CC BY
95
© Коллектив авторов, 2019
Шиловский И.П.1, Никольский А.А.1, Никонова А.А.2, Гайсина А.Р.1, Вишнякова Л.И.1, Барвинская Е.Д.1, Ковчина В.И.1, Болотова С.И.1, Юмашев К.В.3, Брылина В.Е.3, Хаитов М.Р.1
Инфекция мышей респираторно-синцитиальным вирусом, вызывающая дисфункцию дыхательных путей, связанную с воспалением в ткани легких, как модель патологии человека
1 ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115522, г. Москва, Россия
2 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», 105064, г. Москва, Россия
3 ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА им. К.И. Скрябина», 109472, г. Москва, Россия
Резюме. Респираторно-синцитиальный вирус человека (РСВ) - основной патогенетический агент инфекций нижних дыхательных путей у детей. РСВ-инфекция, характеризующаяся высокой заболеваемостью и смертностью, является серьезной проблемой для здравоохранения. На сегодняшний день нет лицензированных вакцин для профилактики этого заболевания. Для терапии РСВ также не создано безопасных и доступных фармацевтических препаратов. Среди трудностей, связанных с изучением данного патогена и созданием новых подходов к терапии вызываемых им заболеваний следует отметить отсутствие единой модели РСВ-инфекции на животных, которая имитировала бы все аспекты патологии человека. Для исследования анти-РСВ-терапии используют модели на мышах, крысах, хорьках, телятах, овцах, шимпанзе и др. Чаще всего РСВ-инфекцию моделируют на мышах, так как их использование наиболее экономически целесообразно. Однако РСВ не является естественным патогеном для мышей, вследствие чего его репликация в дыхательных путях этих животных незначительна, а признаки патологии выражены слабо. Поэтому зачастую не удается одновременно воссоздать у мышей основные признаки патологии. В данном исследовании мы создали протокол инфекции мышей линии БЛЬБ/е концентрированным и очищенным РСВ (штамм А2), который позволяет одновременно воссоздать такие клинически значимые проявления патологии человека, как гиперреактивность бронхов, воспаление в легких, инфильтрацию респираторного тракта провоспалительными клетками и т.д. Исследование показало, что РСВ-инфекция активирует у мышей преимущественно ТЪ1-иммунный ответ, что соответствует данным клинических наблюдений у человека. Созданная модель РСВ-инфекции у мышей может быть использована как для изучения патогенеза заболевания, так и для тестирования новых подходов к анти-РСВ-терапии.
Ключевые слова: респираторно-синцитиальный вирус; модель на мышах; иммунный ответ
Статья поступила 10.06.2019. Принята в печать 16.08.2019.
Для цитирования: Шиловский И.П., Никольский А.А., Никонова А.А., Гайсина А.Р., Вишнякова Л.И., Барвинская Е.Д., Ковчина В.И., Болотова С.И., Юмашев К.В., Брылина В.Е., Хаитов М.Р. Инфекция мышей респи-раторно-синцитиальным вирусом, вызывающая дисфункцию дыхательных путей, связанную с воспалением в ткани легких, как модель патологии человека. Иммунология. 2019; 40 (5): 72-83. 10.24411/0206-49522019-15008.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 18-74-10002. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Шиловский Игорь Петрович -доктор биологических наук, заместитель директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Shilovskiy I.P.1, Nikolskii A.A.1, Nikonova A.A.2, Gaisina A.R.1, Vishniakova L.I.1, Barvinskaya E.D.1, Kovchina V.I.1, Bolotova S.I.1, Yumashev K.V.3, Brylina V.E.3, Khaitov M.R.1
Respiratory syncytial virus infection in mice inducing airway disfunction associated with lung tissue inflammation as a model of human pathology
1 NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, 115522, Moscow, Russia
2 Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera, 105064, Moscow, Russia
3 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MVA named after K.I. Scriabin, 109472, Moscow, Russia
Abstract. Human respiratory syncytial virus (RSV) is the main cause of lower respiratory tract infections in children. RSV infection, characterized by high morbidity and mortality, is a serious public health problem. There are no licensed vaccines available for the prevention of this disease. Save and affordable medications for RSV treatment were not developed yet. One of the main difficulties to study RSV pathogenesis and to develop new approaches for its therapy is the lack universal animal model that recapitulates all aspects of human pathology.
There are exist animal models of RSV infection in mice, rats, ferrets, calves, sheeps, chimpanzees, etc. Most often, mice are used for RSV modeling, since their use is most economically feasible. However, RSV is not a natural pathogen for mice, therefore its replication in the mouse respiratory tract is not significant, and pathological features are poorly expressed. That is the main reason why all aspects of human RSV pathology could not be reproduced in mice simultaneously. In this study, we created the BALB/c mouse infection protocol with purified and concentrated RSV (strain A2), which allows induce such clinically significant manifestations of human pathology as bronchial hyperreactivity, pneumonia, respiratory tract infiltration by pro-inflammatory cells, etc. A study showed that RSV infection activates mainly Th1 immune response in mice, which is consistent with clinical observations in humans. Model of RSV infection in mice developed in this study can be used both to clarify the pathogenesis of the disease and to test new approaches for anti-RSV therapy.
Keywords: respiratory syncytial virus; murine model; immune response
Received 10.06.2019. Accepted 16.08.2019.
For citation: Shilovskiy I.P., Nikolskii A.A., Nikonova A.A., Gaisina A.R., Vishniakova L.I., Barvinskaya E.D., Kovchina V.I., Bolotova S.I., Yumashev K.V., Brylina V.E., Khaitov M.R. Respiratory syncytial virus infection in mice inducing airway disfunction associated with lung tissue inflammation as a model of human pathology. Immunologiya. 2019. 40 (5): 72-83. doi: 10.24411/0206-4952-2019-15008.
Funding. The study was supported by RSF No 18-74-10002.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
For correspondence
Shilovskiy Igor P. - Dr.Sci., PhD, Deputy Director for Science and Innovation, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russia, E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Введение
Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) относится к порядку Mononegavirales, семейству Pneumovi-ridae, роду Orthopneumovirus. РСВ - самый распространенный патоген, вызывающий тяжелые заболевания верхних и нижних дыхательных путей. Особенно этот патоген опасен для таких групп риска, как дети, пожилые люди, пациенты с иммунодефицитами, а также пациенты, страдающие бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких [1, 2]. По данным эпидемиологических исследований, из всех случаев инфекций респираторного тракта до 80% детей госпитализируются по причине РСВ [3]. Этот патоген способен вызывать жизнеугрожающие осложнения, такие как
бронхиолит и пневмония, при этом смертность от него среди детей может достигать 200 000 ежегодно [4]. Прямой экономический ущерб от РСВ-инфекции (по данным в США) оценивается в 1,15 млрд долларов [5].
К настоящему моменту не разработано профилактической вакцины от РСВ [6], а фармакотерапия с применением рибавирина сопряжена с большим количеством нежелательных эффектов [7]. Многообещающие результаты в клинических исследованиях демонстрируют препараты на основе моноклональных антител, однако их широкое использование ограничено высокой стоимостью [8]. Новые подходы к терапии РСВ-инфекции еще находятся в стадии разработки [9-13].
Изучение биологии РСВ позволило установить главные особенности инфекционного процесса у чело-
века. Вирус поражает респираторный тракт путем прямого контакта аэрозольных частиц, содержащих патоген. Начальные стадии репликации вируса происходят в носоглотке после инкубационного периода 4-5 сут. В дальнейшем РСВ может распространиться и поражать нижние дыхательные пути. Тяжесть инфекции может быть различной, от легких симптомов простуды до развития бронхиолита, сопряженного с обструкцией бронхов и гипоксией, а также с пневмонией [14]. При этом обструкция бронхов может выявляться в 24% случаев РСВ-инфекции. РСВ главным образом реплицируется в ресничном эпителии дыхательный путей и альвеолярных пневмоцитах I и II типа, что было установлено в гистологическом исследовании ткани легких пациентов, погибших по причине РСВ-инфекции. Кроме того, патологические изменения в легких характеризовались перибронхиальной и периваскулярной мононуклеарной инфильтрацией, наличием признаков пневмонии, некроза эпителиальных клеток, закупоркой просвета бронхов клетками отшелушивающегося эпителия, макрофагами и нейтрофилами. Цитофлюориметрический анализ установил, что при РСВ-инфекции легкие инфильтрируются главным образом моноцитами, СВ3+СБ4-СБ8--Т-клетками и популяцией клеток СБ3+СБ8+. В то же время СБ4+- и СБ8+-лимфоциты были достаточно редкими. Анализ образцов бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) показал присутствие значительного количества нейтрофилов у детей с РСВ-индуцированным брон-хиолитом [15], повышенное содержание провоспали-тельных цитокинов, в том числе ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-1а, хемокинов ИЛ-8, М1Р-1а, МСР-1а и ЯАОТБЗ [16], а также ИФН-у, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-9 и ИЛ-17 [17]. По всей видимости, активация вирусом продукции указанных воспалительных факторов вносит в клад в его патогенез и тяжесть течения инфекции.
Разработка новых способов профилактики и терапии РСВ-инфекции невозможна без создания адекватных моделей этой инфекции на лабораторных животных. К настоящему времени не разработано модели РСВ-инфекции, которая бы полностью воссоздавала патогенез заболевания человека. Однако для проведения доклинических исследований активно используют такие виды животных, как мыши, крысы, хорьки, телята, овцы и др. [18, 19]. Главным ограничением в использовании этих видов является то, что они частично чувствительны к РСВ, то есть вирус плохо реплицируется в дыхательных путях, вследствие чего признаки патологии слабо выражены. Шимпанзе - это единственный вид животных, природно-восприимчивый к РСВ человека [18, 19]. Широкое использование шимпанзе, а также других крупных животных для моделирования РСВ-инфекции ограниченно значительными издержками на их содержание, поэтому наиболее часто для этой цели используют грызунов.
Несмотря на то что крысы считаются более чувствительным к РСВ видом животных по сравнению с мышами, так как у них наблюдается более выраженная репликация патогена в респираторном тракте, у этих
животных зачастую не развиваются клинические проявления заболевания. Чаще всего для моделирования РСВ-инфекции применяют мышей линии БАЬБ/с, которым вводят интраназально РСВ в дозах 105-106 ТЦД50 (ТЦД50 - тканевая цитопатогенная доза вируса, вызывающая гибель 50% клеток монослоя). Инфекция характеризуется потерей массы тела, инфильтрацией легких мононуклеарами, увеличенной продукцией слизи эпителием бронхов, обструкцией дыхательных путей и активацией провоспалительных цитокинов в период острой фазы (см. обзоры [18, 19]).
Различия во врожденном и адаптивном иммунитете мышей и человека [20] ограничивают использование моделей на мышах для изучения патогенеза РСВ-инфекции, а также затрудняют интерпретацию результатов изучения эффективности вакцин. Однако тестирование биологической активности препаратов на основе моноклональных антител [21], молекул миРНК [22, 23], пептидов [11] и прочих ингибиторов [10] на таких моделях оправдано.
Целью исследования стало создание экспериментальной модели РСВ-инфекции у мышей линии БАЬБ/с, которых инфицировали высокой дозой очищенного вируса. Такой подход позволяет регистрировать гиперреактивность бронхов, с использованием стандартизованных систем оценки количественно определять выраженность воспаления в ткани легких, а также количественно определять репликацию РСВ и активацию воспалительных факторов в дыхательных путях.
Материал и методы
Питательные среды, культуры клеток, штамм вируса, животные. В работе использовали полную питательную среду Игла-МЕМ («ПанЭко», Россия) с добавлением 25 мМ ИБРБ8 («ПанЭко», Россия), 300 мг/л Ь-глутамина («ПанЭко», Россия), 50 мкг/мл гентами-цина (вШсо, США) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (БюБега, Филиппины); неполную питательную среду Игла-МЕМ с добавлением 25 мМ ИБРБ8, 600 мг/л Ь-глутамина и 50 мкг/мл гентамицина (вШсо, США); полную питательную среду ИРМ1-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 25 мМ ИБРБ8, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 300 мг/л Ь-глутамина и 50 мкг/мл гентамицина.
В работе использовали культуры клеток Иер-2 (эпи-дермоидная карцинома гортани человека) и МА-104 (эмбриональная почка макаков-резус), которые были приобретены в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, а также вирус РСВ штамм А2, предоставленный ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова».
Мышей самок линии БАЬБ/с возрастом 6-8 нед, весом 18-20 г приобретали в питомнике лабораторных животных филиала ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова» РАН (г. Пущино, Россия). Животных кормили стандартным лабораторным кормом для грызу-
нов («Дельта Фидс», Россия). Мышам был предоставлен неограниченный доступ к воде. Эксперименты на животных проводились в соответствии с принципами Директивы Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/EU от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях, и были одобрены Этическим комитетом ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.
Наращивание, концентрирование и очистка РСВ. Наращивание вируса поводили на клетках Hep-2, которые культивировали в полной питательной среде RPMI-1640 в 5% CO2 при 37 °C. За 24 ч до заражения вирусом клетки пересевали на культуральные 175 см2 флаконы (Becton Dickinson, США), так, чтобы к моменту заражения они образовали монослой с 75% конфлюентностью. Непосредственно перед заражением монослой клеток дважды промывали средой RPMI-1640 без сыворотки, а затем вносили вирусный материал. После 2-часовой адсорбции вируса при 37 °C (при периодическом покачивании флаконов), добавляли 50 мл среды c 2% сывороткой. Вирусный материал для концентрации собирали через 72 ч после заражения, когда основная часть монослоя была разрушена в результате цитопатического действия вируса. Оставшиеся прикрепленными клетки снимали скребком, вирус-содержащую жидкость объединяли в единый флакон.
Вирус-содержащую жидкость (2 л) использовали для концентрирования вируса, по методике, описанной в статье [24]. После размораживания на водяной бане при 37 °C сконцентрированный вирусный материал титровали в 96-луночных планшетах (SPL Lifesciences, Корея). Для титрования использовали клетки МА-104, так как на них хорошо проявляется классическое цито-патогенное действие вируса (образование синцитиев), которое можно учитывать при мониторинге монослоя с использованием микроскопа. Титр вируса рассчитывали по методу Спирмена-Кербера и выражали в ТЦД50/мл. Титр вируса до концентрирования составлял 1-107 ТЦД50/мл, после концентрирования составил 1109 ТЦД50/мл.
РСВ-инфекция in vivo. Мыши были разделены на три группы (по 10 мышей в каждой). Животных 1-й группы (RSV) инфицировали (интраназально) РСВ А2 однократно в объеме 50 мкл фосфатно-солевый буферный раствор (ФСБР) («ПанЭко», Россия) в дозе 5 • 106 ТЦД50/мышь.В качестве контроля мышам 2-й группы (RSV-UV^ аналогичной дозе и объеме вводили РСВ, инактивированный ультрафиолетовым излучением, в течение 40 мин. Животные 3-й группы (Норма) никаким манипуляциям не подвергались. Через 5 сут после инфекции у мышей оценивали гиперреактивность бронхов. На 6-й день эксперимента мышей забивали цервикальной дислокацией и отбирали образцы бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) для последующего определения клеточного состава вирусной нагрузки. Левое легкое фиксировали в 10% формалине (Carl Roth, Германия) для последующего изготовления гистологических срезов и оценки выраженности признаков вос-
паления, правое легкое замораживали для выделения РНК и определения вирусной нагрузки методом количественной ПЦР. В течение всего эксперимента осуществляли контроль массы тела животных.
Изучение гиперреактивности бронхов. Измерение гиперреактивности бронхов (ГРБ) проводили на 5-е сутки после инфицирования мышей вирусом РСВ. С помощью прибора для общей плетизмографии FinePointe NAM (Buxco, США) оценивали удельное сопротивление дыхательных путей (sRaw) после ингаляционного введения возрастающих концентраций мета-холина (Sigma-Aldrich, США): 6,25, 12,5 и 25 мг/мл.
Клеточный состав БАЛ. Взятие образцов БАЛ проводили на 6-й день эксперимента. Для этого у забитых мышей сепарировали трахею и вводили в нее шприцем 0,5 мл полной среды RPMI-1640, затем отбирали введенную в легкие жидкость. После этой процедуры проводили подсчет общего количества клеток каждого образца в камере Горяева. Все образцы БАЛ центрифугировали в течение 7 мин при 2000 об/мин при 4 °C. Надосадок переносили в отдельную пробирку, замораживали и хранили при -20 °С до анализа. Часть осадка клеток наносили на предметное стекло, высушивали около часа, затем фиксировали метанолом («Химмед», Россия) в течение 15 мин, после чего высушивали в течение 12 ч и окрашивали азуром и эозином («ГЕМСТАНДАРТ-Р», Россия). Клеточный состав мазка БАЛ определяли методом световой микроскопии, проводя подсчет не менее 200 клеток на один мазок при увеличении в 400 раз.
Гистологические исследования ткани легких. Для приготовления микропрепаратов легкие после длительной фиксации в формалине обезвоживали путем проводки по спиртам и заливали образцы органов в парафин. Микротомированием парафиновых блоков получали срезы легких толщиной 4-6 мкм. Полученные препараты окрашивали гематоксилином и эозином (Bio-Optica, Италия) для идентификации эозинофилов, ней-трофилов и лимфоцитов. Гистологическое исследование микропрепаратов легких осуществляли на световом микроскопе (Olympus, Япония). Помимо качественной, проводили полуколичественную оценку воспалительных изменений и ремоделирования бронхов по методике, описанной в статье [25]. При этом выраженность того или иного признака воспаления оценивали в баллах, где: 0 - отсутствует, 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 - выраженная.
Определение вирусной нагрузки в ткани легких. Общую РНК выделяли из ткани легкого с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем ее использовали в реакции обратной транскрипции для получения библиотеки кДНК с применением набора ОТ-1 («Синтол», Россия). При постановке реакции использовали неспецифические гексамерные прай-меры. Полученную кДНК в дальнейшем использовали для детекции вирусной РНК и мРНК генов-мишеней в ткани легких и образцах БАЛ при помощи ПЦР в ре-
Последовательности праймеров и зондов
Мишень Праймер/зонд Последовательность
РСВ ген P Прямой GAAGCATTAATGACCAATGA
Зонд (ROX) GCTATGGCAAGACTCAGGAATGAG (RTQ2)
Обратный CATCTGATGTGTCTTTTGC
Actb Прямой CTTTGCAGCTCCTTCGTTG
Зонд (ROX) GCCCTAGGCACCAGGGTGTGATG(RTQ2)
Обратный CACATAGGAGTCCTTCTGAC
T-bet Прямой CCCAACTGTCAACTGCTTG
Зонд (ROX) AGCCGTTTCTACCCCGACCTTCCAG (RTQ2)
Обратный GCCAGTAAGGCTGTGAGATC
GATA3 Прямой CTTATCAAGCCCAAGCG
Зонд (ROX) CAGCAAGGAGAGCAGGGACATCCT (RTQ2)
Обратный CATTAGCGTTCCTCCTCC
Ifng Прямой AAATCCTGCAGAGCCAGATTAT
Зонд (ROX) ACGCTTATGTTGTTGCTGATGGCC (RTQ2)
Обратный GCTGTTGCTGAAGAAGGTAGTA
Il4 Прямой GAGAGTGAGCTCGTCTGTAGG
Зонд (ROX) ATGCCTGGATTCATCGATAAGCTGCA (RTQ2)
Обратный TCAGTGATGTGGACTTGGAC
Il5 Прямой TACTGTGGAAATGCTATTCCA
Зонд (ROX) CCGCCAAAAAGAGAAGTGTGGC (RTQ2)
Обратный GTAATCCAGGAACTGCCTC
Il13 Прямой GTGCCAAGATCTGTGTCTCTC
Зонд (ROX) CTGAGCAACATCACACAAGACCAGACTC (RTQ2)
Обратный TCCACACTCCATACCATGC
Il17a Прямой GTCTTTAACTCCCTTGGCG
Зонд (ROX) GTCACCCTGGACTCTCCACCGC (RTQ2)
Обратный GATCACAGAGGGATATCTATCAG
Il17f Прямой CACGTGAATTCCAGAACC
Зонд (ROX) CAGTGCAGACACTCAGGCTGCATC (RTQ2)
Обратный ACGGAGTTCATGGTGCT
альном времени с применением амплификатора iCycler IQ5 (Bio-Rad, США) и специфической пары праймеров и зонда (см. таблицу).
Дополнительно определяли вирусную нагрузку по количеству образованного синцития. Для этого в 96-лу-ночный планшет (SPL Lifesciences, Корея) высевали клетки МА-104 в количестве 20 тыс./лунка в объеме 100 мкл/лунка полной среды Игла-MEM. Инкубировали 1 сут в С02-инкубаторе до образования 75% конфлюент-ности. Далее заменяли среду на бессывороточную Игла-МЕМ и вносили образцы БАЛ с последующим титрованием с 10-кратным шагом. Инкубировали 4 ч, после чего меняли среду на сывороточную Игла-МЕМ и инкубировали в течение суток в С02-инкубаторе, после чего заменяли среду на бессывороточную Игла-МЕМ и инкубировали планшет в течение 3 сут в С02-инкубаторе. Количество синцитиев подсчитывали методом световой микроскопии.
Статистический анализ данных. Для всех количественных данных вычисляли среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (m). Определяли межгрупповые различия с помощью непараметрического ^-критерия Манна-Уитни с использованием программы Statistica 8.0 (StatSoft inc., США).
Результаты
Изменение массы тела и гиперреактивности бронхов. В течение 6 сут после заражения у мышей ежедневно оценивали изменение массы тела. Животные, которым вводился жизнеспособный вирус, демонстрировали снижение массы тела в течение 3 сут на 10%, что свидетельствует о протекании патологического процесса. При этом у мышей, инфицированных инак-тивированным вирусом, а также у животных из группы «Норма» масса тела не изменялась на протяжении наблюдаемого периода (рис. 1 А).
На 5-е сутки после инфекции оценивали гиперреактивность бронхов мышей в ответ на ингаляционные введения возрастающих концентраций бронхокон-стриктора - метахолина. У животных, инфицированных жизнеспособным РСВ, гиперреактивность бронхов статистически значимо возрастала на 30%, по сравнению с мышами, получавшими инактивированный вирус и группой «Норма» (рис. 1 Б).
Изменение вирусной нагрузки в ткани легких. Вирусную нагрузку в легких изучали через 6 сут после инфекции двумя методами. Во-первых, определяли количество копий геномной вирусной РНК в гомогена-
э
2 3 4 5 6
Дни
! RSV 5 RSV-UV i Норма
-
S
12
Н
м
0,00
6,25 12,50
Концентрация метахолина, мг/мл
5 RSV-UV
25,00
RSV
Норма
Рис. 1. Динамика массы тела (А) и изменение гиперреактивности бронхов (Б) после РСВ-инфекции
А - изменение массы тела (в %) относительно дня инфекции. Масса тела мышей в 1-й день принята за 100%. Представлены средние значения ± стандартная ошибка. В каждой группе взвешивали по 10 животных; Б - гиперреактивность бронхов в ответ на аэрозольное введение возрастающих концентраций метахолина. Гиперреактивность бронхов оценивалась по удельному сопротивлению дыхательных путей. Представлены средние значения (смН20хсек)/мл ± стандартная ошибка. В каждой группе удельное сопротивление дыхательных путей измеряли у 10 животных
Здесь и на рис. 2-4: х - статистически значимо отличается от группы ЕБ¥-и¥; # - статистически значимо отличается от группы «Норма». Применялся непараметрический статистический анализ по Манну-Уитни. Отличия считались значимыми прир < 0,05.
э
20 000 000
15 000 000
> >s 10 000 000
* 3 S 10 ио
5 000 000
х #
RSV
RSV-UV
Норма
Э
и
яе х 5
§ W
а §
13 * g «
и
л
125
100 -
75
50
25 -
RSV
RSV-UV
Норма
Рис. 2. Вирусная нагрузка в ткани легких А - оценка количества копий вирусной РНК (уКЫЛ) в гомоге-натах легких. Легкие мышей гомогенизировали для последующего выделения РНК и проведения количественного ПЦР-анализа с использованием праймеров и зонда, специфичных к геному РСВ. На рисунке представлены средние значения количества копий РНК вируса в 1 мкг общей РНК ± стандартная ошибка. В каждой группе анализировали 10 образцов легких; Б - оценка количества синцитиев вируса в БАЛ. У мышей забирали образцы БАЛ и титровали их на подготовленном монослое клеток МА-104, чувствительных к РСВ. Через 3 сут подсчитывали количество синцитиев методом световой микроскопии. На рисунке представлены средние значения количества синцитиев в 1 мл БАЛ ± стандартная ошибка. В каждой группе анализировали 10 образцов БАЛ
тах ткани легкого методом количественной ПЦР. После инфекции мышей вирусом в их легких в среднем детектировалось 12,5-106 копий на 1 мкг общей РНК, в то время как после интраназального введения инак-тивированного РСВ в легких обнаруживалось в 6,5 раз меньше вирусной РНК. У мышей группы «Норма» РНК вируса в легких не определялась (рис. 2А). Во-вторых, количественно оценивали жизнеспособные вирусы в образцах БАЛ методом титрования на монослое клеток МА-104. Известно, что РСВ вызывает слияние плазматических мембран близлежащих клеток и образование синцития, который можно идентифицировать на монослое клеток методом световой микроскопии. В образцах БАЛ мышей, инфицированных РСВ, выявлялось в среднем 63 синцития на 1 мл, в то время как в БАЛ мышей, получавших инактивированный ви-
рус, отмечались лишь единичные синцитии; в среднем 5 синцитиев/мл (рис. 2Б).
Клеточный состав БАЛ и гистологические изменения в ткани легких. Через 6 сут после инфекции у мышей был изучен клеточный состав БАЛ. Общее количество клеток, обнаруживаемых в БАЛ, увеличивалось в 1,6 раза после введения РСВ 2А в сравнении с мышами группы «Норма» и с мышами, получавшими инак-тивированный штамм. Аналогично количество макрофагов также увеличивалось в смывах легких после инфекции жизнеспособным вирусом в 1,4 раза как по сравнению с интактными животными, так и по сравнению с животными, получавшими инактивированный вирус. Самый значительный прирост демонстрировали лимфоциты, количество этих клеток в БАЛ увеличивалось в 18 раз и достигало 20 177 ± 5058 кл/мл (при-
0
6
5
4
3
2
0
мерно 20% от общего количества клеток). В то же время у мышей, инфицированных инактивированным РСВ, количество лимфоцитов было незначительным (1167 ± 234 кл/мл), не превышало 3% от всей популяции клеток и было сопоставимо с группой «Норма» (1130 ± 405 кл/мл). Провоспалительные клетки нейтрофилы и эозинофилы в образцах БАЛ всех трех экспериментальных групп практически не обнаруживали; отмечали лишь единичные нейтрофилы(в среднем 250 клеток в 1 мл) у мышей, инфицированных жизнеспособным РСВ (рис. 3А).
Микроскопический анализ образцов легких подтвердил, что РСВ-инфекция индуцирует выраженную инфильтрацию легких лимфоцитами, которые локализуются преимущественно на периферии бронхов. Также подтверждено отсутствие нейтрофилов и эозинофилов в ткани легких. Гистологический анализ позволяет оценивать не только клеточный состав инфильтратов, но и формирование таких признаков воспаления, как гиперплазия и метаплазия респираторного эпителия, а также гипертрофия гладкой мускулатуры. Проведенный анализ выявил развитие негативных морфологи-
Э
150 000
100 000
50 000
х #
х #
Ъ
|Ь
х #
Всего
э
Нейтрофилы ■ RSV
Эозинофилы
Клетки □ RSV-UF
Макрофаги Лимфоциты
□ Норма
0 -
х #
х #
¿>=0,06
х #
ГТ
Г~1 Г 1
Г~1 г 1
Г~1 Г 1
о_
гп г т
Лимфоциты
Общее воспаление
Метаплазия Гиперплазия Гипертрофия Эозинофилы Нейтрофилы
Признаки воспаления ■ RSV □ RSV-UF □ Норма
Рис. 3. Патологические изменения в легких после инфекции респираторно-синцитиальным вирусом
А - изменения клеточного состава БАЛ. После окрашивания гематоксилином и эозином проведен дифференцированный подсчет клеток с помощью световой микроскопии. Представлены средние значения количества клеток ± стандартная ошибка. В каждой группе проанализировано 10 образцов БАЛ; Б - оценка уровня воспаления в ткани легких. Приготовлены гистологические препараты ткани легких с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином. Признаки воспаления идентифицировали с помощью световой микроскопии, а их выраженность оценивали полуколичественным методом в баллах: 0 - признак воспаления отсутствует, 1 - слабовыраженное, 2 - средневыраженное, 3 - тяжелое воспаление. Представлены медианные значения ± межквартильный размах. В каждой группе проанализировано по 10 образцов ткани легких.
х - статистически значимо отличается от группы ЕБ¥-и¥; # - статистически значимо отличается от группы «Норма». Для данных, представленных на рис. А, применяли непараметрический статистический анализ по Манну-Уитни, для полуколичественных данных, представленных на рис. Б, - непараметрический статистический анализ по Краскелу-Уоллису с медианным тестом. Отличия считались значимыми при р < 0,05.
0
3
2
#
1
ческих изменений в легких мышей (метаплазию и гиперплазию эпителия бронхов) после инфекции вирусом. В то же время у интактных мышей указанных признаков не фиксировалось. У некоторых животных (2 мыши из 10), получавших инактивированный РСВ, развивалась гиперплазия и метаплазия эпителия бронхов, а также наблюдалась перибронхиальная инфильтрация легких лимфоцитами, однако эти изменения не были статистически значимы (рис. 3Б).
Активация TM-иммунного ответа при РСВ-инфекции. Изучено изменение экспрессии маркерных генов Th1- и Th2-иммунного ответа в клетках БАЛ методом количественного ПЦР-анализа. В качестве Thl-маркеров были выбраны гены, кодирующие цито-кин ИФН-у (Ifng) и фактор транскрипции T-bet (Tbet). В качестве Th2-маркеров выбраны гены, кодирующие цитокин ИЛ-4 (Il4) и фактор транскрипции GATA3 (GATA3). Инфекция вирусом увеличивала экспрессию Thl-маркеров Ifng более чем в 3 раза, а Tbet - в 2 раза по сравнению с группой «Норма». В то же время экспрессия Th2-маркеров не изменялась при развитии инфекции (рис. 4А). Все это свидетельствует об активации вирусом иммунного ответа Thl-типа, что подтверждается рассчитанными значениями соотношения Ifng/Il4 и Tbet/GATA3, которые составили 3,5 и 1,9 соответственно (рис. 4Б).
Обсуждение
Моделирование патологического процесса, вызванного РСВ-инфекцией, осуществляется на широком спектре животных [18, 19]. Тем не менее для моделирования РСВ-инфекции мыши имеют ряд значительных преимуществ: во-первых, их использование экономически более целесообразно по сравнению с крупными животными; во-вторых, создано множество трансгенных линий грызунов, а также для исследований на них доступен широкий спектр коммерческих реагентов, включая моноклональные антитела, что позволяет изучать патогенез заболевания на молекулярном и клеточном уровнях.
Для заражения мышей в большинстве опубликованных работ используют три лабораторных штамма: A2, line 19 и long, однако в некоторых исследованиях животных инфицировали изолятами, полученными от пациентов. Недостатком применения клинических изо-лятов служит то, что они индуцируют у мышей различные признаки патологии, а инфекция некоторыми штаммами протекает практически бессимптомно. Так, в работе K.L. Stokes и соавт. для инфекции мышей применяли 6 клинических изолятов РСВ, однако лишь 2 штамма индуцировали выраженные проявления инфекции, такие как снижение массы тела, развитие гиперреактивности бронхов, а также гиперсекреция слизи. Однако лабораторный штамм А2 реплицировался в дыхательных путях животных интенсивнее изолятов. Кроме того, репликация клинических изоля-тов преимущественно протекала в эпителии бронхиол, в то время как лабораторный штамм А2 обнаруживался
0
Кр
э
о
Ifny
114 T-bet GATA3
RSV ■ Норма
#
1=
«
T-bet/GATA3
RSV
IFNy/IL-4 Норма
Рис. 4. Изменение экспрессии цитокинов и транскрипционных факторов при РСВ-инфекции
А - уровни экспрессии генов цитокинов Ifny и Il4 и транскрипционных факторов Tbet и GATA3 в клетках БАЛ. На рисунке представлена экспрессия генов относительно группы «Норма». Уровень экспрессии генов в группе «Норма» был принят за единицу. Представлены средние значения относительной экспрессии генов ± стандартная ошибка. В каждой группе изучено 10 образцов БАЛ; Б - изменение баланса Th1/Th2-иммунного ответа. Представлено соотношение уровня экспрессии Thl-цитокина (Ifny) к П2-цитокину (Il4) и соотношение уровня экспрессии фактора транскрипции Thl-типа (Tbet) к П2-типу (GATA3) в образцах БАЛ. Представлены средние значения ± стандартная ошибка. В каждой группе изучено
10 образов БАЛ
х - статистически значимо отличается от группы RSV-UV; # - статистически значимо отличается от группы «Норма». Применялся непараметрический статистический анализ по Манну-Уитни. Отличия считались значимыми при р < 0,05.
в эпителии альвеол [26], что соответствует естественной локализации вируса в дыхательных путях человека [27]. Поэтому в данном исследовании для воссоздания признаков патологии использовали мышей линии BALB/c, а в качестве патогена РСВ штамм А2.
Несмотря на то что штамм А2 интенсивней реплицируется в респираторном тракте мышей, по сравнению с клиническими изолятами и другими популярными лабораторными штаммами (line 19 и long), его использование для создания РСВ-инфекции у мышей сопряжено с рядом недостатков. Многие авторы [26, 28, 29] указывают, что штамм А2 не вызывает у мышей таких клинически значимых проявлений патологии, как гиперпродукция слизи и бронхиальная гиперреак-
4
#
З
2
1
0
5
#
4
З
2
1
0
тивность. В проведенном исследовании мы инфицировали мышей высокой дозой РСВ А2, которая составила 5-106 ТЦД50/мышь, что в 10-100 раз больше, чем доза вируса, использованная в большинстве других аналогичных исследований [26, 28, 29]. Использование такой дозы вируса позволило воссоздать эти важные признаки патологии; наблюдался статистически значимый рост гиперреактивности бронхов, в среднем на 30% (см. рис. 1 Б), а также у подавляющего большинства животных (9 из 10 в группе) выявлялась гиперплазия и метаплазия эпителия бронхов (см. рис. 3Б), что свидетельствует о повышенной продукции слизи бокаловидными клетками.
Статистически значимое падение массы тела, достигающее пика на 4-5-е сутки после инфекции (рис. 1 А), указывает на развитие продуктивной инфекции у животных, так как именно на этот период приходится пик репликации РСВ [30, 31]. Чаще всего для количественной детекции РСВ в легких используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени [22]. Кроме того, подсчитывают количество бляшек в образцах БАЛ и гомогенатах легких путем титрования на монослое клеток и окрашивания белков РСВ антителами [23], а также применяют полуколичественный иммуногистохимический метод окрашивания антигенов вируса в срезах цельного легкого [26]. В проведенном исследовании мы оценивали вирусную нагрузку в легких на 6-е сутки после инфекции двумя методами. Методом количественной ПЦР в гомогена-тах легких идентифицировано значительное количество копий РНК вируса. В группе, получавшей инактиви-рованный РСВ, также обнаруживалась геномная РНК вируса. Ее наличие объясняется особенностью метода детекции, поскольку количественный ПЦР-анализ детектирует всю целевую РНК, выделенную, как из жизнеспособного, так и из инактивированного вируса, локализующегося в легких мышей. Учитывая, что мыши 1-й и 2-й групп были заражены одинаковой дозой жизнеспособного и инактивированного РСВ, увеличенное в 6,5 раз количество копий РНК вируса в легких мышей 1-й группы (см. рис. 2А) свидетельствует о способности вируса активно реплицироваться в дыхательных путях. Дополнительно, в отличие от других коллективов авторов, в данном исследовании мы выявили жизнеспособный вирус в легких мышей методом титрования, для чего образцы БАЛ наносили на монослой чувствительных клеток МА-104 с последующей детекцией синцития. Стоит также отметить, что у 2 из 10 мышей, получавших инактивированный РСВ, также выявлены единичные синцитии (см. рис. 2Б). По всей видимости, экспозиции РСВ в течение 40 мин под ультрафиолетовым излучением недостаточно для полной инактивации вируса.
Стоит отдельно упомянуть, что в данном исследовании для достижения дозы 5 • 106 ТЦД50/мышь вирус предварительно концентрировали и очищали от куль-туральной среды в градиенте плотности сахарозы. Процедура очистки РСВ перед его введением мышам
в подавляющем большинстве исследований других научных коллективов не проводилась [26, 28, 31-33]. Введение животным неочищенного вируса может вызвать нежелательные реакции, в том числе со стороны иммунной системы, на невирусные компоненты, например на факторы, выделяемые культурой клеток, на которой осуществлялось наращивание вируса, или на компоненты питательной среды. Такие реакции маскируют истинный ответ модельного животного на вирусную инфекцию и искажают результаты исследований [18, 19].
У человека РСВ-инфекция приводит к инфильтрации ткани легких макрофагами, нейтрофилами и лимфоцитами [27]. В наших экспериментах мы также наблюдали значительные количества лимфоцитов и макрофагов в легких, в то время как нейтрофилы практически не обнаруживались (см. рис. 3А, Б). Известно, что рекрутирование нейтрофилов в очаг воспаления происходит в ответ на бактериальную инвазию, которая у человека может наблюдаться как осложнение после перенесенной РСВ-инфекции [34]. По всей видимости в нашем краткосрочном эксперименте, длящемся 6 сут, бактериальная инфекция не успевала развиваться, что объясняет отсутствие нейтрофилов в легких.
РСВ-инфекция у человека вызывает экспрессию провоспалительных цитокинов в легких, что приводит к избыточному воспалительному сигналу. В частности, РСВ активирует продукцию ФНОа, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13, ИЛ-17А, ИЛ-17Б, ИФН-у и др. (см. обзор [17]). При этом интересно отметить, что ряд исследователей выявил одновременную активацию у человека образование как Th1- (ИФН-у), так и Т^-цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13) в ответ на РСВ-инфекцию [35], несмотря на то что ИФН-у является антагонистом экспрессии ИЛ-4, и наоборот [36]. Однако последние исследования утверждают, что РСВ-инфекция активирует преимущественно ТЫ-иммунный ответ [37]. В проведенном исследовании мы также выявили значительную активацию Th1-, а не Th2-иммунного ответа после инфекции мышей вирусом, что выражалось в повышении экспрессии соответствующих генов Ifng и Tbet (рис. 4А, Б). Также мы обнаружили активацию экспрессии гена провоспалительного цитокина ФНОа (Tnfa) в клетках БАЛ в 3 раза (данные не представлены), что согласуется с клинической картиной, наблюдаемой у человека [38, 39]. Однако мы не детектировали активации экспрессии генов Il5, Il13, Il17a, Il17f в клетках БАЛ (данные не представлены). Цито-кин ИЛ-5 обеспечивает созревание и рекрутирование в очаг воспаления эозинофилов [40], а цитокины ИЛ-17А и ИЛ-17Б вовлечены в процесс нейтрофил-опосредо-ванного воспаления [41]. Оба типа клеток (эозинофилы и нейтрофилы) не обнаруживались нами ни в образцах БАЛ, ни в ткани легких (см. рис. 3А, Б), что может объяснять отсутствие активации экспрессии генов Il5, Il13, Il17a, Il17f.
В исследовании Lukacs с коллегами было показано, что РСВ штамм А2, в отличие от других лабораторных штаммов (long и line 19), не приводил к развитию ги-
персекреции слизи и гиперреактивности бронхов, что авторы связывают с неспособностью штамма А2 активировать продукцию ИЛ-13, вовлеченного в процесс секреции слизи бронхиальным эпителием [29]. Тем не менее в нашем исследовании штамм А2 индуцировал сопротивляемость бронхов (см. рис. 1Б) и гиперплазию бокаловидных клеток эпителия респираторного тракта (см. рис. 3А), при этом экспрессии ИЛ-13 нами не зафиксировано. Развитие гиперплазии бокаловидных клеток (основных продуцентов слизи), наблюдаемое в данном исследовании, можно объяснить эффектом ФНОа, экспрессия которого была увеличена на фоне РСВ-инфекции в 3 раза. Этот цитокин, как и ИЛ-13, способен активировать секрецию слизи эпителием бронхов [42], а повышенное слизеобразование является одним из факторов, приводящим к нарушению функции дыхания за счет механического затруднения прохождению потока воздуха в дыхательных путях [31].
■ Литература
1. Shi T., Denouel A., Tietjen A.K., Campbell I. et al. Global disease burden estimates of respiratory syncytial virus-associated acute respiratory infection in older adults in 2015: a systematic review and metaanalysis. J. Infect. Dis. 2019. doi: 10.1093/infdis/jiz059.
2. Аллахвердиева Л.И., Гумбатова УМ. Иммунные нарушения при вирусиндуцированной бронхиальной астме у детей. Иммунология. 2013; 34 (4): 217-20.
3. Troeger C., Blacker B., Khalil I.A., Rao P.C. et al. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect. Dis. 2018; 18 (11): 1191-210. doi: 10.1016/S1473-3099(18)30310-4.
4. Geoghegan S., Erviti A., Caballero M.T., Vallone F. et al. Mortality due to respiratory syncytial virus burden and risk factors. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2017; 195 (1): 96-103. doi: 10.1164/ rccm.201603-06580C.
5. Halasa N.B., Williams J.V., Wilson G.J., Walsh W.F. et al. Medical and economic impact of a respiratory syncytial virus outbreak in a neonatal intensive care unit. Pediatr. Infect. Dis. J. 2005; 24 (12): 1040-4. doi: 10.1097/01.inf.0000190027.59795.ac.
6. Muralidharan A., Li C., Wang L., Li X. Immunopathogenesis associated with formaldehyde-inactivated RSV vaccine in preclinical and clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 2017; 16 (4): 351-60. doi: 10.1080/14760584.2017.1260452.
7. Janai H.K., Marks M.I., Zaleska M., Stutman H.R. Ribavirin: adverse drug reactions, 1986 to 1988. Pediatr. Infect. Dis. J. 1990; 9 (3): 209-11. doi: 10.1097/00006454-199003000-00013.
8. Wang D., Cummins C., Bayliss S., Sandercock J. et al. Immuno-prophylaxis against respiratory syncytial virus (RSV) with palivizumab in children: A systematic review and economic evaluation. Health Tech-nol. Assess. (Rockv.). 2008; 12 (36): 1-86. doi: 10.3310/hta12360.
9. Хаитов М.Р., Литвин Л.С., Шиловский И.П., Башкатова Ю.Н. и др. Интерференция РНК. Новые подходы к разработке противовирусных препаратов. Иммунология. 2010; 31 (2): 69-76.
10. Osminkina L.A., Timoshenko V.Y., Shilovsky I.P., Kornilaeva G.V. et al. Porous silicon nanoparticles as scavengers of hazardous viruses. J. Nanoparticle Res. 2014; 16 (6): 2430. doi: 10.1007/s11051-014-2430-2.
11. Шиловский И.П., Андреев С.М., Кожихова К.В., Никольский А.А. и др. Перспективы использования пептидов против ре-спираторно-синцитиального вируса. Молекул. биол. 2019; 53 (4): 484-500. doi: 10.1134/s0026893319040125.
12. Пинегин Б.В., Пащенков М.В. Иммуностимуляторы мура-милпептидной природы в лечении и профилактике инфекционно-воспалительных процессов. Иммунология. 2019; 40 (3): 65-71.
13. Будихина А.С. Роль антимикробных пептидов в патологии заболеваний верхних дыхательных путей. Иммунология. 2017; 38 (4): 234-38. doi: 10.18821/0206-4952-2017-38-4-234-238.
14. Кривицкая В.З., Александрова Н.А., Орлов А.В., Походзей И.В. Реакция иммуноглобулина класса А на респираторно-синцити-
Заключение
Таким образом, в данном исследовании описано создание экспериментальной модели РСВ-инфекции у мышей. Использование концентрированного и очищенного вируса позволило воссоздать у животных основные проявления патологии человека: гиперреактивность бронхов, структурные нарушения бронхиального эпителия, а также воспаление в ткани легких. РСВ-инфекция у мышей активирует преимущественно ТЫ-иммунный ответ, что свидетельствует о соответствии созданной модели данным клинических наблюдений у человека. Кроме того, мы показали способность РСВ реплицироваться в дыхательных путях мышей и предложили методику количественной оценки содержания живого вируса в дыхательных путях экспериментальных животных. Созданная модель может быть полезной как для тестирования новых анти-РСВ-препаратов, так и для углубленного исследования патогенеза РСВ-инфекции.
альную вирусную инфекцию у детей и взрослых с различными формами острого и хронического бронхита. Иммунология. 1999; 2: 51-5.
15. Griffiths C., Drews S.J., Marchant D.J. Respiratory syncytial virus: Infection, detection, and new options for prevention and treatment. Clin. Microbiol. Rev. 2017; 30 (1): 277-319. doi: 10.1128/CMR. 00010-16.
16. Плехова Н.Г., Кодрашова Н.М. Гельцер Б.И., Котельников В.Н. Клеточно-молекулярные факторы врожденной защиты и их роль в патогенезе пневмонии. Иммунология. 2017; 38 (2): 124-9.
17. Russell C.D., Unger S.A., Walton M., Schwarze J. The human immune response to respiratory syncytial virus infection. Clin. Micro-biol. Rev. 2017; 30 (2): 481-502. doi: 10.1128/CMR.00090-16.
18. Taylor G. Animal models of respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 2017; 35 (3): 469-80. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.11.054.
19. Altamirano-Lagos M.J., Díaz F.E., Mansilla M.A., Rivera-Pérezet D. et al. Current animal models for understanding the pathology caused by the respiratory syncytial virus. Front. Microbiol. 2019; 10: 1-18. doi: 10.3389/fmicb.2019.00873.
20. Zschaler J., Schlorke D., Arnhold J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit. Rev. Immunol. 2014; 34 (5): 433-54.
21. Mejías A., Chávez-Bueno S., Ríos A.M., Aten M.F. et al. Comparative effects of two neutralizing anti-respiratory syncytial virus (RSV) monoclonal antibodies in the RSV murine model: time versus potency. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49 (11): 4700-7. doi: 10.1128/AAC.49.11.4700-4707.2005.
22. Khaitov M.R., Shilovskiy I.P., Nikonova A.A., Shershakova N.N. et al. Small interfering RNAs targeted to interleukin-4 and respiratory syncytial virus reduce airway inflammation in a mouse model of virus-induced asthma exacerbation. Hum. Gene Ther. 2014; 25 (7): 642-50. doi: 10.1089/hum.2013.142.
23. Bitko V., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S. Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA. Nat. Med. 2005; 11 (1): 50-5. doi: 10.1038/nm1164.
24. Ueba O. Respiratory syncytial virus concentration and purification of the infectious virus. Acta Med. Okayama. 1978; 32 (4): 265-72.
25. Ennis D.P., Cassidy J.P., Mahon B.P. Acellular pertussis vaccine protects against exacerbation of allergic asthma due to Bordetella pertussis in a murine model. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005; 12 (3): 409-17. doi: 10.1128/CDLI.12.3.409-417.2005.
26. Stokes K.L., Chi M.H., Sakamoto K., Newcomb D.C. et al. Differential pathogenesis of respiratory syncytial virus clinical isolates in BALB/C mice. J. Virol. 2011; 85 (12): 5782-93. doi: 10.1128/jvi. 01693-10.
27. Johnson J.E., Gonzales R.A., Olson S.J., Wright P.F. The histo-pathology of fatal untreated human respiratory syncytial virus infection. Mod. Pathol. 2007; 20 (1): 108-19. doi: 10.1038/modpathol.3800725.
28. Hashimoto K, Durbin JE, Zhou W, Collins R.D. et al. Respiratory syncytial virus infection in the absence of STAT1 results in airway
dysfunction, airway mucus, and augmented IL-17 levels. J. Allergy Clin. Immunol. 2005; 116 (3): 550-7. doi: 10.1016/j.jaci.2005.03.051.
29. Lukacs N.W., Moore M.L., Rudd B.D., Berlin A.A. et al. Differential immune responses and pulmonary pathophysiology are induced by two different strains of respiratory syncytial virus. Am. J. Pathol. 2006; 169 (3): 977-86. doi: 10.2353/ajpath.2006.051055.
30. Rameix-Welti M.A., Le Goffic R., Hervé P.L., Sourimant J. et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nat. Commun. 2014; 5: 1-10. doi: 10.1038/ncomms 6104.
31. Jafri H.S., Châvez-Bueno S., Mejias A., Gomez A.M. et al. Respiratory syncytial virus induces pneumonia, cytokine response, airway obstruction, and chronic inflammatory infiltrates associated with long-term airway hyperresponsiveness in mice. J. Infect. Dis. 2004; 189 (10): 1856-65. doi: 10.1086/386372.
32. Zou Y., Huang H., Xu J. Primary respiratory syncytial virus infection in mice. Chin. J. Tuberc. Respir. Dis. 2001; 24 (8): 484-6.
33. Moore M.L., Chi M.H., Luongo C., Lukacs N.W. et al. A chimeric A2 strain of respiratory syncytial virus (RSV) with the fusion protein of RSV strain line 19 exhibits enhanced viral load, mucus, and airway dysfunction. J. Virol. 2009; 83 (9): 4185-94. doi: 10.1128/jvi.01853-08.
34. Smith P.K., Wang S.Z., Dowling K.D., Forsyth K.D. Leucocyte populations in respiratory syncytial virus-induced bronchiolitis. J. Paediatr. Child Health. 2001; 37 (2): 146-51. doi: 10.1046/j.1440-1754.2001.00618.x.
35. Tripp R.A., Moore D., Barskey A. 4th, Jones L. et al. Peripheral blood mononuclear cells from infants hospitalized because of respiratory syncytial virus infection express T helper-1 and T helper-2 cyto-
■ References
1. Shi T., Denouel A., Tietjen A.K., Campbell I., et al. Global disease burden estimates of respiratory syncytial virus-associated acute respiratory infection in older adults in 2015: a systematic review and meta-analysis. J. Infect. Dis. 2019. doi: 10.1093/infdis/jiz059.
2. Allakhverdiyeva L.I., Humbatova U.M. Immune disturbances in children with virus-induced bronchial asthma. Immunologiya. 2013; 34 (4): 217-20. (in Russian)
3. Troeger C., Blacker B., Khalil I.A., Rao P.C., et al. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect. Dis. 2018; 18 (11): 1191-210. doi: 10.1016/S1473-3099(18) 30310-4.
4. Geoghegan S., Erviti A., Caballero M.T., Vallone F., et al. Mortality due to respiratory syncytial virus burden and risk factors. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2017; 195 (1): 96-103. doi: 10.1164/ rccm.201603-06580C.
5. Halasa N.B., Williams J.V., Wilson G.J., Walsh W.F., et al. Medical and economic impact of a respiratory syncytial virus outbreak in a neonatal intensive care unit. Pediatr. Infect. Dis. J. 2005; 24 (12): 10404. doi: 10.1097/01.inf.0000190027.59795.ac.
6. Muralidharan A., Li C., Wang L., Li X. Immunopathogenesis associated with formaldehyde-inactivated RSV vaccine in preclinical and clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 2017; 16 (4): 351-60. doi: 10.1080/14760584.2017.1260452.
7. Janai H.K., Marks M.I., Zaleska M., Stutman H.R. Ribavirin: adverse drug reactions, 1986 to 1988. Pediatr. Infect. Dis. J. 1990; 9 (3): 209-11. doi: 10.1097/00006454-199003000-00013.
8. Wang D., Cummins C., Bayliss S., Sandercock J., et al. Immuno-prophylaxis against respiratory syncytial virus (RSV) with palivizumab in children: A systematic review and economic evaluation. Health Tech-nol. Assess. (Rockv.). 2008; 12 (36): 1-86. doi: 10.3310/hta12360.
9. Khaitov M.R., Litvin L.S., Shilovsky I.P., Bashkatova Y.N., et al. RNA interference. New approaches to the development of antiviral agents. Immunologiya. 2010; 31 (2): 69-76. (in Russian)
10. Osminkina L.A., Timoshenko V.Y., Shilovsky I.P., Kornilaeva G.V., et al. Porous silicon nanoparticles as scavengers of hazardous viruses. J. Nanoparticle Res. 2014; 16 (6): 2430. doi: 10.1007/s11051-014-2430-2.
11. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V. Nikolskii A.A., et al. Prospects for the use of peptides against respiratory syncytial virus. Molekulyarnaya biologiya. 2019; 53 (4): 484-500. doi: 10.1134/ s0026893319040125. (in Russian)
12. Pinegin B.V., Pashchenkov M.V. Immunostimulators of mur-amylpeptide nature in the treatment and prevention of infectious-inflammatory processes. Immunologiya. 2019; 40 (3): 65-71. (in Russian)
kines and CC chemokine messenger RNA. J. Infect. Dis. 2002; 185 (10): 1388-94. doi: 10.1086/340505.
36. Elser B., Lohoff M., Kock S., Giaisi M. et al. IFN-y represses IL-4 expression via IRF-1 and IRF-2. Immunity. 2002; 17 (6): 703-12. doi: 10.1016/S1074-7613(02)00471-5.
37. Geevarghese B., Weinberg A. Cell-mediated immune responses to respiratory syncytial virus infection: magnitude, kinetics, and correlates with morbidity and age. Hum. Vaccines Immunother. 2014; 10 (4): 1047-56. doi: 10.4161/hv.27908.
38. Rosenberg H.F., Domachowske J.B. Inflammatory responses to respiratory syncytial virus (RSV) infection and the development of immunomodulatory pharmacotherapeutics. Curr. Med. Chem. 2012; 19 (10): 1424-31.
39. Puthothu B., Bierbaum S., Kopp M.V., Forster J. et al. Association of TNF-a with severe respiratory syncytial virus infection and bronchial asthma. Pediatr. Allergy Immunol. 2009; 20 (2): 157-63. doi: 10.1111/j.1399-3038.2008.00751.x.
40. Roufosse F. Targeting the interleukin-5 pathway for treatment of eosinophilic conditions other than asthma. Front. Med. 2018; 5: 1-27. doi: 10.3389/fmed.2018.00049.
41. Monin L., Gaffen S.L. Interleukin 17 family cytokines: Signaling mechanisms, biological activities, and therapeutic implications. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2018; 10 (4): 1-19. doi: 10.1101/csh-perspect.a028522.
42. Lora J.M., Zhang D.M., Liao S.M., Burwell T. et al. Tumor necrosis factor-a triggers mucus production in airway epithelium through an IkB kinase ß-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 2005; 280 (43): 36 510-7. doi: 10.1074/jbc.M507977200.
13. Budikhina A.S. The role of antimicrobial peptides in the pathology of diseases of the upper respiratory tract. Immunologiya. 2017; 38 (4): 234-8. doi: 10.18821/0206-4952-2017-38-4-234-238. (in Russian)
14. Krivitskaya V.Z., Aleksandrova N.A., Orlov A.V., Pokhodzey I.V. IGA response to respiratory-syncytial virus infection in children and adults with various forms of acute and chronic bronchitis. Immunologiya. 1999; 2: 51-5. (in Russian)
15. Griffiths C., Drews S.J., Marchant D.J. Respiratory syncytial virus: Infection, detection, and new options for prevention and treatment. Clin. Microbiol. Rev. 2017; 30 (1): 277-319. doi: 10.1128/CMR.00010-16.
16. Plekhova N.G., Kodrashova N.M., Geltser B.I., Kotelnikov V.N. Cellular and molecular factors of innate defense and its role in the pathogenesis of pneumonia. Immunologiya. 2017; 38 (2): 124-9. (in Russian)
17. Russell C.D., Unger S.A., Walton M., Schwarze J. The human immune response to respiratory syncytial virus infection. Clin. Micro-biol. Rev. 2017; 30 (2): 481-502. doi: 10.1128/CMR.00090-16.
18. Taylor G. Animal models of respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 2017; 35 (3): 469-80. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.11.054.
19. Altamirano-Lagos M.J., Díaz F.E., Mansilla M.A., Rivera-Pérezet D., et al. Current animal models for understanding the pathology caused by the respiratory syncytial virus. Front. Microbiol. 2019; 10: 1-18. doi: 10.3389/fmicb.2019.00873.
20. Zschaler J., Schlorke D., Arnhold J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit. Rev. Immunol. 2014; 34 (5): 433-54.
21. Mejías A., Chávez-Bueno S., Ríos A.M., Aten M.F., et al. Comparative effects of two neutralizing anti-respiratory syncytial virus (RSV) monoclonal antibodies in the RSV murine model: time versus potency. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49 (11): 4700-7. doi: 10.1128/AAC.49.11.4700-4707.2005.
22. Khaitov M.R., Shilovskiy I.P., NikonovaA.A., Shershakova N.N., et al. Small interfering RNAs targeted to interleukin-4 and respiratory syncytial virus reduce airway inflammation in a mouse model of virus-induced asthma exacerbation. Hum. Gene Ther. 2014; 25 (7): 642-50. doi: 10.1089/hum.2013.142.
23. Bitko V., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S. Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA. Nat. Med. 2005; 11 (1): 50-5. doi: 10.1038/nm1164.
24. Ueba O. Respiratory syncytial virus concentration and purification of the infectious virus. Acta Med. Okayama. 1978; 32 (4): 265-72.
25. Ennis D.P., Cassidy J.P., Mahon B.P. Acellular pertussis vaccine protects against exacerbation of allergic asthma due to Bordetella pertussis in a murine model. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005; 12 (3): 409-17. doi: 10.1128/CDLI.12.3.409-417.2005.
26. Stokes K.L., Chi M.H., Sakamoto K., Newcomb D.C., et al. Differential pathogenesis of respiratory syncytial virus clinical isolates in BALB/C mice. J. Virol. 2011; 85 (12): 5782-93. doi: 10.1128/ jvi.01693-10.
27. Johnson J.E., Gonzales R.A., Olson S.J., Wright P.F. The histopathology of fatal untreated human respiratory syncytial virus infection. Mod. Pathol. 2007; 20 (1): 108-19. doi: 10.1038/mod-pathol.3800725.
28. Hashimoto K, Durbin JE, Zhou W, Collins R.D., et al. Respiratory syncytial virus infection in the absence of STAT1 results in airway dysfunction, airway mucus, and augmented IL-17 levels. J. Allergy Clin. Immunol. 2005; 116 (3): 550-7. doi: 10.1016/j.jaci. 2005.03.051.
29. Lukacs N.W., Moore M.L., Rudd B.D., Berlin A.A., et al. Differential immune responses and pulmonary pathophysiology are induced by two different strains of respiratory syncytial virus. Am. J. Pathol. 2006; 169 (3): 977-86. doi: 10.2353/ajpath.2006. 051055.
30. Rameix-Welti M.A., Le Goffic R., Hervé P.L., Sourimant J., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nat. Commun. 2014; 5: 1-10. doi: 10.1038/ncom-ms6104.
31. Jafri H.S., Châvez-Bueno S., Mejias A., Gomez A.M., et al. Respiratory syncytial virus induces pneumonia, cytokine response, airway obstruction, and chronic inflammatory infiltrates associated with long-term airway hyperresponsiveness in mice. J. Infect. Dis. 2004; 189 (10): 1856-65. doi: 10.1086/386372.
32. Zou Y., Huang H., Xu J. Primary respiratory syncytial virus infection in mice. Chin. J. Tuberc. Respir. Dis. 2001; 24 (8): 484-6.
33. Moore M.L., Chi M.H., Luongo C., Lukacs N.W., et al. A chi-meric A2 strain of respiratory syncytial virus (RSV) with the fusion protein of RSV strain line 19 exhibits enhanced viral load, mucus, and airway dysfunction. J. Virol. 2009; 83 (9): 4185-94. doi: 10.1128/ jvi.01853-08.
34. Smith P.K., Wang S.Z., Dowling K.D., Forsyth K.D. Leucocyte populations in respiratory syncytial virus-induced bronchiolitis. J. Paediatr. Child Health. 2001; 37 (2): 146-51. doi: 10.1046/j.1440-1754.2001.00618.x.
35. Tripp R.A., Moore D., Barskey A. 4th, Jones L., et al. Peripheral blood mononuclear cells from infants hospitalized because of respiratory syncytial virus infection express T helper-1 and T helper-2 cytokines and CC chemokine messenger RNA. J. Infect. Dis. 2002; 185 (10): 1388-94. doi: 10.1086/340505.
36. Elser B., Lohoff M., Kock S., Giaisi M., et al. IFN-y represses IL-4 expression via IRF-1 and IRF-2. Immunity. 2002; 17 (6): 703-12. doi: 10.1016/S1074-7613(02)00471-5.
37. Geevarghese B., Weinberg A. Cell-mediated immune responses to respiratory syncytial virus infection: magnitude, kinetics, and correlates with morbidity and age. Hum. Vaccines Immunother. 2014; 10 (4): 1047-56. doi: 10.4161/hv.27908.
38. Rosenberg H.F., Domachowske J.B. Inflammatory responses to respiratory syncytial virus (RSV) infection and the development of immunomodulatory pharmacotherapeutics. Curr. Med. Chem. 2012; 19 (10): 1424-31.
39. Puthothu B., Bierbaum S., Kopp M.V., Forster J., et al. Association of TNF-a with severe respiratory syncytial virus infection and bronchial asthma. Pediatr. Allergy Immunol. 2009; 20 (2): 157-63. doi: 10.1111/j.1399-3038.2008.00751.x.
40. Roufosse F. Targeting the interleukin-5 pathway for treatment of eosinophilic conditions other than asthma. Front. Med. 2018; 5: 1-27. doi: 10.3389/fmed.2018.00049.
41. Monin L., Gaffen S.L. Interleukin 17 family cytokines: Signaling mechanisms, biological activities, and therapeutic implications. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2018; 10 (4): 1-19. doi: 10.1101/csh-perspect.a028522.
42. Lora J.M., Zhang D.M., Liao S.M., Burwell T., et al. Tumor necrosis factor-a triggers mucus production in airway epithelium through an IkB kinase ß-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 2005; 280 (43): 36 510-7. doi: 10.1074/jbc.M507977200.
