ВЛИЯНИЕ HINFI-ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ГИПОФИЗАРНОГО ФАКТОРА РОСТА BPIT-1 НА ПРИЗНАКИ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ГОЛШТИНСКОЙ И БЕЛОРУССКОЙ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОД Текст научной статьи по специальности «Животноводство и молочное дело»

УДК577.21:636.23.082.2

М.Е. Михайлова, Е.В. Белая

ВЛИЯНИЕ HinFI-ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ГИПОФИЗАРНОГО ФАКТОРА РОСТА bPit-1 НА ПРИЗНАКИ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ГОЛШТИНСКОЙ И БЕЛОРУССКОЙ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОД

ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, ул. Академическая, 27

Введение

В настоящее время в большинстве стран Европы, где ведется интенсивная селекционная работа, широкое распространение получили современные биотехнологии, способные повысить точность и эффективность традиционной селекции. К ним относится маркер-сопутствующая селекция, которая сочетает информацию о полиморфных вариантах генов-кандидатов с данными об их фенотипическом проявлении. Поиск генов-кандидатов ведется среди генов со-матотропинового каскада, которые регулируют не только ростовые процессы, но и лактацию у млекопитающих, в частности, крупного рогатого скота. Интенсивность экспрессии данных генов находится под контролем клеток гипоталами-ческой области, выделяющих стимулирующий рилизинг-фактор - соматолиберин (РШ). Поэтому любые мутации, изменяющие экспрессию-гена Pit-1, могут влиять на работу всего каскада и представляют собой интерес для возможного применения в МАБ-селекции. В Беларуси исследования в этом направлении находятся на начальном этапе развития, но, несомненно, имеют большое практическое значение.

Нами был исследован bPit-1-HinFI-поли-морфизм, обусловленный О^Л заменой в шестом экзоне [1, 2]. Данный полиморфизм

не сопровождается изменением аминокислотной последовательности белка и, тем не менее, является общепринятым молекулярным маркером продуктивности у молочных пород крупного рогатого скота. Данные об ассоциации bPit-1-HinFI-полиморфизма с такими признаками молочной продуктивности, как общий удой за 305 суток лактации, жирномолочность и белковомолочность у коров голштинской и белорусской черно-пестрой пород в Беларуси получены нами впервые.

Объект исследования - популяции крупного рогатого скота голштинской и белорусской черно-пестрой пород. Интерес к голштинской породе обусловлен тем, что ее представители являются мировыми лидерами молочной продуктивности и активно используются белорусскими селекционерами для повышения продуктивности пород, разводимых на территории Беларуси. Представители белорусской черно-пестрой породы, несмотря на более низкий уровень молочной продуктивности, адаптированы к условиям климата, кормовой базе и обладают устойчивым иммунитетом к заболеваниям, распространенным на территории Республики Беларусь.

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили образцы ДНК, выделенные из проб крови коров, предоставленных животноводческими предприятиями Минской области. Источником данных о продуктивности являлись племенные карты, заполняемые зоотехниками-селекционерами для каждого животного.

Статистическая оценка проведена с использованием стандартного пакета программ «STATISTICA 6.0» (StatSoft, Ink. 1994-2001).

Так как число выявленных животных с редкими генотипами не позволяет определить характер распределения исследуемых параметров в этих группах, то оценка количествен-

ных признаков осуществлялась с использованием методов непараметрической статистики. Данные представлены в виде Ме (25%; 75%), где Ме - медиана признака - мера центральной тенденции, характеризующая срединное положение признака в вариационном ряду. Интерквартильный размах признака описывается с помощью 25% и 75% процентилей -(верхняя граница 1-го и нижняя граница 4-го квартилей) [3].

Оценка влияния генотипа на исследуемые признаки проводилась путем сравнения показателей продуктивности в группе животных с определенным генотипом и выборкой в целом. Статистический анализ результатов осуществлялся с помощью серийного критерия г Вальда-Вольфовица. Данный критерий является чувствительным к любым различиям распределения в выборках и применим при оценке малого числа наблюдений, что позволяет проводить анализ продуктивности животных с редкими генотипами. Проверяется Н0 гипотеза о том, что сравниваемые группы принадлежат к одной генеральной совокупности. Если нулевая гипотеза отклоняется (р<0,05), то следует принять альтернативную гипотезу о существовании различий [4].

Полученные данные во всех случаях рассматривались как статистически значимые при р<0,05.

Определение генотипа исследуемых осо-

бей осуществлялось методом ПЦР-ПДРФ (по-лимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов).

Условия ПЦР следующие: - 94 °С - 1 мин; (95 °С - 45 сек; 56 °С -1 мин; 72 °С -2 мин) х 35 циклов; 72 °С -10 мин [5]. Длина амплифици-руемого фрагмента составляет 451 п.н. Прай-меры для амплификации имеют следующие последовательности: ЪРИ-1-Н\п¥1-¥: 5'-ааасса1са1с1сссйей-3' ЪР^-1-НтЕ1-К: 5'-аа1§1асаа1§1§ссйй§а§-3' Оценка результатов ПЦР проводилась с помощью рестриктазы Н1пИ, разрезающей ам-плифицируемый фрагмент в случае присутствия нуклеотида А (такой аллель обозначен как ЪР^-1-НтЕР). Разделение продуктов рестрикции проводилось методом электрофореза в 2% агарозном геле. Визуализация продуктов рестрикции осуществлялась путем окрашивания бромидом этидия. У животных с генотипом ЪР/7-1-НтЕ1ЛЛ на электрофореграмме наблюдался один фрагмент длиной 451 п.н. У животных с генотипом ЪР^-1-НтЕ1ВВ наблюдаемых фрагментов было два: 244 и 207 п.н. Гетерозиготные генотипы ЪРН-1-Н:т¥1ЛВ на электрофореграмме визуализировались как полосы, характерные для обоих полиморфных вариантов гена ЪРИ-1: 451, 244 и 207 п.н. На рисунке 1 приведена электрофореграмма продуктов рестрикции наблюдаемых при обработке амплификатов рестриктазой.

Рис. 1. Электрофореграмма результатов ДНК-типирования bPit-1-HinFI -полиморфизма в 2% агарозном геле Условные обозначения: 1 - маркер 50 br DNA Ladder (Fermentas); 2 - продукт амплификации; 3, 6 - генотип bPit-l-HinFI BB; 4, 7 - генотип bPit-l-HinFI AB; 5- генотип bPit-1-HinFI AA

Результаты и обсуждение

В ходе эксперимента проведено ДНК- Исследование влияния генотипа по по-

типирование 109 особей голштинской и 302 осо- лиморфизму НтИ1 гена bPit на общую

бей черно-пестрой породы. Выявлены животные продуктивность молока за лактацию по-

с генотипами ЬРи-1—Нт£1ЛА, ЬР/'^-КпИ^ и казало, что у коров обеих пород предпо-

ЪР/7-1-НтИ1ВВ. Аллель ЪРН-1-Н\пИ1Л в обеих чтительным является аллель ЪРи-1-НпИ1В

выборках является более редким. (рис. 2а, б).

11500 11000 10500 10000 9500 9000 8500 8000

Удой за 305 суток лактации (л)

____9845 I _|— _

9463 Г \ 9488 „„„I ___9309 _5__Г _9328 _

ИН

ЬИ- 1- ья- 1- ЬИ- 1- Полная HinFIАА Н/^МВ HinFIВВ выборка

□ 25%

□ Ме

□ 75%

2 а

Удой за 305 суток лактации (л)

9800 9600 9400 9200 9000 8800 8600 8400

8200 8000

9533

9540

-847

,^830|~|

-887'

8765 _|— _|—

□ 25%

□ Ме

□ 75%

ЬИЛ-1-НтНАА

ЬРП-1- ЬРП-1-НШАВ НтНВВ

2 б

Рис. 2. Показатели общей молочной продуктивности у коров с различными генотипами: 2а-голштинская порода; 2б-черно-пестрая порода

9522

10925

10408

8955

8889

У коров голштинской породы наблюдается возрастание значения медианы и интерквар-тильного размаха: 9463 (9118; 10408), 9845 (9309; 10795) и 10255 (9328; 10925) литра для животных с генотипами ЬР/'^-КпИ-4-4, ЪРи-!-^^^ и ЪР/7-1-КпИВВ соответственно. Срединное значение медианы по выборке составляет 10074 литра, интерквартильный размах 9328; 10925, что значительно ниже по сравнению с группой животных с генотипом ЪР^-1-КпИВВ. Среди коров черно-пестрой породы отмечается такая же тенденция: 8475 (8309-8955), 8765 (8308-9533) и 8877 (82649522) литра для животных с генотипами

ЪР/М-НпИ^, ЪРП-1-НпИ1ЛВ и ЪРи-1-ШпИ1ВВ соответственно, при срединном значении медианы выборки 8877 (8264; 9522) литра. То есть, в выборках обеих пород значение медианы в группах животных гомозиготных по предпочтительному аллелю ЪРН-1-Н1пИ1В выше, чем значения медиан для этих выборок в целом.

Результаты статистической оценки достоверности выявленных тенденций с помощью серийного критерия г Вальда-Вольфовица приведены в таблице 1 и подтверждают отличие групп животных с генотипами ЪРЫ-1-КпИ!^ и ЪР/7-1-КпИВВ от выборки в целом.

Таблица 1

Результаты применения серийного критерия г Вальда-Вольфовица для сравнения групп коров с генотипами ЬР/'^-ИпИ^ и ЪР/7-1-КпИВВ с выборкой в целом по признаку общего удоя

Порода Генотип ЪРИ-1-ШпИР4 ЪРИ-1-ШпИ14В ЪРи-1-ШпИ1ВВ

Голштинская Количество особей 5 36 68

Значение р статистики* 0,60 0,00 0,00

Черно-пестрая Количество особей 14 108 180

Значение р статистики* 0,60 0,00 0,00

* Полученные данные статистически значимы при р<0,05.

Исследование влияния генотипа на жирномолочность показало, что по этому признаку аллель ЪР/7-1-Н1пИВ также является предпочтительным у коров обеих пород.

Относительно влияния генотипа на показатель жирномолочности прослеживается тенденция, аналогичная отмеченной выше для общего удоя. В выборках обеих пород наблюдается возрастание этого показателя от животных с генотипом ЪР/^-КпИ44 к группе с генотипом ЪР^-Н^!^ и ЪРП-1-КпИВВ. Так среди коров голштинской породы значение медианы и интерквартильного размаха для всей выборки

составляет 363 (339; 392) кг: Значения медианы и интерквартильного размаха по этому параметру составляет 361 (356; 363), 362 (335; 385) и 368 (342; 401) кг для животных с генотипами ЪР/М-КпБ!44, ЪР/М-КпБ!43 и ЪР/М-КпИВВ соответственно. Среди коров черно-пестрой породы значения медиан и интерквартильного размаха составляют 332 (320; 346), 349 (326; 381) и 348 (326; 377) кг для животных с генотипами ЪР/М-КпБ!44, ЪР/М-КпИ^ и ЪР/М-КпИВВ соответственно, при значении медианы и интерк-вартильного размаха для всей выборки 348 (326; 377) кг (рисунок 3 а, б).

Жирномолочность (кг)

400 390 380 370 360 350 340 330 320

368 _

36-363 362 1= 363 _

1:

□ 25%

□ Ме

□ 75%

ЬР-1-HínFIАА

ЬР-1-HínFIАВ

ья- 1-

HínFIВВ

Полная выборка

410

401

392

385

Жирномолочность (кг)

390

380

370

360

350

340

330 -

320

310

332

^32®

ЬРП-1-HinFIАА

_349 _р _348 _

НИШ

□ 25%

□ Ме

□ 75%

ЬРП-1-HinFIАВ

ЬРП-1-HinFIВВ

381

377

377

3а 3 б

Рис. 3. Показатели жирномолочности у коров с различными генотипами: 3а-голштинская порода; 3б-черно-пестрая порода

Несмотря на то, что уровни продуктивности молочного жира у коров с генотипами ЪР/М-КпИ^4, ЪРй-1-КпИАВ и ЪР/Г-1-КпИВВ в некоторых случаях рознятся незначительно, результаты серийного критерия г

Вальда-Вольфовица подтверждают отличие распределения данного признака в группах коров с генотипом ЪРи-1-Нт^1АВ и ЪР/М-Н1пИВВ от общей выборки у представителей обеих пород (табл. 2).

Таблица 2

Результаты применения серийного критерия г Вальда-Вольфовица для сравнения групп коров с генотипами ЪРй-1-КпИАВ и ЪР/М-КпБ1ВВ с выборкой в целом по признаку общего удоя

Порода Генотип ЪРИ-1-НшРГ" ЪРИ-1-ШпР1АВ ЪРЫ-1-Нт£\ВВ

Голштинская Количество особей 5 36 68

Значение р статистики* 0,60 0,00 0,00

Черно-пестрая Количество особей 14 108 180

Значение р статистики* 0,40 0,00 0,00

* Полученные данные статистически значимы при /><0,05.

Исследование влияния генотипа по НтЕ1-полиморфизму гена ЪРИ-1 на белковомолоч-ность у коров голштинской и черно-пестрой пород показало, что по этому признаку, так же, как по признаку общей молочной продуктивности и жирномолочности, предпочтительным среди представителей обеих пород является наиболее распространенный аллель ЪР/7-1-НтЕР. В этом случае также наблюдается повышение показателя продуктивности от животных с генотипом ЪРИ-1-Н1пБ1АА к генотипу ЪРИ-1-НттАВ и ЪРИ-1-НтБРВ у коров обеих исследуемых пород. Так, у коров голштинской породы срединное

значение белковомолочности по выборке в целом составляет 312 кг, интерквартильный размах 292; 334. Значение медиан и интерк-вартильный размах в группах коров с генотипами ЪР/М-НтБР4, ЪРи-1-НттАВ и ЪРИ-1-НтБРВ составляет 296 (296; 311), 303 (279; 328) и 314 (293; 337) соответственно. У ко -ров черно-пестрой породы значение медиан и интерквартильный размах в группах коров с генотипами ЪР/^-НтБР4, ЪРй-1-НтЕ1АВ и ЪР/М-Н1пИВВ составляет 273 (265; 283), 286 (262; 309) и 290 (269; 309) соответственно, при срединном значении выборки в целом 287 (267; 308) (рис. 4 а, б).

Белковомолочность (кг)

Белковомолочность (кг)

□ 25%

□ Ме

□ 75%

315 305 295 285 275 265 255

3( )9 3 09 3 08 —

286 283 287

273 265 А1 262 Г1 "б! | 1

□ 25%

□ Ме

□ 75%

ьт-1-

ИпНАА

ьт-1-

ИпПАВ

ьт-1-

ИпНВВ

4 а

4 б

Таблица 3

Результаты применения серийного критерия г Вальда-Вольфовица для сравнения групп коров с генотипами ЪР/7-1-Н1пБ1А^ и ЪР/7-1-КпБРВ с выборкой в целом по признаку общего удоя

Порода Генотип ЪРП-1-Н1пР1АА ЪРП-1-ШпР1АВ ЪРи-1-Шп¥!ВВ

Голштинская Количество особей 5 36 68

Значение р статистики* 0,61 0,03 0,00

Черно-пестрая Количество особей 14 108 180

Значение р статистики* 0,40 0,00 0,00

: Полученные данные статистически значимы при /><0,05.

Рис. 4. Показатели белковомолочности у коров с различными генотипами: 4 а - голштинская порода; 4 б - черно-пестрая порода

Как видно из диаграммы, в выборках Результаты применения серийного крите-

обеих пород животные с генотипом ЪРЫ-1- рия г Вальда-Вольфовица для статистической

КпИВВ демонстрируют более высокий уро- оценки отмечаемых тенденций подтвержда-

вень продуктивности молочного белка, по ют отличие распределения данного признака

сравнению с группами животных с гено- в группах коров с генотипом ЪРй-1-Н1пИАВ и

типами ЪРй-1-КпИАВ и ЪР/М-КпИАА, и вы- ЪР#-1-КпБРВ от такового в общей выборке у

боркой в целом. представителей обеих пород (табл. 3).

В работе Я. ЯепауШе (1997 г) показано, что аллель ЪР/7-1-Н1пБ1А ассоциирован с повышенной продуктивностью молока и молочного белка и более низким содержанием молочного жира у животных голштино-фризской породы [5]. Ь. Zwierzchowski в 2002 году при изучении польского черно-пестрого скота также подтвердил наличие положительной ассоциации ЪРН-1-Нп£1А аллеля с ежедневной продуктивностью молока, однако содержание молочного жира в данном исследовании у животных - обладателей аллеля ЪРи-1-Нп£1А было также выше, чем у животных - носителей аллеля ЪРИ-1-НгН1В , по сравнению с данными ЯепауШе [6]. В 2004 г. К. Бе Mattos выявил, что гетерозиготные ЪРН-1-Нп¥1АВ Оуг быки более предпочтительны по сравнению с ЪРи-1-Нп£1ВВ быками по молочной продуктивности их дочерей [7].

Эти отличия в эффекте данного полиморфизма у представителей различных пород позволяют предположить, что, возможно, с геном ЪРи1 сцеплен другой функциональный локус, который собственно и влияет на молочную

продуктивность и который расположен в непосредственной близости от локуса bPit-1-HinFI [8]. Другим объяснением такого эффекта, по мнению M. МикеБЬ (2008), может служить присутствие дополнительного генетического фактора. Длительная дивергенция между B. Indiens и B. Tanrns могла привести к возникновению некоторых геномных различий. Поэтому, возможно, что присутствие одинаковых аллелей отличается по физиологическому эффекту у различных пород [9].

В таком случае, применение данного полиморфизма в качестве генетического маркера по признакам молочной продуктивности требует дополнительных исследований по каждой породе. Однако, по данным, полученным нами для коров голштинской и черно-пестрой породы белорусского разведения, аллель bPit-1-HinFF положительно ассоциирован с такими признаками молочной продуктивности, как общий удой молока за 305 суток лактации, жирномолочность и белковомолочность, и может быть рекомендован в качестве генетического маркера.

Заключение

Исследование ассоциации полиморфизма НтБ1 гена ЪРЫ с признаками молочной продуктивности выявило общие тенденции для выборок коров как голштинской, так и черно-пестрой пород белорусского разведения:

1.У представителей обеих пород аллель ЪР/7-1-КпБР является предпочтительным по трем исследуемым параметрам молочной продуктивности: удой за 305 суток лактации, жирномолочность и белковомолочность.

2. Также по трем исследуемым признакам молочной продуктивности животные с гено-

типом ЪРй-1-КпБРВ превосходят гетерозиго-ты, а те, в свою очередь, особей с генотипом ЪР/Г-1-КпИАА.

3. У представителей обеих пород показатели продуктивности животных с генотипом ЪР/7-1-НтЕРВ по трем признакам превышают таковые по отношению ко всей выборке в целом.

Таким образом, аллель ЪР/М-КпБР может быть рекомендован в качестве генетического маркера молочной продуктивности голштинской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота.

Список использованных источников

1. Woollard, J. Rapid communication: Hin-FI-polymorphism at the bovine Pitl locus / J. Woollard, C. B. Schmitz, A. E. Freeman, C. K. Tuggle // J. Anim. Sci. - 1994. - Vol. 72. -P. 3267.

2. Dierkes, B. Partial genomic structure of the bovine Pit-1 gene and characterization of a HinFI transition polymorphisms in exon 6 / B. Dierkes, B. Kriegesmann, B. G. Baumgarthne, B. Breining

//Anim. Genet. - 1998. - Vol. 29. - P. 405.

3. Реброва, О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М., Ме-диаСфера, 2002. 312 с.

4. Гублер, Е. В., Генкин А. А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Ленинград, Медицина 1973. 142 с.

5. Renaville, R. Pit-1 gene polymorphism, milk yield, and conformation traits for Italian Holstein-Friesian bulls / R. Renaville, N. Gengler, E. Vrech, A. Prandi, S. Massart, C. Corradini // J. Dairy Sci. - 1997. - Vol. 80, №12. - P. 3431 - 3438.

6. Zwierzchowski, L. Effect of polymorphisms of growth hormone(GH), Pit-1, and leptin (LEP) genes, cow's age, lactation stage and somatic cell count on milk yield and composition of Polish Black-and-White cows / L. Zwierzchowski, J. Krzyzewski, N. Strzalkowska, E. Siadkowska, A. Ryniewicz //Anim. Sci. Pap. Rep. - 2002. - Vol. 20. - P. 213-227.

7. De Mattos, K.K. Association of bGH and

Pit-1 gene variants with milk production traits in dairy Gyr bulls / K.K. De Mattos, S.N. Del Lama, M.L. Martinez, A. Freitas, F. Braz // J. Agric. Res. - 2004. - Vol. 39. - P. 147-150.

8. Edriss, V. Pit1Gene polymorphism of Holstein Cows in Isfahan Province / V. Edriss, H. R. Rahmani // Biotechnology - 2008. - Vol. 7, № 2. - P. 209-212.

9. Мukesh, M. Analysis of bovine pituitary specific transcription factor-HinF I gene polymorphism in Indian zebuine cattle / M. Mukesh, R.C. Sodhi, Sobti, B. Prakash, R.A. Kaushik, K. Aggarwal // Livestock Science - 2008. -Vol. 113. - P. 81-86.

Дата поступления статьи 29 ноября 2010 г.