from mild and moderately severe atopic bronchial asthma.
Key words: allergen-specific immunotherapy (ASIT), experimental bronchial asthma, timpol
Аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ), примененная впервые в 1911 г L. Noon [20] и J. Freeman [17], остается единственным патогенетическим видом лечения атопических аллергических болезней, влияющим на естественное течение аллергических заболеваний. Классическая инъекционная АСИТ заключается в подкожном введении возрастающих доз экстракта того аллергена, к которому имеется повышенная чувствительность, до достижения “поддерживающей дозы”, которую вводят в дальнейшем в течение нескольких лет. Эффективность АСИТ была доказана в ряде исследований с использованием двойного слепого плацебо-контролируемого
Бабахин Александр Александрович - канд. мед. наук, вед. науч. сотр., тел. 8(499) 617-08-13, alexbabahin@list.ru
(ДСПК) метода при лечении поллинозов, атопической бронхиальной астмы (БА), инсектной аллергии, аллергического риноконъюнктивита с сенсибилизацией к бытовым аллергенам (клещи домашней пыли, эпидермис кошки, собаки и др.). Эффект АСИТ продолжает сохраняться и после завершения курса инъекций, прекращая дальнейшее прогрессирование заболевания (например, аллергического ринита, и превращение его в БА), а также предотвращая развитие сенсибилизации к другим аллергенам. Гипосенсибилизация при АСИТ, таким образом, имеет много черт иммуномодулирующей терапии, которая сохраняет эффект после окончания лечения [12].
Несмотря на широкое использование этого вида лечения, АСИТ продолжают усовершенствовать, так как она имеет ряд недостатков, основным из которых является опасность
- 134 -
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
возникновения местных и системных реакций на проводимое лечение за счет сохранения В-клеточных эпитопов в препаратах нативного аллергена. В-клеточные эпитопы аллергена обусловливают IgE-опосредованное высвобождение медиаторов (гистамина, лейкотриенов и др.) из клеток-мишеней аллергии (преимущественно тучных клеток, базофилов крови) в основном на начальных этапах лечения, что может приводить к серьезным осложнениям лечения (в ряде случаев с угрозой для жизни) примерно у 3,7% пациентов [24].
В связи с этим с середины прошлого столетия стали развиваться новые подходы к усовершенствованию АСИТ (включая сублингвальную АСИТ), целью которых являлось достижение большей безопасности лечения при сохранении или даже повышении клинической эффективности [15]. Эти подходы включали в себя изменение схем и способов введения препаратов аллергенов, очистку и стандартизацию вводимых препаратов, выделение основных компонентов аллергенных экстрактов, ответственных за аллергенную активность, создание рекомбинантных форм аллергенов, использование различных адъювантов (иммуномодуляторов), а также различные виды модификации молекулы аллергена, включая химические, в частности полимеризацию, денатурацию, замещение, конъюгацию с различными носителями [10, 18].
В целом химическая модификация аллергенных белков направлена на уменьшение IgE-связывающей активности препаратов аллергенов, используемых для АСИТ. Такие химически модифицированные аллергены, названные аллергоидами, были получены посредством обработки аллергена, например, формальдегидом или глутаральдегидом, путем сшивания аминогрупп лизина и других аминокислот, что приводило к “блокаде” B-клеточных эпитопов аллергена, ответственных за IgE-связывающую активность. АСИТ аллергоидами начали применять с начала 1980-х годов и продолжают использовать до сих пор. Однако нет четких доказательств, позволяющих утверждать, что данный вид иммунотерапии, являясь более безопасным, чем традиционная АСИТ, также остается и эффективным, поскольку химическая обработка аллергена снижает не только его аллергенность, но и иммуногенность.
В течение последних двух десятилетий был предложен и обоснован новый принцип создания искусственных иммуногенов посредством комплексирования (конъюгации) антигена (или гаптена) с синтетическими полиэлектролитами, позволяющий получить мощный иммунный ответ на антигенную составляющую антиген-полиэлектролитного комплекса вне зависимости от генотипа иммунизируемой особи [7]. Аллергены, комплексированные с полиэлектролитами, в экспериментальных условиях обладали существенно сниженной аллергенностью и более выраженной иммуногенностью [9]. В дальнейшем этот принцип нашел свое воплощение в создании ряда аллерговакцин нового поколения. Одна из них Тимпол - конъюгат аллергоида пыльцы тимофеевки (G6) и полиэлектролитного иммуномодулятора - полиоксидония (ПО) - успешно прошла клинические испытания с использованием ДСПК-метода исследования, показав хорошую эффективность и безопасность при лечении аллергического риноконъюнкти-вита [3]. Однако и в этом случае при применении конъюгированных аллерговакцин могут наблюдаться в определенном проценте местные, немедленные и отсроченные реакции.
В связи с вышеизложенным продолжается процесс поиска подходов для усовершенствования АСИТ в плане создания безопасных и эффективных аллерговакцин, основанных на экспериментальных данных по изучению новых схем и дозировок введения с использованием биологических моделей аллергии, включая IgE-зависимую БА.
БА, являясь наиболее распространенным неинфекционным хроническим заболеванием органов дыхания, представляет глобальную проблему здравоохранения. По данным ВОЗ и программы GINA (Global Initiative in Asthma - Глобальная инициатива по бронхиальной астме), в мире живет почти 300 млн человек с БА, из которых примерно 5-6 млн -
в субрегионе ВОЗ Еиго-С(к нему отнесена и Россия) [1, 11]. В России, по данным нескольких “поперечных” исследований и экспертной оценке [2, 4], проживает 5,6-7,3% взрослых и 6-11% детей, болеющих БА, что значительно выше официальных цифр. Данные же по смертности от этого заболевания в нашей стране сильно разнятся. Вероятно, они демонстрируют уровень, аналогичный для США.
Таким образом, БА оказывает выраженные отрицательные эффекты на общественное здоровье и экономику всего мира [22]. В настоящее время ведутся многочисленные клинические и фундаментальные исследования, конечной целью которых является уменьшение бремени этого заболевания. Один из базовых подходов к изучению нозологий и патологических состояний заключается в детальном анализе патологических процессов путем выяснения их этиологии и моделировании заболеваний.
Известно, что в 60-70% случаев БА возникает на фоне атопической предрасположенности и сопровождается гиперпродукцией иммуноглобулинов класса E (IgE). В развитии БА участвуют многие клетки и биологически активные молекулы. Ранее ключевым элементом патологического каскада считались тучные клетки и базофилы, выделяющие медиаторы воспаления и цитокины в ответ на внешние стимулы. В настоящее время не меньшее внимание уделяется и другим участникам процесса: лимфоцитам, дендритным клеткам и особенно эозинофилам [25]. Разработка новых подходов к диагностике, профилактике и особенно лечению БА остается актуальной задачей, причем для этих целей все более широкое применение находят биологические модели, позволяющие воспроизводить характерные признаки патологии у животных.
Целью данного исследования была оценка эффективности инъекционной АСИТ аллерговакциной Тимпол на модели IgE-зависимой экспериментальной БА (ЭБА) у мышей, индуцированной аллергеном пыльцы тимофеевки (G6), для выяснения возможности использования этого препарата при АСИТ атопической БА человека.
Материалы и методы. В работе использовали мышей линии BALB/c в возрасте 8-10 нед массой 18-20 г, полученных из питомника ГУНЦБМТ РАМН. Вся работе с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздравсоцразвития РФ от 19.06.03 № 267 “Правила лабораторной практики в Российской Федерации”. В работе использовался лиофилизированный экстракт пыльцы тимофеевки полевой (G6), а также препарат Тимпол - конъюгат аллергоида G6 и иммуномодулятора ПО.
Моделирование ЭБА осуществлялось у всех групп, кроме интактной, как описано ранее [5]. Животных иммунизировали экстрактом G6 (33% по белку) путем семикратных (через день) внутрибрюшинных (в/б) введений G6 в дозе (по белку) 1 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора. Через неделю после окончания этапа сенсибилизации 2, 3, 4, 5 и 6-й группам начинали проводить экспериментальную АСИТ согласно схеме (рис. 1). Животные 1-й группы не подвергались АСИТ (“модельная” группа). Животным 2-й группы проводили АСИТ нативным аллергеном G6, 3, 4, 5 и 6-й группам - Тимполом в разных суммарных дозах. Для этого животным через день подкожно (п/к) вводили G6 или Тимпол в объеме 0,2 мл физиологического раствора, постепенно повышая дозу. Каждая группа получила 13 п/к инъекций (см. рис. 1). Каждое экспериментальное животное 2-й группы в ходе АСИТ получило суммарную дозу G6 (по белку) 19,7 мг/кг; а в 3, 4, 5 и 6-й группах - суммарную дозу Тимпола (по белку) соответственно по 4, 40, 400 и 4000 мкг/кг. Через 7 дней после последнего п/к введения, согласно схеме АСИТ, животным всех групп, кроме интактной (7-я группа), осуществляли интраназальные аппликации (ИА) раствором G6 путем ежедневного в течение 8 дней интраназального введения 50 мкл G6 в концентрации 10 мг/мл (по белку).
Перед началом, в середине и после АСИТ, а также через 2 дня после ИА проводили заборы крови из ретроорбитально-
- 135 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2012
Модель БА
1 13 17
ttttttt
57 58 59
G6 1 МГ/КГ в/б
ttttttt
G6 10 мг/мл и/н
АСИТ G6 (19,7 мг/кг)
13 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 47 50
4444444
G6 1 мг/кг в/б
4 4 4 4 444444444
G6 50 мкг/кг п/к
06 0,5мкг/кг G6 2,5 мг/кг G6 5 мг/кг
п/к п/к п/к
44444444
G6 10 мг/мл и/н
4 I
АСИТ 1 13 17 19 21 23 25 27 29 31 зз34 35 37
ttttttt 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Тимпол G6 1 мг/кг в/б со со со СМ см см
(4 мкг/кг) о * со см N о * со о * со со" о * со см N о * со о « со со" о * см к о * со о * h- 1Л со" О * см N
1 13 17 19 21 23 25 27 29 31 33 34 35 37
8,9*10-1
G6 10 мг/мл и/н
АСИТ ttttttt t t t t t t t t t t ,t t t, tttttttt
Тимпол G6 1 мг/кг со см см CM 1- i- со h- CM 8,9 G6 10 мг/мл и/н
(40 мкг/кг) в/б о о о о о О О со" r-
со см со со со" со см со со со" см h-“
h-" ь*"
АСИТ Тимпол 1 13 17 19 21 23 25 27 29 31 зз 34 35 37 39 41 43 47 50 57
ttttttt G6 1 мг/кг t t ,t t t, ,t t t, ,t t t t, t tttttttt G6 10 мг/мл и/н
(400 мкг/кг) в/б 0,5 2,5 5 25 50 100
АСИТ Тимпол (4000 мкг/кг)
13 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 47 50
ttttttt
G6 1 мг/кг в/б
ttttttttttttt
I__I
СМ 00 (О со
■Ч Т-- со" «Ч
г- о
LO СМ
СО I4-
57 58 59
tttttttt—
G6 10 мг/мл и/н
890
Рис. 1. Схема АСИТ G6 и Т имполом на модели краткосрочной IgE-зависимой БА у мышей BALB/c: 1-я группа - "модель" БА; 2-я группа - АСИТ G6; 3-я группа - АСИТ Тимполом (суммарная доза 4 мкг/кг); группа 4-я - АСИТ Тимполом (суммарная доза 40 мкг/кг); группа 5-я - АСИТ Тимполом (суммарная доза 400).
го синуса. Уровни анти-вб-]^, анти-G6-IgG-антител (Ат) в пуловых сыворотках крови определяли с помощью стандартного метода ИФА.
Через сутки после последней ИА G6 определяли гиперреактивность бронхов (ГРБ) в ответ на в/б введение метахолина (Мх) в дозах 250 и 500 мкг/кг. Через 48 ч производили забор бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) из легких для приготовления микропрепаратов и дальнейшего гистологического исследования, а также делали мазки периферической крови.
Оценку клеточного состава БАЛ и периферической крови проводили с помощью иммерсионной световой микроскопии (увеличение в 1000 раз) путем дифференциального подсчета 200 клеток на каждый мазок, окрашенный по Романовскому, и рассчитывая процентное содержание моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов, эозинофилов и эпителиоцитов бронхоальвеолярного тракта, согласно известным морфологическим критериям.
Для гистологического исследования образцы легких фиксировались в 10% растворе формалина в течение 1 нед. После этого проводилась обработка гистологического материала по стандартной методике с использованием гистопроцессора Leica TR 1020 (Германия).
После фиксации и пропитывания парафином ткань заливали в парафиновую смесь, а затем изготавливали блоки, с которых получали срезы толщиной 5 мкм. Срезы депарафи-нировали, а затем окрашивали гематоксилином и эозином в
соответствии со стандартным протоколом. Морфологическое исследование микропрепаратов легкого от каждой мыши проводил исследователь-патоморфолог, который не получал информации о том, какие группы мышей подвергались терапевтическому воздействию (“слепой” метод).
При оценке фрагментов ткани легкого определялись следующие морфологические параметры: слизистая метаплазия цилиндрического эпителия бронхиол, гиперплазия цилиндрического эпителия бронхиол, гипертрофия гладких мышц стенки бронхиол, инфильтрация стенки бронхиол лимфоцитами, эозинофилами и полиморфно-ядерными лейкоцитами. Гистологическое исследование микропрепаратов легких мышей осуществляли с помощью светового микроскопа “Zeiss Axiostar”. Помимо качественной, проводили полуколичественную оценку воспалительных изменений и ремоделирования бронхов, при этом выраженность того или иного признака оценивалась в баллах по порядковой шкале [16].
В процессе работы нами было разработано принципиально новое устройство (по сравнению с тем, которое использовали ранее) [6] для регистрации ГРБ, представляющее собой специализированную измерительную систему, служащую для регистрации временной зависимости внешнего дыхания (частота дыхательных актов и амплитуда) мелких лабораторных животных, таких как мыши. Принцип работы устройства состоит в измерении колебаний давления воздуха в камере (объемом примерно 250 мл) с животным (в данном
- 136 -
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
Измерительная Блок
камера визуализации
Рис. 2. Схема устройства для измерения бронхиальной гиперреактивности у мелких лабораторных животных.
Условные сокращения: АЦП - аналого-цифровой преобразователь; МК — микроконтролер; USB 2.0 — универсальная последовательная шина; ПК — персональный компьютер; БПФ — быстрое преобразование Фурье.
а
б
АСИТ АСИТ АСИТ
1-я группа — Модель
2-я группа G6
3-я группа Тимпол 4 мкг/кг
4-я группа Тимпол 40 мкг/кг
5-я группа -ж- Тимпол 400 мкг/кг
6-я группа Тимпол 4000 мкг/кг
7-я группа — Контроль
Рис. 3. Уровни анти-G6-IgE- и IgG-антител в пуловых сыворотках мышей BALB/c с ЭБА, подвргнутых АСИТ Тимполом.
Уровни анти^б IgE и IgG-антител и их соотношение IgE/IgG (по данным ППК) при ASI Тимполом различными суммарными дозами.
случае мышью). Для измерения колебаний давления используется датчик Motorola MPX5010, способный измерять абсолютное давление в пределах от 0 до 10 кПа, что соответствует величине порядка 0,1 атм. Сигнал с датчика поступает на прецизионный усилитель AD8574, параметры которого обеспечивают оптимальное согласование параметров сигнала с входом аналого-цифрового преобразователя, используемого для оцифровки аналогового сигнала, поступающего с датчика. Далее сигнал в цифровой форме поступает на микроконтролер ATmega8, программное обеспечение которого выполняет предварительную фильтрацию сигнала. Далее обработанные цифровые данные поступают на блок сопряжения с персональным компьютером (ПК), передающий их через интерфейс USB2.0 для дальнейшей обработки.
Прием поступающих на ПК данных осуществляется специализированным программным обеспечением, в функции которого входят синхронизация с аппаратной частью устройства, запись в оперативную память принимаемых данных с последующим сохранением их на жесткий диск и математическая обработка. Математическая обработка включает в себя разбиение данных на интервалы по времени, быстрое преобразование Фурье (БПФ), вычисление усредненного за все время эксперимента спектра, поиск характерных спектральных пиков с получением значений частоты и амплитуды. Также программное обеспечение предоставляет возможность графического отображения информации: начальных данных в виде временных зависимостей и спектров (частотных зависимостей) ГРБ подопытных животных. Общая блок-схема устройства приведена на рис. 2.
При регистрации параметров ГРБ в опытах по изучению АСИТ Тимполом животным различных групп предварительно вводили внутрибрюшинно Мх в двух дозах: 250 и 500 мкг/кг. Затем мышей поочерёдно помещали в специальную колбу - рабочую емкость пневмотахографической установки, герметично закрывали крышкой и в течение 4 мин регистрировали частоту (в Гц) и амплитуду (в мВ) дыхательных актов.
Для статистической обработки результатов применяли программу Statistica 8.0. Статистическую значимость различий устанавливали при помощи непараметрических критериев Вилкоксона, Манна-Уитни. Для оценки значимости различий экспериментальных групп по значениям полуколичественных шкал патоморфологических изменений легких дополнительно применялся критерий х2 Достоверными считались различия при p < 0,05.
Результаты и обсуждение. В ходе АСИТ Тимполом и экстрактом G6 во всех группах отмечалось постепенное нарастание анти^6-^Е-антителообразования по сравнению с таковым в 1-й группе (“модельная” группа), что, в принципе, характерно для АСИТ у человека. Наиболее существенное повышение уровня анти^6-^Е наблюдалось в середине АСИТ в 3-й и 6-й группах, после чего происходило его снижение (рис. 3, а). После АСИТ перед ИА во всех группах, кроме 4-й, продолжало наблюдаться увеличение концентрации анти^б-IgE-Ат по сравнению с таковым в 1-й группе: умеренное во 2-й и 5-й группах, высокое в 3-й и 6-й группах. После ИА уровни анти^6-^Е-Ат достоверно выше сохранялись только в 3-й и 6-й группах, причем в 4-й группе уровень анти-G6-IgE практически не отличался от такового в 1-й группе (см. рис. 3, а).
Относительно aнти-G6-IgG-Ат картина несколько иная. Только после АСИТ наблюдается нарастание титров анти^6-IgG-Ат, причем наиболее существенное во 2, 3 и 6-й группах по сравнению с 1-й. После ИА подъем уровня анти-G6-IgG-Ат наблюдался во всех группах, однако во 2, 3, 4 и 6-й группах уровни анти-G6-IgG-Ат были существенно выше такового в 1-й группе (рис. 3, б). То, что во 2-й и 4-й группах после ИА на фоне почти неотличимого от уровней анти^6-^Е в
1-й группе наблюдалось существенное нарастение уровней анти-G6-IgG-Ат, свидетельствует о возможном перепрофилировании после АСИТ G6 и Тимполом иммунного ответа к аллергену с ^2-зависимого на ТЫ-зависимый.
Датчик
давления
БПФ
- 137 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2012
30000 -|
о
га z 20000 -
-г s
(О
а
с
5
З-
6
10000
оJ
СЗ
О)
ш
О)
0,3 п
0,2
0,1 -
1- я группа ■ Модель
2- я группа ■ G6
3- я группа Ш Тимпол 4 мкг/кг
4- я группа
5- я группа
6- я группа
] Тимпол 40 мкг/кг ] Тимпол 400 мкг/кг ] Тимпол 4000 мкг/кг
Рис. 4. Площади под кривой (ППК) по четырем точкам заборов крови, отображающих суммарные уровни анти-G6-IgE (в нг/мл) в пуловых сыворотках (а) ; ППК по четырем точкам заборов крови, отображающих уровни анти-G6-IgG (реципрокные титры) в пуловых сыворотках (б); индекс IgE/IgG (соотношение ППК анти-06-IgE к ППК анти^6-ДО) (в).
Это предположение подтверждается анализом для каждой группы площади под кривой (ППК), образованной суммой значений (анти^6-]^ или IgG) точек: перед АСИТ, середина АСИТ, после АСИТ, после ИА и индексами соотношения IgE/IgG (рис. 4). Наиболее низкая ППК по ат'и-Об-IgE отмечалась в 4-й группе (сравним с таковой в 1-й и 2-й группах) (см. рис. 4, а). В то же время ППК aнти-G6-IgG была повышена в 2, 3, 4 и 6-й группах, что свидетельствовало в целом об индукции анти-G6-IgG-антителообразования в ходе АСИТ G6 и Тимполом (см. рис. 4, б). Индекс IgE/IgG наиболее низким оказался в 4-й группе (АСИТ Тимполом в суммарной дозе 40 мкг/кг), что может свидетельствовать о перепрофилировании иммунного ответа в ходе АСИТ в пользу Thl-ответа, что является одним из возможных механизмов успешной АСИТ (см. рис. 4, в).
При регистрации параметров ГРБ (частота и амплитуда дыхательных актов) отмечено, что происходит восстановление частоты дыхательных актов (ЧДА) у животных всех групп, получавших АСИТ. ЧДА в 2, 3, 4-й группах достоверно отличалась в сторону улучшения от таковой в 1-й группе в случае обеих доз Мх (рис. 5, а). Наилучшие результаты в восстановлении ЧДА отмечены в 4-й группе (АСИТ Тимполом в суммарной дозе 40 мкг/кг), максимально приближенной к 7-й группе (контроль, интактные животные).
Также были зафиксированы изменения амплитуды дыхательных актов (АДА) у животных, подвергшихся АСИТ, по сравнению с 1-й группой (не получавшей АСИТ). Оказалось, что у животных в 3, 4 и 5-й группах при введении им Мх в дозе 500 мкг/кг происходит полное восстановление АДА, сходное с таковой в 7-й группе (интактные животные). Животные в 6-й группе, получившие наибольшую суммарную дозу Тимпола в ходе АСИТ, демонстрировали значительное
сходство по АДА с животными модельной группы, особенно при введении 250 мкг/кг Мх (рис. 5, б).
Полученные данные по ГРБ свидетельствуют о том, что в целом АСИТ Тимполом и G6 ведет к повышению порога чувствительности к неспецифическому действию Мх, сниженному у животных “модельной”, 1 -й группы. Наибольший эффект наблюдается в группах, получавших низкие суммарные дозы Тим-пола (3-я и 4-я группы). Учитывая динамику анти-G6-IgE/IgG-антительного ответа в совокупности с данными по бронхиальной гиперреактивности, можно предположить, что использование Тимпола в низких дозах для АСИТ (суммарно 4 и 40 мкг/кг) может оказывать значительный гипосенсибилизирующий, эффект у больных IgE-зависимой бронхиальной астмой с сенсибилизацией к пыльце тимофеевки.
Анализ лейкоцитарного состава периферической крови после ИА у мышей, получавших АСИТ, проводившийся путем подсчета лейкоцитов в мазках крови, показал статистически значимые различия в содержании нейтрофилов в некоторых группах. Так, количество нейтрофилов достоверно снижалось у животных, получавших АСИТ Тимполом в суммарных дозах 4 и 40 мкг/кг (3-я и 4-я группы). У животных других групп, получавших АСИТ по другим схемам, также отмечалось незначительное снижение числа нейтрофилов в сравнении с “модельной”, 1-й группой (данные не показаны). Что касается эозинофилов, то во всех группах, получавших АСИТ, наблюдалась тенденция к снижению содержания эозинофилов по сравнению с 1-й группой. Относительно моноцитов в группах, получавших АСИТ, также наблюдалась тенденция к их снижению по сравнению с 1-й группой, тогда как относительно лимфоцитов в этих группах отмечалась тенденция к повышению по сравнению с “модельной”, 1-й группой (данные не показаны).
------ Анализ клеточного состава БАЛ мышей, получавших АСИТ, показал достоверные различия относительного содержания эозинофилов у мышей опытных и контрольных групп (рис. 6). Максимальное содержание эозинофилов в БАЛ отмечено у “модельных” животных (1-я группа) по сравнению с 7-й группой (интактные мыши), что является одним из главных признаков развития ЭБА. В группах мышей, получавших АСИТ Тимполом и G6, отмечено снижение содержания эозинофилов в БАЛ по сравнению с таковым в 1-й группе, причем наиболее заметное в случае использования в суммарных дозах Тимпола 4 и 40 мкг/кг (см. рис. 6). Содержание других клеток, в частности эпителиоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов, в БАЛ у мышей, подвергшихся АСИТ, не отличалось статистически значимо от такового у мышей “модельной”, 1-й группы (данные не показаны).
Анализ гистологической картины легких мышей различных групп осуществляли по окрашенным микропрепаратам, приготовленным через 48 ч после последней ИА. Был проведен качественный и полуколичественный гистологический анализ легких на наличие характерных для ЭБА морфологических изменений. Морфологический анализ показал отсутствие патологических изменений ткани легких у мышей контрольной группы (0 баллов), тогда как у животных остальных групп обнаружены воспалительные процессы разной степени. Интересно, что они наблюдались в меньшей степени у мышей, получавших АСИТ (G6 или Тимполом). Наименее выраженная картина аллергического воспаления отмечалась при АСИТ Тимполом в дозе 40 мкг/кг.
Помимо общей картины воспаления легочной ткани, фиксировались и другие морфологические признаки воспаления: 1) слизистая метаплазия эпителия; 2) гиперплазия эпителия; 3) гипертрофия гладких мышц; 4) инфильтрация нейтрофилами; 5) инфильтрация эозинофилами; 6) инфильтрация лим-
- 138 -
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
а
б
1- я группа --- Модель БА
2- я группа G6
3- я группа Тимпол 4 мкг/кг
4- я группа Тимпол 40 мкг/кг
5- я группа Тимпол 400 мкг/кг
6- я группа ••••• Тимпол 4000 мкг/кг
7- я группа---Контроль
х - достоверно отличается от группы «модель БА» (1-я) по f-критерию Стьюдента;
* - достоверно отличается от группы «G6» (2-я) по t-критерию Стьюдента (отличия достоверны при р<0,05).
Рис. 5. Изменение частоты (а) и амплитуды (б) дыхательных актов по результатам пневмограмм мышей различных групп после в/б введения Мх в дозах 250 и 500 мкг/кг.
фоцитами. Все перечисленные признаки отсутствовали в 7-й группе (контрольной) и присутствовали в наибольшей степени у мышей “модельной” группы, причем всегда значительно выше, чем в группах, подвергавшихся АСИТ.
Инфильтрацию в перибронхиальную ткань нейтрофилов, эозинофилов и лимфоцитов, а также гиперплазию эпителия воздухоносных путей в разной степени наблюдали во всех экспериментальных группах, в то время как в контрольной группе (7-й) клеточная инфильтрация и гиперплазия эпителия отсутствовали. Метаплазия эпителия воздухоносных путей была ярко выражена у животных 1-й группы, однако у мышей, подвергшихся АСИТ G6 или Тимполом, особенно в дозе 40 мкг/кг, была заметно слабее. Гипертрофия гладких мышц отсутствовала во всех группах, кроме “модельной”.
Таким образом, у животных “модельной” группы отмечались деструкция и десквамация эпителия слизистой бронхов, выраженная перибронхиальная и периваскулярная клеточная
Рис. 6. Относительное содержание эозинофилов (в %) в БАЛ у мышей BALB/c, подвергнутых АСИТ G6 и Тимполом в суммарных дозах (по аллергоиду) 4, 40, 400 и 4000 мкг/кг.
инфильтрация, гиперемия сосудов, утолщение межальвеолярных перегородок. У животных, получавших АСИТ (G6 или Тимполом), в целом наблюдался регресс гистологических признаков ЭБА (рис. 7).
Суммируя полученные данные, можно констатировать, что на модели IgE-зависимой БА у мышей в ходе АСИТ Тим-полом выявлено дозозависимое повышение уровня аллергенспецифического IgG, а при дозе Тимпола 40 мкг/кг снижение индекса IgE/IgG. При АСИТ Тимполом обнаружено также снижение: 1) уровня патоморфологических воспалительных изменений в легких мышей, особенно заметное при дозе 40 мкг/мл; 2) признаков общего воспаления в ткани легких, метаплазии эпителия воздухоносных путей, гипертрофии гладких мышц. После АСИТ Тимполом в дозах 4 и 40 мкг/ кг установлено статистически значимое снижение относительного содержания эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже. В периферической крови выявлено достоверное снижение содержания нейтрофилов и моноцитов, а также увеличение содержания лимфоцитов. У животных, подвергшихся АСИТ Тимполом в дозах 4, 40 и 400 мкг/кг, наблюдалось снижение ГРБ, проявляющееся полным восстановлением частоты и амплитуды дыхательных актов, сходным с таковым в 7-й группе.
В данной работе нами использована так называемая безадъювантная модель экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей (ЭБА). Из литературы известно, что адъювантный (использование гидроокиси алюминия) и безадъювантный способы системной сенсибилизации при моделировании ЭБА приводят к образованию экспериментальной болезни сходного фенотипа [13], т. е. все базисные показатели ЭБА воспроизводятся при использовании обоих протоколов. В нашем случае при использовании клинически значимого аллергена (G6) для моделирования ЭБА без использования адъюванта получены выраженные иммуноморфологические признаки заболевания (1-3 балла), соответствующие легкой и средней степени тяжести БА человека. Именно при легкой и средней степени тяжести БА ВОЗ рекомендует проводить АСИТ у человека [12].
Кроме того, безадъювантный способ индукции ЭБА позволяет избежать побочных проявлений, связанных с использованием адъювантов, названных в последнее время термином ASIA (autoimmune/inflammatory syndrome induced by adjuvants) [23]. Вместе с тем использование безадъювантной модели в
- 139 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2012
Рис. 7. Гистологическая картина легких мышей BALB/c. а - нормальная структурная организация бронхов и ткани легких (интактные животные, 7-я группа). х 160; б - перибронхиальная и периваскулярная клеточная инфильтрация в "модельной" группе (1-я группа). х 160; в и г - гистологическая картина легких после АСИТ, проведенной соответственно G6 (2-я группа) и Тимполом (4 мкг/кг) (3-я группа).
нашем случае позволяет избежать так называемого конфликта адъювантов, так как в случае использования адъюванта (например, гидроокиси алюминия) для индукции ЭБА и Тимпола (куда входит иммуномодулятор ПО) для АСИТ было бы не совсем понятно, за счет какого адъюванта/иммуномодулятора наблюдается эффект АСИТ. Поэтому те гипосенсибилизирующие изменения, полученные при проведении экспериментальной АСИТ Тимполом, в нашем случае в достаточной степени можно отнести за счет иммуномодулирующего действия именно конъюгата ПО и аллергоида G6 (каковым является Тимпол), а не за счет какого-либо адъюванта, примененного при индукции ЭБА.
Полученный в нашем случае при АСИТ Тимполом или G6 эффект гипосенсибилизации наблюдался и при экспериментальной АСИТ другими аллергенами. В частности, при экспериментальной АСИТ овальбумином наблюдались понижение бронхиальной гиперреактивности и приток эозинофилов в БАЛ [9]. В нашем случае также показано снижение гиперреактивности бронхов и притока эозинофилов в БАЛ при АСИТ Тимполом и G6. Однако Тимпол имеет преимущества перед АСИТ только аллергеном (G6) в плане использования меньшей суммарной дозы (по белку), что является существенным фактором в плане улучшения безопасности данного вида лечения (нежелательные местные и системные реакции).
Известно, что “классическая” АСИТ у человека может сопровождаться появлением местных и системных побочных реакций, последние из которых могут носить угрожающий для жизни характер. Считается, что частота местных побочных реакций при АСИТ может служить критерием для прогнозирования системных реакций в будущем в ходе АСИТ [21]. Учитывая, что это все еще остается актуальным и для новых препаратов, то при экстраполяции полученных нами
данных на человека можно рассчитать суммарную дозу Тимпола для АСИТ у человека, исходя из суммарной дозы, полученной на животных. Известно, что чем меньше размеры млекопитающего, тем больше отношение площади поверхности его тела к массе и выше скорость окислительных процессов. В связи с этим при перерасчете дозы с животных на человека более точным является определение суммарной дозы, исходя из соотношения между площадью поверхности и массой тела [8]. Так, для человека соотношение площади поверхности тела (18 000 см2) и массы тела (средняя масса 70 кг) составляет 257, а для мыши при площади поверхности тела 61 см2 и средней массе 0,020 кг - 3050.
Исходя из приведенных соотношений между массой и площадью поверхности тела, можно рассчитать дозу Тим-пола для человека. Так, суммарная доза Тимпола 40 мкг/кг, демонстрирующая выраженный эффект экспериментальной АСИТ (при соотношении 3050 см/кг), у человека (соотношение 257) будет составлять 3,37 мкг/кг, что для массы в 70 кг будет составлять 235,9 мкг по G6. Это несколько меньше, чем суммарная доза Тимпола 4555 PNU (или 284,68 мкг по G6), использованная при АСИТ больных аллергией с сенсибилизацией к G6. Следовательно, для АСИТ у человека можно использовать дозу Тимпола (по G6) на 48,78 мкг (или 780,5 PNU) меньше (т. е. на 17%), а именно 235,9 мкг (или 3774,5 PNU), чем это используется при существующей в настоящее время схеме, что может привести к снижению побочных местных реакций без потери эффективности.
Вместе с тем в наших экспериментах оказалось, что и суммарная доза Тимпола 4 мкг/кг весьма эффективна в отношении снижения признаков аллергического воспаления в легких (по данным гистологического исследования), содержания эозинофилов в БАЛ, снижения гиперреактивности бронхов
- 140 -
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
и, следовательно, также может рассматриваться для АСИТ у человека. Экстраполируя эту дозу Тимпола на человека, можно предположить, что АСИТ Тимполом больных риноконъюн-ктивитом/БА с сенсибилизацией к G6 будет эффективна и при суммарной дозе Тимпола, равной 377,45 PNU (или 23,5 мкг по G6). В свою очередь это обстоятельство позволит уменьшить количество инъекций в процессе АСИТ, что даст возможность полностью нивелировать избыточные местные отсроченные реакции и в конечном счете приведет к большей безопасности при сохранении эффективности лечения [3].
Решение задачи по снижению числа побочных местных реакций при АСИТ вообще и АСИТ Тимполом в частности может лежать и в плоскости изменения соотношения аллерго-ид/полиоксидоний в конъюгате или предотвращения возможного процесса ренатурации аллергоида после конъюгации его с носителем (в данном случае с ПО). Однако проведенные нами эксперименты по изучению явления ренатурации аллергоида при комплексировании его с ПО в различных соотношениях методом кругового дихроизма показали, что такого явления не происходит (данные не показаны), т. е., ал-лергоид сохраняет свою третичную структуру, приобретенную после химической модификации, в составе комплекса с ПО и как следствие - пониженную аллергенность.
Идея использования для АСИТ комплексов/конъюгатов химически модифицированных аллергенов и природных или полимерных носителей (адъювантов) продолжает в настоящее время воплощаться в клиническую практику лечения атопических аллергических заболеваний рядом зарубежных авторов. В частности, получены хорошие результаты в контролируемом исследовании при лечении поллиноза с помощью комплекса химически модифицированного аллергенного экстракта пыльцы 13 трав и адъюванта - монофосфориллипида А. Курс лечения состоит из четырех предсезонных подкожных инъекций с интервалом в неделю и приводит к незначительному повышению уровня антиаллергенного IgE в ходе АСИТ, который в дальнейшем выходит на “плато”, и существенному повышению уровня аллергенспецифического IgG, что обеспечивает в дальнейшем эффект гипосенсибилизации пациентов, выражающийся в снижении сезонного проявления симптомов аллергии, потребления антиаллергических препаратов и улучшении качества жизни [14].
Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что возможно предотвратить развитие экспериментальной атопической БА с помощью АСИТ Тимполом и что данный подход может быть эффективен при терапии атопической БА человека. Основываясь на полученных нами данных, также можно предположить, что использование для экспериментальной АСИТ Тимпола в суммарных дозах 4 и 40 мкг/кг при экстраполяции этих доз на человека может обеспечить безопасную и эффективную гипосенсибилизацию с заметным снижением аллергического воспаления в легких в случае атопической БА легкой и средней степени тяжести.
ЛИТЕРАТУРА
1. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы (GINA). Пересмотр 2006.: Пер. с англ. под ред. А. Г. Чучалина. - М., 2007.
2. Дрожжев М. Е., Лев Н. С., Костюченко М. В. и др. Современные показатели распространенности бронхиальной астмы среди детей // Пульмонология. - 2002. - № 1. - С. 42-46.
3. Игнатьев И. В., Лусс Л. В., Бабахин А. А. и др. Безопасность и эффективность аллергенспецифической иммунотерапии аллер-готропином Тимпол: двойное слепое плацебо-контролируемое исследование // Рос. аллергол. журн. - 2004. - № 4. - С. 30-39.
4. Княжеская Н. П. Тяжелая бронхиальная астма // Consilium Medicum. - 2002. - № 4. - С. 189-197.
5. Крючков Н. А., Бабахин А. А., Башкатова Ю. Н. и др. Краткосрочная безадъювантная модель IgE-зависимой астмы у лабораторных мышей с использованием аллергена пыльцы тимофеевки // Рос. аллергол. журн. - 2008. - № 4. - С. 37-45.
6. Литвин Л. С., Бабахин А. А., Стеценко О. Н. и др. Характеристика краткосрочной безадъювантной модели IgE-зависимой бронхиальной астмы (БА) у мышей BALB/c // Физиол. и патол. иммун. сист. - 2007. - № 11. - С. 17-24.
7. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Атауллаханов Р. И. Иммуногенетика и искусственные антигены. - М., 1987. - С. 45-47.
8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. -С. 204-208.
9. Babakhin A. A., Khaitov R. M., Petrov R. V. Modified allergen immunotherapy effect on immunoglobulin E production // Allergy Proc. - 1995. - Vol. 16. - P. 195-202.
10. Babakhin A. A., DuBuske L. M., Wheeler A. W. et al. Immunological properties of allergen chemically modified synthetic copolymer of N-vinylpyrrolidone and maleic anhydride // Allergy Proc. - 1995. - Vol. 16. - P. 261-268.
11. Beasley R. The Global Burden of Asthma Report, Global Initiative for Asthma (GINA), 2004. Available from: www.ginasthma.org.
12. Bousquet J., Lockey R., MallingH. J. Allergen-immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases. A WHO position paper // J. Allergy Clin. Immunol. - 1998. - Vol. 102. - P. 558-562.
13. ConradM. L., Yildirim A. O., Sonar S. S. et al. Comparison of adjuvant and adjuvant-free murine experimental asthma models // Clin. Exp. Allergy. - 2009. - Vol. 135. - P. 1-9.
14. DuBuske L. M., Frew A. J., Horak F. et al. Ultrashort-specific immunotherapy successfully treats seasonal allergic rhinocon-junctivitis to grass pollen // Allergy Asthma Proc. - 2011. - Vol. 32. - P. 239-247.
15. Durham S. R., Leung D. Y. M. One hundred years of allergen immunotherapy: Time to ring the changes // J. Allergy Clin. Immunol. - 2011. - Vol. 127, N 1. - P. 3-7.
16. Ennis D. P., Cassidy J. P., Mahon B. P. A cellular pertussis vaccine protects against exacerbation of allergic asthma due to Bor-detella pertussis in a murine model // Clin. Diagn. Lab. Immunol.
- 2005. - Vol. 12. - P. 409-417.
17. Freeman J. Further observation on the treatment of hay fever by hypodermic inoculation of pollen vaccine // Lancet. - 1911. -Vol. 2. - P. 814-817.
18. Grammer L., Shoughnessy M., Patterson R. Modified forms of allergen immunotherapy // J. Allergy Clin. Immunol. - 1985. - N
2. - P. 397-401.
19. Janssen E. M., Wauben M. H. M., JonkerE. H. et al. Opposite effect of immunotherapy with valbumin and the immuno-dominant T-cell epitope on airway eosinophilia and hyperresponsiveness in a murine model of allergic asthma // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. - 1999. - Vol. 21. - P. 21-29.
20. Noon L. Prophylactic inoculation against hay fever // Lancet. -1911. - Vol. 1. - P. 1572-1573.
21. Roy S. R., Sigmon J. R., Oliver J. et al. Increased frequency of large local reactions among systemic reactions during subcutaneous allergen immunotherapy // Ann. Allergy. - 2007. - Vol. 99.
- P. 82-86.
22. Selgrade M. K., Lemanske R. F., Gilmour M. et al. Induction of asthma and the environment: what we know and need to know // Environ. Hlth Perspect. - 2006. - Vol. 114. - P. 615-619.
23. Shoenfeld Y., Agmon-Levin N. ‘ASIA’ - Autoimmune/inflamma-tory syndrome induced by adjuvants // J. Autoimmun. - 2011.
- Vol. 36. - P. 4-8.
24. Williams A. P., Krishna M. T., Frew A. J. The safety of immunotherapy // Clin. Exp. Allergy. - 2004. - Vol. 34. - P. 513-514.
25. Ying S., Zhang G., Gu S., Zhao J. How much do we know about atopic asthma: where are we now? // Cell. Mol. Immunol. - 2006.
- Vol. 3. - P. 321-332.
Поступила 17.11.11
- 141 -
