CC BY
13
© Ткаченко 1.М., Шликова О.А., Кайдашев 1.П. УДК 616.314-001.4 -084-08
ВИЗНАЧЕННЯ П0Л1М0РФ13МУ ГЕН1В КАЛЕКРЕ1НУ-4 ТА МАТРИКСН01 МЕТАЛОПРОТЕ1НАЗИ-20 У ПАЦ1ЕНТ1В 3 П1ДВИЩЕН0Ю СТЕРТ1СТЮ 3УБ1В
Ткаченко 1.М., Шликова О.А., Кайдашев 1.П.
ВДНЗУ «УкраТнська медична стоматолопчна академiя», м. Полтава.
Эластин является основным компонентом экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) кожи. Любые структурные, наследственные или приобретенные дефекты и / или нарушения обмена веществ в ЭЦМ могут вызвать клеточные и тканевые изменения, приводящие к развитию или прогрессированию заболевания. С целью определения участия генетических факторов в процессе патологического рубцевания ран изучали полиморфизм g28197A>G в 20 экзоне гена эластина в группах больных, склонных к образованию патологических рубцов, расположенных в функционально активных зонах лица и шеи, и не склонных к образованию патологических рубцов. Обследовано 38 пациентов в возрасте от 18 до 65 лет, находившихся на стационарном и амбулаторном лечении после плановых хирургических вмешательств по поводу различных заболеваний, первичной хирургической обработки ран в разных топографо-анатомических областях головы и шеи. По анамнестическими данными и клиническими наблюдениями за процессом рубцевания ран больные были разделены на группы: больные с наличием патологических рубцов (основная группа (n = 18)), что чаще всего расположены в функционально активных зонах лица и шеи, и больные, не имеющие патологических рубцов (группа сравнения (n = 20)). Анализ аллельных частот показал, что аллель G достоверно чаще встречалась в группе больных, склонных к образованию патологических рубцов (х2 = 5,19, р = 0,023). Выявлено достоверную зависимость между наличием полиморфного алле-ля G и повышенным риском образования патологических рубцов (ВШ = 3,58, 95% ДИ = 1,3-9,87, р = 0,023). Рассматривая полученные результаты возможно предположить, что наличие у больного мутантной аллели G при миссенс мутации g28197A G в гене ELNявляется одним из факторов развития склонности к образованию патологических рубцов в процессе рубцевания ран.
Ключов1 слова: м1нераглзац1я емал1, пщвищена стертють зуб1в, пол1морф1зм, матриксн металопротеази, капекреш.
Пщвищена стертють зуб1в, за даними багатьох на-уковц1в, е патолопею, поширенють якоТ складае вщ 8 до 30% у пац1ент1в р1зних вкових груп [1-3].
Ця патолопя розглядаеться як полютюлогнний прогресуючий процес, без можливост1 регенераци, який супроводжуеться цтою низкою морфологнних, естетичних та функцюнальних порушень здатний зна-чно знижувати якють життя хворих [4.5].
В в1тчизнян1й л1тератур1 не зустр1чаеться ведомостей, щодо дослщження питання, про те, що морфоло-пя зуб|в, переважно, зумовлена спадковими факторами, а процес дентиногенезу регулюеться багатьма генами. На нашу думку, саме дефекти генетичноТ ланки при закладц1 еп1тел1ального органу можуть бути головними чинниками, як1 зумовлюють порушення структури зуб1в, що, в свою чергу, провокуе розвиток пщвищеного стирання зуб1в на тл1 додаткових чиннигав.
По заганченню морфогенеза тверд! тканини зуба на протяз1 всього життя не оновлюються, бюценоз Тх-нього внутршнього середовища пщтримуеться за ра-хунок пульпи зуба, кл1тинного цемента, перюдонталь-них волокон та слини. Тому пщвищена стертють зуб1в може бути проявом порушення закладки насамперед емал1, що можливо в результат! генних мутацш, саме на етапах первинноТ мЫералЬаци [6].
В матриц! емал! зубв, що розвиваються видтя-ються два типи протеаз. На початку протеаза енаме-лЬин (MMP-20), наприк1нц1 формування емал! протеаза калкреТн 4 (KLK4). Мутаци в MMP20 i KLK4, як! е причиною аутосомно-рецесивного недосконалого амелогенезу, приводять до кл1н1чноТ презентацп м'якоТ (за фЬичними характеристиками), пористоТ емал!, яка не в змоз! витримувати функц!ональн! на-вантаження за рахунок вм!сту залишков! к!лькост! б1л-
ка. П1д час розвитку зуб1в, протеТнази, що видтяються у м!жкл!тинний прост!р, розщеплюють бтки емал!, i катал!зують г!дрол1з пептидних зв'язгав [7-11].
Метою нашого дослщження стало визначення по-л!морф!зму гешв калекреТну 4 та матриксноТ метало-проте!нази 20 у пац!ент!в з пщвищеною стерт!стю зу-б1в.
Матерiали i методи досл1дження
Зг!дно з М!жнародною класиф!кац!ею стоматолоп-чних хвороб (МКХ-С), яка розроблена на баз! МКХ-10, патолог!чн! стани твердих тканин зуб1в п!дрозд!ляють на 2 велик! групи: «Порушення розвитку i прорЬуван-ня зуб!в» (клас - К 00) та «Хвороби твердих тканин зу-б1в» (клас - К 03), як! в свою чергу входять до роздту «Хвороби оргаыв травлення» у п!дрозд!л «Хвороби порожнини рота, слинних залоз та щелеп» [12,13]. Для визначення наявност! полшорфЬмю ген!в калекреТну 4 в 4 екзон g.2142 G>A AF228497 (KLK4) та матриксноТ металопротешази - 20 (ММР-20) в 5 екзош g. 16250 T>A NT033899.6 ¡з вс1еТ кагорти обстежених пац!ент!в (n=170), методом виб!рковоТ сукупност!, об-рали 72 пацюнта з! стерт!стю зуб1в I-III ступеня: чоло-в1к1в 30, жЫок 42. В1к пац!ент!в складав в1д 20 до 62 роюв. Досл!дження проводили з наданоТ письмовоТ згоди пац!ент!в на проведення обстеження та ухвали ком1с1Т з етичних питань та бюетики ВДНЗУ «УкраТнсь-ка медична стоматолог!чна академ!я». Дослщження проведен! на баз! науково-дослщного ¡нституту гене-тичних та ¡мунолог!чних основ розвитку патологи та фармакогенетики ВДНЗУ «УкраТнська медична стоматолопчна академя».
Матер^лом для досл!дження слугувала каптярна кров. Геномну ДНК вид!ляли за допомогою набору
Том 16. N 5-6 2012 р.
«ДНК-експрес» згщно шструкци фiрми виробника (ООО НПФ «Литех», Росiя).
Мутанты та «дию» типи алелей гешв KLK4 та ММР-20 амплiфiкували за допомогою алель-специфiчноï полiмеразноï ланцюговоТ реакцiï в 35 мкл реакцмноТ сумiши, що мiстила: 2,5 мкл 10 х Buf для
амплiфiкацiï; 2 мМ хлориду магнiю; 0,2 мМ кожного dNTP; 2,5 од. ДНК-полiмерази Tag з додаванням по 5 пкмоль специфiчних праймерiв та по 5 пкмоль специ-фiчних проб мiчених флуоресцентними барвниками FAM i R6G з 5'- юнця i BHQ-1, BHQ-2 з 3'-юнця, вщпо-вiдно (табл.1).
Таблиця 1
Посл1довнють специф1чних праймерв та специф1чних проб
Ген Послщовнють
ММР-20 NT033899.6 Праймеры up 5'- GCTCTCTCATATTGTCTAGGTTT-3' low 5'-CTGATGGGTCTGTGGAATGGG-3'
Проби wt (FAM) CTGCTCATGAATTTGGCCAT-(BHQ1) m (R6G) TGCTCAAGAATTTGGCCATG-(BHQ2)
KLK4 AF228497 Праймери up 5'-TTACTTCGCAGTGCCCT-3' low 5 '-GGCAGACACACACCCGT G A-3 '
Проби wt (FAM) CTGCTCATGAATTTGGCCAT-(BHQ1) m (R6G) TGCTCAAGAATTTGGCCATG-(BHQ2)
До сумш додавали 20-50 нг геномно''' ДНК обстежу-ваних. Амплiфiкацiю reHiB KLK4 та ММР-20 проводили на детектуючому амплiфiкаторi ДТ-322 (ООО „НПО ДНК-Технология", Роая) в рeжимi реального часу, наступним чином: перший цикл - 950С/3 хвилини; 40 циклiв -950С/15 секунд; - 630С/40 секунд.
Продукти амплiфiкацiï гeнiв KLK4 та ММР-20 щен-тифiкyвали за допомогою флуорисцентно''' рeeстрацiï накопичення ДНК за каналами флюоресценцп: 1 канал - барвник FAM; 2 - канал барвник R6G, безпосе-редньо в ходi реакци.
Математична обробка отриманих даних проводилась за допомогою стандартного методу варiацiйного аналiзy на персональному комп'кл^ IBM РС Pentium IV. Аналiз рeзyльтатiв дослiджeння здмснювався з використанням програм "Microsoft Excel 2003", "Statistica for Windows. Version 5.0". Результати гене-тичних дослщжень оброблeнi статистично з використанням критерю х2 з визначенням вiрогiдностi точним методом Фiшeра. Biдмiнностi вважали вiрогiдними при
загальноприйнятiй у медико-бюлопчних дослiдженнях iMOBipHOCTi помилки p<0,05.
Результати дослщжень та Тх обговорення
Проведен дослiдження показали, що з 72 обсте-жених па^ен^в з пщвищеною стертiстю 3y6iB 27 осiб мали I стутнь тяжкостi захворювання (37,5%), II сту-niHb тяжкостi - 39 па^енпв (54,2%), III стутнь тяжкост спостерiгалась у 6 па^енпв (8,3%).
При аналiзi наявностi полiморфiзмy гену матриксноТ металопротеiнази 20 (ММР-20) в 5 екзон g.16250 T>A гетерозиготний генотип ТА було виявлено лише у 1 патента з yсieí кагорти дослiджених, частота зyстрiчаемос-тi - 1,4%, не виявлено па^енпв з гомозиготним варiан-том генотипу за мутантною алеллю.
Розподiл частот генотипiв та алелей гену KLK4 у па^ен^в з пщвищеною стертютю зyбiв в залежност вiд тяжкостi захворювання наведено в таблиц 2 та 3.
Таблиця 2
Розподл частот генотипе полиморфизму g.2142 G>A гену KLK4 в залежност! eid ступеня тяжкостi захворювання в групi
пацент/в з пдвищеною стертiстю зубв.
Ступiнь тяжко-стi Стертостi зубiв Генотипи р
GG, %(n) GA, %(n) AA, %(n) (I-II) (II-III) (I-III)
I (n=27) 85,2 (23) 14,8 (4) 0 (0) 0,328 0,163 0,031
II (n=39) 74,8 (28) 23,0 (9) 5,2 (2)
III (n=6) 33,3 (2) 50,0 (3) 16,7 (1)
p - пор1вняння м'ж генотипами GG та GA+AA
Як видно з таблиц 2, при дослщженш полiморфiз-му g.2142 G>A гену KLK4 у па^ен^в з I ступенем пщ-вищеноТ стертости зyбiв частота «дикого типу» генотипу GG складала 85,2% (n=23), гетерозиготного генотипу GA - 14,8% (n=4), мутантний генотип АА - не ви-явлений. У па^ен^в з II ступенем генотип GG зустрь чався з частотою 74,8% (n=28), генотипи GA та АА з частотою 23,0% (n=9) та 5,2% (n=2), вщповщно. У 6 пацiентiв з III ступенем пщвищено'Т стертостi зyбiв ча-
стота генотитв гену KLK4 була наступною: GG -33,3% (n=2), GA - 50% (n=2), АА - 16,7% (n=2). Наведен данi доводять, що в груп з I ступенем пiдвищеноï стертости зубiв превалюють пацieнти з «диким типом» генотипу GG, а в груп з III ступенем - па^енти з генотипами GA та АА. Тобто, мiж частотами генотитв GG та генотитв GA та АА гену KLK4, даних груп, була ви-явлена рiзниця на рiвнi статистичноТ значущостi (х2 =4,64; р=0,031).
Таблиця 3
Розподл частот алелiв полiморфiзму g.2142 G>A гену KLK4 в залежностi eid ступеня тяжкот захворювання в груп
naijeHmie з пдвищеною стертiстю зубв.
Ступшь тяжкосл стертосл 3y6ÍB Алелi Р
G, %(n) A, %(n) (I-II) (II-III) (I-III)
I (n=27) 92,6 (50/54) 7,4 (4/54) 0,195 0,103 0,008
II (n=39) 83,3 (65/78) 16,7 (3/78)
III (n=6) 58,3 (7/12) 41,7 (5/12)
p - порiвняння м!ж алелями G та A.
Алель G в групах па^етчв з I та II ступенем пщ-вищено'Т стертост зyбiв зyстрiчалась з частотою 92,6% та 83,3%, вщповщно, а алель А - 7,4% та 16,7%, вщповщно, що не мало статистично значущо'Т вщмЫностг В груп па^етчв з III ступенем пщвищено'Т стертости зyбiв алель А зуст^чалась достовiрно час-тiше в порiвняннi з групою пацiентiв з I ступенем пщвищено'Т стертости зyбiв (х2 =4,64; ВШ=8,93; ДК95%)=1,92-41,41; р=0,008) (табл.3).
Таким чином, мiж частотами генотипiв груп па^ен-^в з I та II ступенем тяжкост статистично вiрогiдноí рiзницi не виявлено, при порiвняннi генотипiв GG та GA+АА гену KLK4 [14,15]. Не виявлено також вiрогiд-но' рiзницi мiж пацiентами II та III груп за даними генотипами. Але по розподту частот генотитв GG та GA+АА та алелiв G та А мiж групою пацiентiв з I ступенем та па^етчв з III ступенем пщвищено' стертостi зyбiв встановлено вiрогiднi вiдмiнностi, при р<0,05. Саме у носив алелi A полiморфiзмy g.2142 G>A гену KLK4 спостер^аються бiльш тяжкi прояви пiдвищеноí стертост зyбiв.
З yсiеí когорти дослщжених, незалежно вiд ступеня тяжкост пiдвищеноí стертостi зyбiв, в 98,6% зу-стрiчаеться «дикий тип» генотипу гену ММР-20 та лише у 1 патента, саме з тяжким III ступенем пщвище-но' стертосп зyбiв, спостерiгаеться наявнiсть мутант-но' алелi А полiморфiзмy g.16250 T>A гену ММР-20. Отриманi дан спiвпадають з даними лiтератyри про досить низьку частоту зуст^чаемосп дано' мутацп та и асоцiацií з деструктивними змiнами тканин зyбiв [16].
До тепершнього часу неможливо встановити сильного кореляцмного зв'язку мiж прогресуючою втра-тою твердих тканин зyбiв i будь-яким одним ендо - чи екзогенним фактором. Прям^ середньо' сили зв'язки з низкою чинниш указують на полiетiологiчнiсть пато-логiчного стирання твердих тканин зyбiв. При цьому мiсцевi чинники, як фiзiологiчнi, так i патологiчнi, в ро-лi абразивного фактора, дючи на ерозiйнy поверхню зyбiв, унаслщок розладiв у окремих системах оргашз-му здатнi призвести до надмiрноТ втрати твердих тканин.
Таким чином, отриман нами данi пiдтверджyють зв'язок мiж наявнiстю полiморфноí алелi А гену KLK4 з пiдвищеною стертютю зyбiв. Ц данi дозволяють роз-глядати даний полiморфiзм в якост додаткового про-гностичного показника надмiрноТ втрати твердих тканин зyбiв.
Отже, виявлення мутантно' алелi А гену KLK4 дае змогу цтеспрямовано проводити профiлактикy та ль кування па^ен^в з пiдвищеною стертiстю зyбiв.
Л1тература
1. Каламкаров Х.А. Ортопедическое лечение патологической стираемости твердых тканей зубов / Х.А. Калам-
каров - М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 176 с.
2. Кобелева В.И. Распространенность некоторых некариозных поражений зубов у взрослого городского населения / В.И. Кобелева // Основные стоматологические заболевания. - М., 1981. - С.70-72.
3. Лебедева Г. К. Повышенное истирание зубов у людей старшей возрастной группы / Г.К. Лебедева, А.Н. Пак // Стоматология. -1991. - № 3. - С.13-15.
4. Баля Г. Н. Степень нарушения в жевательном аппарате при генерализованных формах патологического стирания зубов, осложненных дефектами зубных рядов / Г. Н. Баля // Укра'шський стоматолопчний альманах. - 2006. - № 1. - С. 11-14.
5. Рубежова Н.В. Особенности клинического лечения и лечения больных с эрозиями, клиновидными дефектами и повышенной стираемостью зубов: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.21 / Н.В. Рубежова; Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования. - Санкт-Петербург, 2000. - 21с.
6. Ткаченко 1.М. Структуры особливост емалi при пщви-щенш i фiзiологiчнiй стертост зубiв / 1.М. Ткаченко // Укра'шський стоматолопчний альманах. - 2011. - №6. -С.15-21.
7. Koussoulakou D.S. A Curriculum Vitae of Teeth: Evolution, Generation, Regeneration / Koussoulakou D.S., Margaritis L.H., Koussoulakos S.L. // Int. J. Biol. Sci.- 2009. - Vol.5, N 3. - P. 226-243.
8. Mouse models of tooth abnormalities / J. Fleischmannova, E. Matalova, A.S. Tucker , P.T. Sharpe // Eur J Oral Sci. -2008. - Vol.116, N 1. - P.1-10.
9. Mostowska A. Molecular basis of non-syndromic tooth agenesis: mutations of MSX1 and PAX9 reflect their role in patterning human dentition / Mostowska A., Kobielak A., Trzeciak W.H. // Eur J Oral Sci. - 2003. - Vol. 111, N 5. -P.365-370.
10. The genetic basis of inherited anomalies of the teeth. Part 2: syndromes with significant dental involvement / I. Bail-leul-Forestier, A. Berdal, F. Vinckier et al. // Eur J Med Genet. - 2008. - Vol.51, N 5. - P.383-408.
11. Functions of KLK4 and MMP-20 in dental enamel formation. / Lu Y, Papagerakis P, Yamakoshi Y, Hu JC, Bartlett JD, Simmer JP. // Biol Chem. 2008 Jun;389(6):695-700.
12. Международная классификация стоматологических болезней на основе МКБ 10 // ВОЗ. - Женева, 1997. -81 с. Методы, и программы профилактики основных стоматологических заболеваний // ВОЗ. - Женева, 1989. - 47с.
13. Мустатаева, М.Т. Обоснование общих принципов стандартизации; клинических вариантов диагностики и лечения заболеваний в стоматологии / М.Т. Мустатае-ва, О.М. Мирзабеков, Т.К. Сужеев и др. // Проблемы стоматологии. - 2001. - №3(13).
14. Expression, structure, and function of enamel proteinases. /Simmer JP, Hu JC.// Connect Tissue Res. 2002. - Vol. 43(2-3) - Р.441-9.
15. Kallikrein-related peptidase 4, matrix metalloproteinase 20, and the maturation of murine and porcine enamel. / Hu Y, Hu JC, Smith CE, Bartlett JD, Simmer JP.// Eur J Oral Sci. 2011 Dec;119 Suppl 1:217-25. doi: 10.1111/j.1600-0722.2011.00859.
16. Ozdemir D. MMP20 Active-site Mutation in Hypomaturation Amelogenesis Imperfecta /, P.S. Hart, O.H. Ryu, S.J. Choi, M. Ozdemir-Karatas, E. Firatli, N. Piesco, and T.C. Hart //J Dent Res. - 2005. - Vol. 84, N11. - P. 1031-1035.
TOM 16. N 5-6 2012 P.
Summary
GENE POLYMORPHISM KALEKREIN-4 AND MATRIX METALLOPROTEINASES-20 WAS ASSOCIATED WITH INCREASED WEAR OF THE TEETH
I.M. Tkachenko, O. A. Shlykova, I. P. Kaidashev
Key words: enamel mineralization, increased stertist teeth, polymorphism, matrix metalloproteinase, kalekrein.
Increased wear of the teeth, according to many scientists, is the pathology, the prevalence of which is 8 to 30% in patients of different age groups. This pathology is seen as polietiologichesky progressing process, without the possibility of regeneration, which is accompanied by a number of morphological, aesthetic and functional disorders and is able to significantly reduce the quality of life of patients. Investigated the presence of polymorphisms of genes kallekreina 4 (KLK4) in exon 4 g.2142 G> A (AF228497) and matrix metalloproteinase - 20 (MMP-20) in exon 5 g. 16250 T> A (NT033899.6) in 72 patients with abrasion teeth I-III degree: men 30, women 42. The patients' ages ranged from 20 to 62 years. Significant difference frequency distribution of genotypes GG and GA + AA and A and G alleles between the group of patients with Grade I and III patients with a high degree of abrasion of teeth (p <0.05). It is in the carriers of allele A polymorphism g.2142 G> A gene KLK4 observed more severe manifestations of increased abrasion of teeth. These data allow us to consider this polymorphism as an additional predictor of excessive loss of dental hard tissues.
Higher State Educational Establishment of Ukraine "Ukrainian Medical Stomatological Academy", Poltava
Mamepian Hadiumoe do pedaKuil 21.11.2012 p.
