CC BY
5УДК 636.2.082.22
Е.В. Белая, М.Е. Михайлова, Н.М. Волчок, Н.И. Тиханович
ВНУТРИПОРОДНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ БЕЛОРУССКОГО РАЗВЕДЕНИЯ ПО ПОЛИМОРФНЫМ ВАРИАНТАМ ГЕНОВ СОМАТОТРОПИНОВОГО КАСКАДА
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Одним из основных приоритетных направлений научно-технической деятельности в Республике Беларусь является получение сельскохозяйственных животных, обладающих повышенной молочной продуктивностью и исследование генетических, физиологических и биохимических механизмов формирования продуктивности [1, 2]. Эффективная реализация селекционных программ в настоящее время требует привлечения современных методов молекулярных исследований. Одним из новейших селекционных направлений является маркер-сопутствующая селекция (marker assisted selection (MAS), сочетающая информацию о полиморфных вариантах генов, отвечающих за развитие качественных признаков, с данными об их фенотипическом проявлении. В этой связи значительный интерес представляют гены соматотропинового каскада, так как гормон роста (соматотропин) является центральным регулятором роста и лактации у млекопитающих, а гормоны, опосредующие его воздействия на ткани-мишени, влияют на внутриклеточный белковый, углеводный и ли-пидный метаболические обмены. На сегодняшний момент у представителей различных пород крупного рогатого скота для каждого из генов соматотропинового каскада выявлен широкий спектр полиморфных вариантов, в том числе и обусловленных онднонуклеотидными заменами. Однако, эти данные носят фрагментативный, а
иногда и противоречивый характер. Поэтому нами сделана попытка провести комплексное исследование ассоциации генов-кандидатов соматотропинового ряда с количественными признаками молочной продуктивности у крупного рогатого скота.
Так как изучаемые полиморфизмы генов соматотропинового каскада встречаются редко и частота их по данным других исследователей различна не только у представителей разных пород, но и в пределах одной породы, то целью первого этапа работы был анализ генетической структуры популяций крупного рогатого скота черно-пестрой породы белорусского разведения.
Нами исследованы И1п¥\- и Ли\-поли-морфизмы гена гипофизарного фактора-1 ЬРИ-1, запускающего экспрессию гена гормона роста [3, 4]; Лад\-полиморфизм гена пролакти-на ЬРг1, белковый продукт которого является гуморальным регулятором лактации [5]; А1и\-полиморфизм гена гормона роста ЬОИ одного из ключевых регуляторов роста и лактации у млекопитающих [6]; &р\-полиморфизм гена рецептора гормона роста ЬОИЯ, белок которого осуществляет передачу гуморального сигнала гормона роста к клеткам-мишеням [7]; и ^поШ-полиморфизм гена инсулиноподоб-ного фактора роста-1 ЬЮР-1, запускающего внутриклеточные метаболические ответы на воздействие соматотропина [8].
Материалы и методы
Объект исследования - выборки из популя- Материалом для исследования послужили ций крупного рогатого скота черно-пестрой 329 образцов ДНК, выделенных из крови ко-породы белорусского разведения. ров черно-пестрой породы, предоставленных
животноводческими предприятиями Минской области. Источником информации о молочной продуктивности послужили племенные карты исследуемых животных.
Относительные частоты аллелей исследуемых генов определяли методом прямого подсчета по формуле:
^(Щ+^П
где ^-число гомозигот по исследуемому аллелю;
^-число гетерозигот;
^объем выборки [9].
Статистическую ошибку относительных частот аллелей генов вычисляли по формуле [10]: ,
Sp= (<РФ/П
где p-частота исследуемого аллеля;
q=l-p
^объем выборки
Cравнение выборок по распределению абсолютных частот аллельных вариантов ис-
следуемых генов проводили с помощью критерия х2 по Пирсону. Число степеней свободы равно единице.
Соответствие фактического распределения генотипов теоретически ожидаемому оценивали с помощью критерия х2. Число степеней свободы равняется числу генотипов минус число аллелей.
Х2=1(Н-Н)/ Не
где Но наблюдаемые частоты генотипов
Н ожидаемые частоты генотипов: АА =p2;
AB=2pq;
BB=q2 [11].
Определение генотипов животных осуществлялось методом ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрик-ционных фрагментов). Последовательности праймеров и условия ПЦР для анализа каждого полиморфизма приведены в таблице 1.
Таблица 1
Индивидуальные характеристики условий ПЦР для исследуемых полиморфных локусов генов соматотропинового каскада
Полиморфизм Условия амплификации Последовательности праймеров
bPit-1-Hinf I [3] 94оС-1 мин; (95оС-45с; 56оС-60с;72оС-60с)х35; 720-10мин № 5'-ааасса1са1с1сссйс11-3'
I-R: 5'-aatgtacaatgtgccttctgag-3'
bPit-1-StuI [4] 95оС-5 мин; (95оС-45с; 55оС-45с;720-45с)х35; 72оС-10мин StuI-F:5caaatggtccttttcttgttgttacaggg-3'
StuI-R: 5'- ctttaaactcattggcaaacttttc - 3'
bPrl-RsaI [5] 95оС-5 мин; (95оС-30с; 63оС-30с; 72оС-30с)х30; 72-10мин RsaI-F: 5'-gccttccagaagtcgtttgttttc-3'
RsaI-R: 5-cgagtccttatgagcttgattctt-3'
bGH-AluI [6] 95оС-5 мин; (95оС-30с; 64оС-30с; 72оС-60с)х30; 72оС-10 мин AM -F: 5'-ccgtgtctatgagaagc -3'
AluI-R: 5'-gttcttgagcagcgcgt -3'
bGHR-SspI [7] 95оС-5 мин; (950-30с; 600-30с; 720-30с)х30; 720-10 мин SspI-F:5-aatacttgggctagcagtgacaatat-3'
SspI-R:5'-acgtttcactgggttgatga-3'
bIGF-1-SnaBI [8] 95оС-5 мин; (95оС-30с; 64оС-30с; 72оС-30с)х35; 72оС-10 мин SnaBI-F: 5'-attacaaagctgcctgcccc-3'
SnaBI-R:5'-accttacccgtatgaaaggaact-3'
Схемы рестрикционного анализа продуктов амплификации исследуемых генов представлены в таблице 2.
Таблица 2
Схемы ПДРФ-анализа продуктов амплификации исследуемых полиморфных участков
генов соматотропинового каскада
Поли морфизм гена Рестрик-таза Замена нуклеотида /замена аминокислоты Распознаваемый нуклеотид /аллель Генотипы и соответствующие длины рестрикционных фрагментов
ЬРИ-1-Ит/1 Экзон 6 Hinf I A^G А /ЬРЫ-1-И1п/ 1В Pit-1- Hinf IAA: 451; Pit-1- Hinf IBB: 244+207; Pit-1-HinfIAB: 451+244+207;
ЬРИ-1-$>Ы\ Экзон 2 Stu I С^А Pro^His С /ЬР1г-1-8ш\С Pit-1-StuIAA: 234; Pit-1-StuICC: 197+37; Pit-1-StuIAC: 197+37+234;
ЬРН-Кяа! Экзон 4 RsaI A^G А /ЬРт1-Рла\В Prl-RsaIAA: 156; Prl-RsaIBB: 82+74; Prl-RsaIAB: 156+82+74;
ЬОИ-ЛЫ\ Экзон 5 AluI C^G Leu^ Val С /ЬОИ-ЛЫ1 GH-AluIVV: 208; GH-AluILL: 172+35; GH-AluILV: 208+172+35
ЬОИЯ^-р1 Экзон 8 SspI Т^А Phe ^ Val т /ЬОИЯ^р1р GHR-SspI77: 182; GHR-SspIFF: 158+ 24; GHR-SspI™: 182+158+24
ЫОР-1-8паВ\ Экзон 1 SnaBI Т^С Т /ЫО¥-1$>паВ1А IGF-1SnaBIBB: 249; IGF-1SnaBIAA: 223+26; IGF-1SnaBIAB: 249+223+26
Результаты и обсуждение
Результаты исследования относительных частот аллельных вариантов генов соматотропинового каскада у животных черно-
пестрой породы разводимых на разных предприятиях Республики Беларусь представлены в таблице 3.
Таблица 3
Распределение относительных частот аллелей исследуемых генов в популяции
черно-пестрого скота (Р±тр)
Название полиморфизма Аллель Относительная частота аллеля ± статистическая ошибка
РУСП «Племенной завод Красная звезда» СПК АК «Снов» Минская птицефабрика №1
ЬРи-1-Н^1 bPit-1-HinF1А 0,368±0,012 0,212±0,002 0,179±0,003
bPit-1-HinF1В 0,632±0,012 0,788±0,002 0,821±0,003
ЬРи-1^1 ьри-^ыА 0,013±0,003 0,118±0,002 0,174±0,003
ЬРН-^ЫС 0,987±0,003 0,882±0,002 0,826±0,003
ЬРП^с! ЬРН^аР 0,882±0,008 0,893±0,002 0,853±0,003
ЬРг^аР 0,118±0,008 0,107±0,002 0,147±0,003
bGH-AluI bGH-AluI1 0,829±0,009 0,874±0,002 0,243±0,003
bGH-AluI¥ 0,171±0,009 0,126±0,002 0,757±0,003
bGHR- SspI bGHR-SspIF 0,711±0,012 0,777±0,002 0,798±0,003
ьаня^рр 0,289±0,012 0,223±0,002 0,202±0,003
bIGF-1- SnaBI bIGF-1-SnaBIА 0,566±0,01 0,599±0,002 0,537±0,004
ЪЮГ-г-БниБР 0,434±0,01 0,401±0,002 0,463±0,004
В дальнейшем было проведено сравнение полученных относительных частот аллельных вариантов среди животных разных выборок. Выборки трех предприятий сравнивались попарно:
1. РУСП «Племенной завод Красная звезда» - СПК АК «Снов»;
2. РУСП «Племенной завод Красная звезда»
- Минская птицефабрика №1;
3. СПК АК «Снов» - Минская птицефабрика №1.
Данные по результатам сравнения относительных частот аллельных вариантов исследуемых генов в разных популяциях ко -ров черно-пестрой породы представлены в таблице 4.
Таблица 4
Сравнение распределения абсолютных частот аллелей генов соматотропинового каскада в популяциях черно-пестрого скота*
Название полиморфизма РУСП «Племенной завод Красная звезда»/ СПК АК «Снов» РУСП «Племенной завод Красная звезда»/ Минская птицефабрика №1 СПК АК «Снов» / Минская птицефабрика №1
х2 р* х2 р* х2 р*
bPit-1-HinF1 8,52 0,003 11,50 0,001 0,91 0,340
ЬРП-ШЛ 0,002** 0,000** 3,59 0,058
ЬРН^а! 0,452** 0,343** 2,00 0,157
bGH-AluI 1,08 0,298 80,69 0,000 234,53 0, 000
bGHR- SspI 1,57 0,210 2,49 0,115 0,35 0,556
bIGF-1- SnaBI 0,29 0,593 0,19 0,661 2,16 0,14
*- Полученные данные рассматривались как статистически значимые при уровне значимости Р<0,05. ** - Значения р рассчитаны с помощью точного критерия Фишера, двусторонний тест.
Анализ распределения относительных частот полиморфных вариантов генов сомато-тропинового каскада в разных популяциях выявил статистически значимые отличия для гена гипофизарного фактора роста-1 ЪРи-1 по обоим исследуемым полиморфизмам (ЪРИ-1-HinFl и ЪР^-1^и!) в группе животных предприятия «Племенной завод Красная звезда» (табл. 3, 4). Из исследуемой выборки этого предприятия выяснилось, что относительная частота редкого аллеля ЪРИ-^НтК^ выше, чем в популяциях предприятий «Снов» и «Минская птицефабрика № 1» (табл. 3). Причем по отношению к популяции предприятия «Снов» в популяции животных «Племенной завод Красная звезда» частота этого редкого аллеля выше в 1,7 раза, а по отношению к популяции «Минская птицефабрика №1» - в 2 раза (табл. 3).
Исследование распределения относительных частот StuI-полиморфных аллелей гена ЪРН-1 выявило статистически значимые отличия также для выборки популяции животных предприятия «Племенной завод Красная звезда» (табл. 4). Но по данному полиморфизму относительная частота редкого аллеля ЪРН-^Ш^ в популяции этого предприятия оказалась ниже по отношению к двум другим выборкам. Так, относительная частота аллеля ЪРИ-^Ш! в популяции предприятия «Племенной завод Красная звезда» была в 9 раз ниже по сравнению с выборкой из популяции предприятия «Снов» и в 13,4 раза ниже по сравнению с выборкой предприятия «Минская птицефабрика № 1» (табл. 3).
Исследование распределения относительных частот А/М-полиморфных аллелей гена гормона роста ЪОН выявило статистически
значимое отличие по этому показателю для выборки животных предприятия «Минская птицефабрика №1» по отношению к двум другим (табл. 4). Необходимо отметить, что практически все гомозиготные по аллелю ЪОН-А/иГ животные (70 из 74-х) черно-пестрой породы были выявлены в выборке из популяции этого предприятия. Относительная частота редкого аллеля ЪОН-А/и1у среди животных этой группы значительно превышала таковую в выборках из популяций двух других предприятий. Превышение составило 4,4 раза по отношению к выборке предприятия «Племенной завод Красная звезда» и 6 раз по отношению к выборке предприятия «Снов» (табл. 3).
Полученные данные демонстрируют высокую внутрипородную гетерогенность среди популяций крупного рогатого скота черно-пестрой породы белорусского разведения по локусам генов гипофизарного фактора ЪРИ-1 (полиморфизмы ЪРЫ-1^и1 и Pit-1-HinF1) и гена гормона роста ЪОН (полиморфизм ЪОН-А/иГ). Наблюдаемое явление может быть связано с особенностями ведения селекционной работы на данных предприятиях.
Нами отмечено, что для каждой пары аллелей каждого из исследуемых генов аллель, являющийся редким в одной группе, оказывался редким во всех остальных популяциях.
Также нами было проанализировано соответствие распределения генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга для исследуемых генов соматотропинового каскада среди животных черно-пестрой породы. Анализ соответствия проводился с помощью критерия х2. Полученные данные представлены в таблице 5.
Таблица 5
Анализ соответствия распределения частот генотипов в белорусских популяциях голштинского и черно-пестрого крупного рогатого скота по генам соматотропинового каскада теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга
РУСП «Племенной СПК АК Минская
завод Красная звезда» «Снов» птицефабрика №1
Название Генотип п=38 п=182 п=109
полиморфизма
п х2 п х2 п х2
bPit-1-HinF1АА 7 6 1
bPit-1-HinF1 bPit-1-HinF1АВ 14 1,65 65 0,91 37 1,81*
bPit-1-HinF1ВВ 17 111 71
bPit-1StuIАА 0 0 0
bPit-1-StuI bPit-1StuIАС 1 37,25* 43 2,22* 38 3,69*
bPit-1StulСС 37 139 71
bPrl-RsaIAА 29 145 78
bPrl-Rsal bPrl-RsaIАB 9 0,04* 35 0,08* 30 0,49*
bPrl-RsaIВB 0 2 1
bGH-AluLL 25 140 14
bGH-AluI bGH-AluILV 13 0,63* 38 0,19* 25 15,47
bGH-AluIVV 0 4 70
bGHR-SspIFF 19 111 68
bGHR- SspI bGHR-SspIFY 16 0,04* 61 0,18 38 0,37*
bGHR-SspIYY 3 10 3
bIGF-1-SnaBIAА 14 68 34
bIGF-1- SnaBI bIGF-1-SnaBIАB 15 1,47 82 0,70 49 1,01
bIGF-1-SnaBIBВ 9
*-значения х2 рассчитаны с поправкой Йетса. Значение х2 для уровня значимости 0,05 составляет 3, 84.
Нами выявлено, что среди выборки животных предприятия «Племенной завод Красная звезда» наблюдается отклонение наблюдаемого распределения частот генотипов от теоретически ожидаемого равновесного распределения Харди-Вайнберга по bPit-1 StuI-полиморфизму. Ранее отмечено, что относительные частоты аллельных вариантов гена bPit-1 по этому полиморфизму статистически значимо отличаются от таковых в выборках других популяций (табл. 3, 4).
По ^/'и,Р1-полиморфизму в выборке животных «Племенной завод Красная звезда» также выявлено отличие относительных частот ал-лельных вариантов гена bPit-\, а наблюдаемое распределение частот генотипов по этому
полиморфизму соответствует теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга.
Отмечаемое в популяции коров предприятия «Минская птицефабрика №1» отличие распределения относительных частот ^М-аллельных вариантов гена гормона роста bGH (табл. 3, 4) от двух других популяций сопровождается отклонением наблюдаемого распределения частот генотипов от теоретически ожидаемого равновесного распределения Харди-Вайнберга.
По другим полиморфизмам исследуемых генов наблюдаемое распределение частот генотипов соответствовало теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга.
Заключение
Нами исследованы относительные частоты встречаемости полиморфных вариантов пяти генов соматотропинового каскада в трех различных популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой породы белорусского разведения. А именно, bPit-1-HinFl и bPit-1-Stul-полиморфизмы гена гипофизарного фактора роста-1, bPRL-Rsal полиморфизм гена про-лактина, bGH-Alul-полиморфизм гена гормона роста и bIGF-l-SnaBl-полиморфизм гена инсулиноподобного фактора роста-1.
Выявлено, что в парах аллельных вариантов каждого из исследуемых генов, редкий аллель совпадал в выборках всех трех популяций.
Т.е., ситуации, когда аллель, являющийся редким в одной выборке, оказался бы более распространенным в другой выборке, нами отмечено не было.
Внутрипородные различия распределения относительных частот аллельных вариантов были выявлены для гена гипофизарного фактора bPit-1 по HinFl- и bPit-l-Stul-полиморфизмам, а также для Alul-полиморфизма гена гормона роста bGH.
Отклонения распределения частот генотипов от теоретически ожидаемого равновесного распределения Харди-Вайнберга наблюдается только по тем полиморфизмам и в тех же выборках, по которым отмечены внутрипород-ные отличия распределения относительных частот аллельных вариантов.
Выявленные тенденции в дальнейшем будут учтены при исследовании ассоциации полиморфизмов генов соматотропинового каскада с признаками молочной продуктивности у коров голштинской и черно-пестрой пород.
Список использованных источников
1. Структура приоритетных направлений научно-технической деятельности в Республике Беларусь на 2006-2010 годы, утверждена Указом Президента Республики Беларусь № 315 от 06.07.2005.
2. Перечень приоритетных направлений фундаментальных и прикладных научных исследований Республики Беларусь на 20062010 гг., утвержденный постановлением Совета Министров Республики Беларусь от 17 мая 2005 г. № 512.
3. Edriss, V., Edriss, V.a., Rahmani, H. R. Pit-1Gene polymorphysm of Holstein Cows in Isfahan Province. iotechnology 7 (2): 209-2126 2008.
4. Huang W. A proline-to-histidine mutation in POU1F1 is associated with production traits in dairy cattle. / W. Huang, C. Maltecca and H. Khatib.// Animal Genetics. - 2008. - Vol. 39.-P. 554-557.
5. Alipanah, M. Kappa-Casein and PRL-RSA I Genotypic Frequencies in two russian cattle breeds / M. Alipanah, L. A. Kalashnikova, G. V. Rodionov // Archivos Zootec. - 2008.-Vol. 57, № 218.- P. 131-138.
6. Zhou,G L, Liu, H G, Liu C, Guo, S L, Zhu, Q and Wu, Y H. 2005. Association of genetic polymorphism in GH gene with milk production traits in Beijing Holstein cows. Journal of Biosciences 30: 595.
7. Viitala, S., Szyda, J., Bloot, S., Schulman, N., Lidauer, M., Maki-Tanila, A., Georges, M., Vilkki, J.H., 2006. The role of the bovine growth hormone receptor and prolactin receptor genes in milk, fat and protein production in Finnish Ayrshire cattle. Genetics 173: 2151-2164.
8. Siadkowska, E. L. Effect of polymorphism in IGF-1 gene on production traits in Polish Holstein-Friesian cattle / E. L. Siadkowska // Animal Science Papers and Reports.- 2006. -Vol. 24, № 3. - P. 225-237.
9. Алтухов, Ю.П. Генетические процессы в популяциях./М.: Наука, - 1989.
10. Рокицкий П.Ф. Основы вариационной статистики для биологов //Минск: БГУ, -1961.
11. Рокицкий, П.Ф. Основы вариационной статистики для биологов //Минск: БГУ. 1961.
12. Айала, Ф., Кайгер, Дж., Современная генетика. Т 3., М.: Мир, 1988. - 335 с.
Дата поступления статьи 22 сентября 2010 г.
