CC BY
7УДК 577.21:636.23.082.2
Е.В. Белая1, М.Е. Михайлова1, Н.В. Батин2
ОЦЕНКА ИНДИВИДУАЛЬНОГО ФЕНОТИПИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ ГИПОФИЗАРНОГО ФАКТОРА РОСТА-1 (bPIT-1) И ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА РОСТА-1 (bIGF-1) НА ПРИЗНАКИ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ У ЧЕРНО-ПЕСТРОГО ГОЛШТИНИЗИРОВАННОГО КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2ГУО «Институт подготовки научных кадров НАН Беларуси» Республика Беларусь, г. Минск, ул. Кнорина, 1
Введение
Одним из новейших селекционных направлений является маркер-сопутствующая селекция, marker assisted selection (MAS), сочетающая информацию о полиморфных вариантах генов, отвечающих за развитие количественных признаков, с данными об их фенотипическом проявлении. Преимуществом такого подхода является возможность быстрого выявления и отбора на ранних этапах постнатального развития сельскохозяйственных животных, обладающих повышенным генетическим потенциалом продуктивности, для получения дополнительной продукции при одновременном сокращении временных и материальных затрат.
Поиск высокоинформативных генетических маркеров в настоящее время ведется среди полиморфных вариантов генов соматотропинового каскада, белковые продукты которых участвуют в регуляции экспрессии гена соматотропина
и опосредовании его лактотропных эффектов. К настоящему времени выявлено большое количество однонуклеотидных замен в структуре этих генов, которые могли бы быть использованы в маркер-сопутствующей селекции в качестве генетических маркеров молочной продуктивности КРС. Поэтому актуальность приобретают исследования, направленные на выявление ассоциации таких полиморфизмов с количественными признаками продуктивности сельскохозяйственных животных и в частности крупного рогатого скота.
Нами исследованы HinFI-полиморфизм гена гипофизарного фактора-1 (bPit-1), инициирующего экспрессию гена гормона роста и SnaBI-полиморфизм гена инсу-линоподобного фактора роста-1 (bIGF-1), запускающего внутриклеточные метаболические ответы на воздействие сомато-тропина [1, 2, 3].
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования послужили 329 образцов ДНК, выделенных из крови коров черно-пестрой голштинизированной породы, предоставленных животноводческими предприятиями Минской области. Источником информации о молочной продуктивности послужили племенные карты исследуемых
животных. Определение генотипов животных осуществлялось методом ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов). Последовательности праймеров и условия ПЦР для анализа каждого полиморфизма приведены в табл.1.
Таблица 1
Индивидуальные характеристики условий ПЦР для исследуемых полиморфных локусов генов соматотропинового каскада
Полиморфизм Условия амплификации Последовательности праймеров
ЬРН-1-Ш^Г [4] 94 °С - 1 мин; (95 °С - 45 сек; 56 °С - 60 сек; 72 °С - 60 сек) х 35; 72 °С - 10 мин НтИ-Р: 5'aaaccatcatctcccttctt-3'
ШпР№: 5'-aatgtacaatgtcttctgag-3'
-SnaBI [5] 95 °С - 5 мин; (95 °С - 30 сек; 64 °С - 30 сек; 72 °С - 30 сек) х 35; 72 °С - 10 мин SnaBI-F: 5'-attcaaagctgcctgcccc-3'
SnaBI-R: 5'-acacgtatgaaaggaact-3'
Таблица 2
Характеристика SSR-маркеров
Полиморфизм гена Рестриктаза Замена нуклеотида /замена аминокислоты Распознаваемый нуклеотид / аллель Генотипы и соответствующие длины рестрикционных фрагментов
ЬРН-1-Экзон 6 ИМ А^ А /ЬРН-1-И тАВ Рй-1- ИтА44: 451; Рй-1- ИтАвв: 244+207; Р/М-ИтААВ: 451+244+207
bIGF-1-SnaBI Экзон 1 SnaBI Т^С Т /bIGF1 SnaBГ4 ^-^тВ1ВВ: 249; IGF-1SnaBГ44: 223+26; ^-^тВГ": 249+223+26
Результаты и обсуждение
Схемы рестрикционного анализа продуктов амплификации исследуемых генов представлены в табл. 2.
Исследование индивидуальных феноти-пических эффектов полиморфных вариантов генов соматотропинового каскада осуществлялось в несколько этапов. На первом этапе нами выявлялись предпочтительные аллели и генотипы по каждому полиморфному варианту исследуемых генов. Под предпочтительным аллелем мы понимаем тот аллель, носители которого характеризуются более высокими показателями продуктивности по данному признаку по сравнению с носителями другого аллеля из этой пары. Аллель, входящий в структуру гомозиготных генотипов, характеризующихся пониженным уровнем продуктивности по данному признаку, обозначается как альтернативный аллель. Под предпочтительным генотипом мы понимаем тот генотип из трех возможных, обладатели которого характеризуются самым высоким уровнем продуктивности
по данному признаку. Выявление предпочтительного и альтернативного аллелей и генотипов проводилось путем сравнения непараметрических показателей продуктивности в группах с соответствующими генотипами между собой. Статистическая значимость наблюдаемых тенденций оценивалась с помощью теста Фишера. Данный метод позволяет оценивать различия между двумя и более группами, принадлежащими к одной генеральной совокупности, и применим на малых выборках (п < 20) [6].
Затем нами проводилась оценка характера и степени проявления индивидуального фе-нотипического эффекта исследуемых полиморфных вариантов генов по отношению к показателям продуктивности общей выборки. Оценкахарактера индивидуального фенотипического эффекта генотипа на признак (повышающий/понижающий эффект) осуществлялась путем сравнения непараметрических характеристик генотипов с показателями общей выборки. Статистическая обработка дан-
ных осуществлялась методом интервального оценивания, путем определения 95% доверительного интервала для медианы [6]. Данный метод позволяет оценить значимость отличий между непараметрическими характеристиками группы с определенным генотипом, являющейся частью общей выборки, и непараметрическими характеристиками общей выборки.
Оценка степени проявления индивидуальных фенотипических эффектов полиморфных вариантов генов соматотропинового каскада проводилась путем подсчета средних значений продуктивности по каждому признаку для каждого генотипа. Затем для каждого генотипа была проведена оценка превышения его индивидуального фенотипического эффекта по отношению к общей выборке (в %) и отбор ин-
дивидуальных генотипов-лидеров по данному признаку. Оценка статистической значимости отличий непараметрических характеристик группы с определенным генотипом от общей выборки осуществлялась методом интервального оценивания [6]. Те генотипы, обладатели которых характеризуются повышенными / пониженными показателями молочной продуктивности по сравнению с общей выборкой, обозначены как индивидуально повышающие/ понижающие генотипы по определенному признаку.
Данные о продуктивности особей с различными генотипами по полиморфизму bPit-1 -HinFI у коров черно-пестрой гол-штинизированной породы представлены в табл. 3.
Таблица 3
Показатели молочной продуктивности у коров черно-пестрой голштинизированной породы по полиморфизму HinFI гена ЬН^1 Ме (25%; 75%)
Генотип п Непараметрические характеристики Удой,л жирномолочность, кг Белковомолоч-ность, кг
ЪРИ-1 -ШпРР44 14 Ме (25%; 75%) 8475 (8309; 8955) * 332 (320; 346)* 273 (265; 283)*
ДИ -95%; +95% 8279; 8859 317; 348 250;283
ЬРН-1-Нт£1АВ 107 Ме (25%; 75%) 8751 (8299; 9536) 348 (325; 380) 285 (262; 308)
ДИ -95%; +95% 8485;9233 339; 356 277; 292
ЪРИ-1 -ШпР1ВВ 175 (Ме 25%; 75%) 8890 (8258; 9589) 350 (329; 378) 290 (270; 311)
ДИ -95%; +95% 8728; 9081 344; 363 283; 296
Общая выборка 296 Ме (25%; 75%) 8878 (8288; 9533) 348 (327; 377) 287 (267; 308)
* - генотипы, обладающие статистически значимым понижающим эффектом на признаки молочной продуктивности (прир < 0,05).
По данным, представленным в табл. 3, можно отметить, что наиболее распространенный аллель bPit-1-HinFIВ является предпочтительным по трем исследуемым признакам. Особи с генотипом bPit-1-HinFIВВ характеризуются более высокими показателями удоя, жирномолочности и белковомо-лочности по сравнению с особями с генотипом ЪPit-1-HmFГ4А. Превышение значений медиан у группы с генотипом bPit-1-HinFIВВ, по сравнению с группой с генотипом ЪРи-1-HmFIАА, составляет 415 л молока, 18 кг молочного жира и 17 кг молочного белка по признакам удоя, жирномолочности и белко-вомолочности соответственно. Гетерозиго-
ты ЪРН-1 -HinFIАВ, в данном случае, занимают промежуточное положение.
Результаты оценки достоверности различий групп животных с разными генотипами по полиморфизму bPit-1-HinFI между собой по показателям молочной продуктивности приведены в табл. 4.
По результатам применения теста Фишера при сравнении разных генотипов по полиморфизму bPit-1-HinFI между собой статистически значимые отличия выявляются в паре генотипов bPit-1 -HinFIАА и bPit-1-HmFPB по уровню удоя, жирномолочности и белковомолочности.
Таблица 4
Значения р статистики по результатам применения теста Фишера у групп животных с разными генотипами по полиморфизму гена
Сравниваемые пары генотипов Удой, л Жирномолочность, кг Белковомолочность, кг
ЪРи-1-Ит£1АА ЪРи-1-И^1ВВ 0,03* 0,07** 0,06**
ЪРЫ-1-Ит£1АА ЪРИ-1-Ит¥1АВ 0,34 0,12 0,34
ЪРи-1-Шг^1АВ ЪРи-1-т^1ВВ 0,96 0,85 0,77
* - различие между генотипами статистически значимо при р < 0,05; ** - различие между генотипами статистически значимо прир < 0,1.
Анализ характера фенотипического эффекта полиморфных вариантов гена ЪРи-1 на признаки удоя, жирномолочности и белковомо-лочности показал, что превышение значения медианы у группы животных с предпочтительным генотипом ЪРЫ-1 -КпР1вв по отношению к общей выборке составляет всего лишь 12 л по удою, 2 кг по жирномолочности и 3 кг по бел-ковомолочности. В то время как понижающий эффект генотипа ЪP^t-7-HinFГА4 по отношению к общей выборке составляет 403 л, 16 и 14 кг соответственно. Оценка статистической значимости отличий непараметрических характеристик групп с генотипами ЪРи-1 -HinFГА4, ЪРи-1-И^ГАВ и ЬРи-1-И^1ББ от общей выборки путем интервального оценивания выявила достоверные отличия от выборки по трем признакам у группы коров с генотипом ЪР/7-7-И^1АА (см. табл. 3). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что для применения данного полиморфизма гена ЪРи-1 в качестве генетического маркера повышенной молочной продуктивности черно-пестрого голштинизи-рованного крупного рогатого скота в селекционных программах более целесообразно учитывать понижающий эффект генотипа ЪРи-1 -HinFГ4А, чем повышающее влияние предпочтительного генотипа ЪР^-7-И^РВ.
По данным Zwierzchowski et al., полученным при исследовании польского черно-пестрого голштинизированного скота, отмечается наличие положительной ассоциации ЪP/t-7-HinFГ4 аллеля с ежедневной продуктивностью молока, а также более высоким содержанием молочного жира [7]. Таким образом, имеются расхождения в наблюдаемых эффектах генотипа в разных популяциях одной породы. По нашему мнению, полученные нами данные свидетельствуют в пользу идеи Мukesh et al. о
том, что различный характер фенотипическо-го эффекта одинаковых полиморфных аллелей у представителей разных популяций черно-пестрой голштинизированной породы отличается по физиологическому эффекту из-за присутствия фоновых геномных влияний, которые сформированы под воздействием искусственного отбора [8]. В пользу такого мнения выступает также тот факт, что черно-пестрая порода, разводимая на территории Беларуси, была значительно голштинизирована в селекционных целях и условная доля породности для анализируемых в нашей работе животных составляет в среднем 30,16% черно-пестрой породы к 69,84% голштинской.
Данные о продуктивности особей с различными генотипами по SnaBI-полиморфным вариантам гена ЪIGF-1 у коров черно-пестрой голштинизированной породы представлены в табл. 5.
Анализ ассоциации SnaBI-полиморфизма гена инсулиноподобного фактора роста-1 с молочной продуктивностью черно-пестрых голштинизированных коров показал, что более редкий аллель ЪIGF-1-SnaBIВ является предпочтительным по трем исследуемым признакам молочной продуктивности. Так превышение значений медиан по этим признакам у коров с генотипом ЪIGF-1-SnaBIВВ, по отношению к коровам с генотипом ЪIGF-7-SnaBГ4A, составляет 357 л молока, 16 кг молочного жира и 11 кг молочного белка по признакам удоя, жирномолочности и белковомолочности соответственно. Значения медианы и интерквартильного размаха признаков удоя, жирномолочности и белковомолочности у особей с генотипом ЪIGF-1-SnaBГ4A практически одинаковы с ге-терозиготами ЪIGF-1 -SnaBIAB. Это позволяет обозначить аллель ЪIGF-1-SnaBIВ как предпо-
чтительный аллель, а генотип bIGF-1 -SnaBIВВ как предпочтительный генотип по всем трем признакам молочной продуктивности. Результаты оценки достоверности различий
групп животных с разными генотипами по полиморфизму bIGF-1-SnaBI по показателям молочной продуктивности между собой приведены в табл. 6.
Таблица 5
Показатели молочной продуктивности у коров черно-пестрой голштинизированной породы по полиморфизму SnaBI гена ЪЮ¥ Ме (25%; 75%)
Генотип п Непараметрические характеристики Удой,л жирномолочность, кг Белковомолоч-ность, кг
ЫОЕ-1^паВ\вв 59 Ме (25%; 75%) 9083 (8485; 9782)* 364 (339; 396)* 295 (273; 312)*
ДИ -95%; +95% 8883;9513 349; 373 289; 303
ЫОЕ-1^паВ1АВ 133 Ме (25%; 75%) 8852 (8241; 9375) 345 (324; 375) 285 (267; 308)
ДИ -95%; +95% 8561;8999 338; 351 278; 295
bIGF-1-SnaBIAA 104 (Ме 25%; 75%) 8726 (8167; 9503) 348 (320; 374) 284 (261; 306)
ДИ -95%; +95% 8527; 9147 337;363 275; 291
Общая выборка 296 Ме (25%; 75%) 8878 (8288; 9533) 348 (327; 377) 287 (267; 308)
* - генотипы, обладающие статистически значимым понижающим эффектом на признаки молочной продуктивности (при р < 0,05)
Таблица 6
Значения р статистики по результатам применения теста Фишера у групп животных с разными генотипами по полиморфизму гена bIGF-1-SnaBI
Сравниваемые пары генотипов Удой, л жирномолочность, кг Белковомолочность, кг
ЫОЕ-1^паВ!вв bIGF-1-SnaBIAA 0,02* 0,01* 0,02*
ЬЮЕ-1-5тВГвв bIGF-1-SnaBIAB 0,03* 0,01* 0,06**
bIGF-1-SnaBIAB bIGF-1-SnaBГAA 0,67 0,70 0,58
* - различие между генотипами статистически значимо при р < 0,05; ** - различие между генотипами статистически значимо при р < 0,1.
По данным, приведенным в табл. 6, можно отметить, что в случае SnaBI-полиморфизма гена bIGF-1 предпочтительный генотип bIGF-1-SnaBIВВ по всем трем признакам молочной продуктивности статистически значимо (а = 0,05) отличается от альтернативного генотипа bIGF-1-SnaBГA4, а также от гетерозиготного генотипа bIGF-1-SnaBIAB (а = 0,05, кроме признака белковомолочности, где а = 0,1).
Результаты оценки характера фенотипи-ческого эффекта SnaBI-полиморфизма гена bIGF-1 на признаки удоя, жирномолочности и белковомолочности позволяют охарактеризовать его как повышающий по всем трем признакам. Разница в показателях продуктивности животных с предпочтительным гено-
типом bIGF-1-SnaBIВВ и общей выборкой составляет 205 л молока, 16 кг молочного жира и 8 кг молочного белка в пересчете на 305 суток лактации по признакам удоя, жирномолочности и белковомолочности соответственно. По данным интервального оценивания по признакам удоя, жирномолочности и белковомолоч-ности, отличия группы животных с генотипом Ь10Г-^паВ1вв от общей выборки являются статистически значимыми.
Данные, касающиеся ассоциации SnaBI-полиморфизма гена bIGF-1 с признаками молочной продуктивности у голштинизирован-ного черно-пестрого скота, получены нами впервые и позволяют рекомендовать генотип bIGF-1-SnaBIВВ в качестве универсального
ДНК-маркера повышенной молочной продук- сти и белковомолочности у представителей тивности по признакам удоя, жирномолочно- этой породы.
Заключение
Таким образом, по результатам нашего исследования следует отметить, что предпочтительный генотип не всегда характеризуется повышенным уровнем молочной продуктивности по сравнению с уровнем продуктивности по общей выборке. В таком случае, по нашему мнению, ДНК-типирование и отбор животных по таким генотипам являются недостаточно эффективными. Более того, в некоторых случаях понижающий эффект альтернативного генотипа по отношению к общей выборке выражен сильнее, чем повышающий эффект предпочтительного генотипа, как в случае полиморфизма HinFI гена ЪPit-1. Поэтому, на наш взгляд, при оценке перспективности применения полиморфных
вариантов потенциальных генов-кандидатов в качестве генетических маркеров повышенной продуктивности целесообразно проводить оценку характера фенотипического эффекта полиморфизма путем сравнения показателей продуктивности животных с соответствующими генотипами по данному признаку, как между собой, так и по отношению к показателям продуктивности общей выборки. Это позволяет не только установить предпочтительный генотип, но также качественно определить характер (повышающий/понижающий/нейтральный) и количественно оценить степень проявления фенотипическо-го эффекта полиморфных вариантов гена на исследуемый признак.
Список используемых источников
1. Molecular and cellular aspects of insulinlike growth factor action / H. Werner [et al.] // Vitamins and Hormones. - 1994. - Vol. 48. -P. 51-58.
2. SnaBI-полиморфизм гена инсулинопо-добного фактора роста (bIGF-1) / Е.В. Белая, М.Е. Михайлова // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - 2009. - Т. 9. -С. 153-159.
3. Влияние HinFI-полиморфизма гена ги-пофизарного фактора роста bPit-1 на признаки молочной продуктивности крупного рогатого скота голштинской и черно-пестрой пород / М.Е. Михайлова, Е.В. Белая // Молекулярная и прикладная генетика: сб.науч. тр. - 2010. - Т. 11. - С. 120-126.
4. Pit1 gene Hinf I RFLP and growth traits in double-muscled Belgian Blue cattle / R. Renaville [et al.] // J. Anim. Sci. - 1997. -Vol. 75. - №1. - P. 146-148.
5. Effect of polymorphism in IGF-1 gene on production traits in Polish Holstein-Friesian cattle / E. Siadkowska [et al.] // Animal Science Papers and Reports. - 2006. - Vol. 24. - №3. -P. 225-237.
6. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. - М.: МедиаСфера, 2002 - 312 с.
7. Effect of polymorphisms of growth hormone (GH), Pit-1, and leptin (LEP) genes, cow's age, lactation stage and somatic cell count on milk yield and composition of Polish Black-and-White cows / L. Zwierzchowski [et al.] // Anim. Sci. Pap. Rep. - 2002. - Vol. 20. -P. 213-227.
8. Analysis of bovine pituitary specific transcription factor-Hinf I gene polymorphism in Indian zebuine cattle / M. Mukesh [et al.] // Livestock Science. - 2008. - Vol. 113. - P. 81-86.
Дата поступления статьи 18 ноября 2011 г.
