CC BY
13
© Скрипник В. М., Аветiков Д. С., Шликова О.А., Кайдашев I. П. УДК 575.191+616-003.92
П0Л1М0РФ13М ГЕНУ ЕЛАСТИНУ д28197Д>Б ВИЗНАЧАЕ СХИЛЬН1СТЬ ДО УТВ0РЕННЯ ПАТ0Л0Г1ЧНИХ РУБЦ1В
Скрипник В. М., Аветшов Д. С., Шликова О А., Кайдашев I. П. ВДНЗУ "УкраТнська медична стоматолопчна академ1я», м. Полтава
Эластин является основным компонентом экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) кожи. Любые структурные, наследственные или приобретенные дефекты и / или нарушения обмена веществ в ЭЦМ могут вызвать клеточные и тканевые изменения, приводящие к развитию или прогрессированию заболевания. С целью определения участия генетических факторов в процессе патологического рубцевания ран изучали полиморфизм g28197A>G в 20 экзоне гена эластина в группах больных, склонных к образованию патологических рубцов, расположенных в функционально активных зонах лица и шеи, и не склонных к образованию патологических рубцов. Обследовано 38 пациентов в возрасте от 18 до 65 лет, находившихся на стационарном и амбулаторном лечении после плановых хирургических вмешательств по поводу различных заболеваний, первичной хирургической обработки ран в разных топографо-анатомических областях головы и шеи. По анамнестическими данными и клиническими наблюдениями за процессом рубцевания ран больные были разделены на группы: больные с наличием патологических рубцов (основная группа (п = 18)), что чаще всего расположены в функционально активных зонах лица и шеи, и больные, не имеющие патологических рубцов (группа сравнения (п = 20)). Анализ аллельных частот показал, что аллель G достоверно чаще встречалась в группе больных, склонных к образованию патологических рубцов (х2 = 5,19, р = 0,023). Выявлено достоверную зависимость между наличием полиморфного алле-ля G и повышенным риском образования патологических рубцов (ВШ = 3,58, 95% ДИ = 1,3-9,87, р = 0,023). Рассматривая полученные результаты возможно предположить, что наличие у больного мутантной аллели G при миссенс мутации g28197A G в гене ЕЬЫявляется одним из факторов развития склонности к образованию патологических рубцов в процессе рубцевания ран.
Ключевые слова: полиморфизм, гена эластина, патологические рубцы
В тепершнш час значн устхи генетики, розшиф-ровка структури геному людини, дозволили досягти бтьшого прогресу у розумшш природи i мехашзму виникнення ряду патолопчних процеав. Одним iз су-часних пiдходiв до ранньоТ дiагностики патолопчних змЫ шгари, формування прогнозу, визначення пока-зання для окремих препара^в i вибору правильноТ лкувально'Т тактики е пошук генетичних детермЫант розвитку структурних змЫ компонент екстрацелю-лярного матриксу, а саме еластину [1, 2].
Еластин е бток, що вщповщае за характеры пру-жн властивост багатьох тканин. Еластичнють шгари, легешв i великих кровоносних судин залежить вщ еластичних волокон в позакгмтинному матриксг Вони складаються з аморфних i мiкрофiбрилярних компонент, а аморфний компонент, що включае до 90% зртого еластичного волокна, складаеться з еластину. Людський ген еластину (Е1Ы) розмiром 45 кб знахо-диться на 7q11.2 хромосомi i складаеться з 34 екзоыв [3, 4].
На сьогодн багатьма дослщженнями пщтвердже-но, що в результат порушення [5], внутршньогенних делецм [6] або точкових мутацм [7] в ген еластину, розвиваються тага захворювання як суправальвуляр-ний аортальний стеноз (SVAS), субарахнощальы ане-вризми [8], це е одним iз фаюгрв розвитку хрошчного обструктивного захворювання легень [9]. Показано, що мутацп в геш еластину можуть вщповщати за порушення пружност в системi еластичних волокон шкь ри [10].
Еластин е основним компонентом екстрацелюляр-ного матриксу (ЕЦМ) шгари. Будь-якi структурнi, спад-га^ чи набутi дефекти i / або порушення обмшу речо-вин в ЕЦМ можуть викликати штинш i тканиннi змiни,
що призводять до розвитку або прогресування захворювання [11].
Було показано, що EЦM активно бере участь в кль тинних i позаштинноих подiях, якi призводять до фiб-розу. Фiброз характеризуеться надмiрним накопичен-ням коллагену, еластину та шших компонент поза-клiтинного матриксу, i цей процес можна було б порь вняти з аберантним загоенням ран. Нацтення ви-вчення компонентiв EЦM на те, як клiтини реагують на пошкодження i запальнi стимули, е перспективним в якост засобу для запоб^ання розвитку фiброзу i на-правлення процесу загоення ран на вщновлення здорово' рiвноваги [12].
З метою визначення участ генетичних чинникiв в процесi патолопчного рубцювання ран вивчали поль морфiзм g28197A>G в 20 екзонi гену еластину у трупах хворих, що схильн до утворення патолопчних ру-бцiв, що розташованi у функцюнально активних зонах обличчя та шиТ, та не схильних до утворення патолопчних руб^в.
Матерiали та методи досл1дження
Обстежено 38 па^ен^в вiком вiд 18 до 65 рогав, що знаходилися на стацюнарному i амбулаторному лiкуваннi пюля планових хiрургiчних втручань з приводу рiзних захворювань, первинноТ хiрургiчноТ обро-бки ран у рiзних топографо-анатомiчних дiлянках го-лови та шиТ на базi ПолтавськоТ обласноТ клiнiчноТ ль карнi iм. Скшфосовського у вiддiленнi щелепно-лицевоТ хiрургiТ та 3-оТ мiськоТ лiкарнi м. Полтави з 2008 року по 2012 рк. За анамнестичними даними та клУчними спостереженнями за процесом рубцювання ран хворi були розподтеы на групи: хворi з наявнь стю патологiчних рубцiв (основна група (п=1 8)), що найчастше розташованi у функцiонально активних зонах обличчя та шиТ, та хвор^ що не мають патолоп-
Том 16. N 5-6 2012 р.
чних рубцю (група порiвняння (n=20)). Згщно класифь кацп РезниковоТ А. G., 1999 [12]. до патолопчних руб-qiB вiдносили гiпертрофiчнi та кело'щш рубцк Досль дження проводили з наданоТ письмовоТ згоди па^ен-TiB на проведення обстеження та ухвали комюп з ети-чних питань та бюетики ВДНЗУ «УкраТнська медична стоматологiчна академiя».
Визначали наявнють полiморфiзмiy гену еластину g28197A>G в 20 екзон (ELN). Проводили дослщження на базi наyково-дослiдного iнститyтy генетичних та iмyнологiчних основ розвитку патологи та фармакоге-нетики ВДНЗУ «УкраТнська медична стоматолопчна академiя».
Матерiалом для дослщження слугувала перифе-рична кров. Геномну ДНК видтяли за допомогою набору «ДНК-експрес» згiдно Ыструкцп фiрми виробника (ООО НПФ «Литех», Росiя).
Мyтантнi та «дикi» типи алелей гену ELN амплiфi-кували за допомогою алель-специфiчноТ полiмеразноТ ланцюговоТ реакцiТ в 35 мкл реакцмноТ сyмiши, що мь стила: 2,5 мкл 10 х Buf для амплiфiкацiТ; 2 мМ хлориду магню; 0,2 мМ кожного dNTP; 2,5 од. ДНК-полiмерази Tag з додаванням по 5 пкмоль специфiч-них праймерiв та по 5 пкмоль специфiчних проб мiче-них флуоресцентними барвниками FAM i R6G з 5'- кь нця i BHQ-1, BHQ-2 з 3'-ганця, вiдповiдно (табл.1).
Таблиця 1
Посл1довнють специф1чних праймер1в та специф1чних проб
Ген Послщовнють
ELN Праймери 5-GGA GTC GGA GGT ATC CCT GG -3' 5-TGA CTA AGG CTC ACG GGA AAT G-3'
Проби (FAM) TG TCC CTG GTG TCG GAG -(BHQ1) (R6G) TG TCC CTA GTG TCG GAG -(BHQ2)
До сумш додавали 20-50 нг геномноТ ДНК обсте-жуваних. Амплiфiкацiю гену ELN проводили на детек-туючому амплiфiкаторi ДТ-322 (ООО „НПО ДНК-Технология", Роая) в режимi реального часу, наступ-ним чином: перший цикл - 950С/2 хвилини; 40 цикгмв -950С/20 секунд; 630С/40 секунд.
Математична обробка отриманих даних проводилась за допомогою стандартного методу варiацiйного аналiзy на персональному комп'кл^ 1ВМ РС Pentium IV. Аналiз резyльтатiв дослiдження здмснювався з використанням програм "Microsoft Excel 2003", "Statistica for Windows. Version 5.0". Результати генетичних дослщжень обробленi статистично з використанням критерю х2 з визначенням вiрогiдностi точним методом Фiшера. Вiдмiнностi вважали вiрогiдними при загальноприйнятiй у медико-бюлопчних дослiдженнях iмовiрностi помилки p<0,05.
Результати та Тх обговорення
Розподiл частот генотитв та алелей полiморфiзмy g28197A>G гену еластину (ELN) в основшй грyпi хво-рих наведено в таблиц 2.
Наявнiсть «дикого типу» генотипу спостер^али у 33,3% хворих основноТ групи, частота гетерозиготного генотипу складала 38,9%, а гомозиготний генотип за мутантною алеллю зyстрiчався у 27,8% хворих даноТ групи.
Таблиця 2
Розподл частот генотитв i алелей полиморфизму g28197A>G гену ELN серед хворих основноТ групи та групи
по^вняння, % (n).
Генотип, алель Основна група (n=18) Група порiвняння (n=20)
1 2 3
АА 33,3 (6) 65,0 (13)
AG 38,9 (7) 30,0 (30)
GG 27,8 (5) 5,0 (1)
А 52,8 (19/36) 80,0 (32/40)
G 47,2 (17/36) 20,0 (8/40)
Частоти алелей А i G складали 52,8% та 47,2%, а ноаями алелей (стввщношення ктькост осiб з даною алеллю до загальноТ ктькосл осiб в грyпi) А i G були 72,2% та 61,1% оаб, вiдповiдно.
Внyтрiшньогрyповий розподiл частот генотитв по-лiморфiзмy g28197A>G гену еластину в основнш грyпi хворих вщповщав теоретично очiкyваномy при рiвно-вазi Хардi-Вайнберга (згiдно значенням х2-^рсона з поправкою 1ейтца и G статистики ) (табл. 3.).
Таблиця 3
Внут^шньогруповий аналiз розподту частот генотитв i алелей полiморфiзму g28197A>G гена ELN
Показник Основна група (n=18) Група по-рiвняння (n=20)
1 2 3
Херсона з поправкою 1ейт-са, df=1 0,5736 0,0068
Значення G статистики (G) 1,10426 0,004
Число ступеыв свободи для G (V) 1,92 0,59
Критичний рiвень значення G для р=0,05 (Ха2(у)) 5,87 2,55
Частота алелю (р) 0,528 0,8
Частота алелю (q) 0,472 0,2
Гетерозиготнiсть, що спо-стерiгаeться (Hobs) 0,3889 0,3
Очiкyвана гетерозиготнють (Hex) 0,4985 0,32
Нормоване вiдхилення Hobs вщ Нех (коефiцieнт Ыбриди-нгу популяцп) (F) 0,2198 2
Адекватне врахування рщкь сних алелей (показник |j) 1,998 0,0625
Частка рщкюних алелей (h) 0,001 1,8
Х2-Пiрсона з поправкою 1ейт-са, df=1 0,5736 0,1
Значення G статистики (G) 1,10426 0,0068
Число ступеыв свободи для G (V) 1,92 0,004
Спостер^ався нерiвномiрний розподт алелей, так як показник адекватного врахування рщкюних алелей меньше двох (м<2), на що також вказував показник частки рщкюних алелей (И>0).
Переважання очкуваноТ гетерозиготностi над ге-терозиготнiстю, що спостерiгаeться, а також позитив-ний коефiцieнт шбридингу свщчили про недостатнiсть гетерозигот при умовi випадкового схрещення i про вщхилення вiд панмiксiТ.
Частота гомозиготного генотипу АА гену Е1Ы в грут порiвняння склала 65%, гетерозиготний генотип АО зустрiчався з частотою 30%, частота мутантного генотипу ОО - 5,0 % (табл. 2.). Алель А зуст^чалась у
80,0%, а алель G у 20,0% хворих даноТ групи. Носшс-тво А алелi визначено в 81,5% oci6, а Т алелi - у 65,8%.
Розподт частот генотипiв полiморфiзму g28197A>G гену еластину серед хворих групи порiв-няння вiдповiдав теоретично очкуваному згiдно i3 законом ХардьВайнберга ( х2=0,0068, df=1) (табл.3.).
При аналiзi нормованого вiдхилення гетерозигот-ностi, що спостерiгаeться (Hobs) вщ очiкуваноТ (Hex) -коэфiцieнт Ыбридшгу популяцiТ (F) - склав менше 0, що вiдображаe наявнiсть незначноТ недостатностi ге-терозигот. Адекватнiсть врахування рщкюних алелей в групi порiвняння достатня та вiдповiдаe нерiвномiр-ному розподту алелей (м<2).
При порiвняннi частот генотипiв АА, AG та GG мiж хворими основноТ групи та групи порiвняння було ви-явлено тенденцiю до вiдмiнностi. Рiвень значущостi, що отриманий точним тестом Фшера складав >0,05 та <0,1 (p= 0,062) (табл. 2).
Aналiз алельних частот показав, що алель G до-стовiрно частiше зустрiчалась в групi хворих, що схи-льнi до утворення патологiчних руб^в (х =5,19, р=0,023) (табл.2.).
Виявлено достг^рну залежнiсть мiж наявнiстю полiморфного алеля G та пiдвищеним ризиком утворення патолопчних руб^в (ВШ = 3,58, 95% Д1 = 1,39,87, р = 0,023).
Розглядаючи отриманi результати можливо при-пустити, що наявнiсть у хворого мутантноТ алелi G при мюенс мутацiТ g28197A>G в геш ELN е одним iз фактсрв розвитку схильностi до утворення патолопчних руб^в в процесi рубцювання ран.
Як вiдомо, еластин спочатку синтезуеться в тро-поеластин, розчинний полтептид з молекулярною масою ~ 72 кДа. Нормальний тропоеластин багатий неполярними амЫокюлотами, якi складають гщрофо-бнi областi, що необхiднi для створення пружноТ влас-тивостi волокон. Дослщження показали, що в разi мь сенс мутацiТ в 20 екзош, яка складаеться з одшеТ нук-леотидноТ замiни g28197A>G, що вщповщае S422G замiщенню у бтку, неполярнi амiнокислоти стають незарядженими, що призводить до змши гщрофобно-CTi тропоеластину. Мiнливiсть в амiнокислотнiй посль довностi може змiнити тропоеластинову конформацю i викликати синтез дефектних еластинових волокон, порушення фiбрiллогенезу та спричинити змшену вщ-повiдь на ферментативну деграда^ю [14].
Таким чином, внаслщок накопичення дефектних волокон тропоеластину, при наявност мутантного алелю G в геш ELN, вщбуваеться порушення рiвнова-ги в структурi ЕЦМ, тому визначення даного полiмор-фiзму е актуальним для проведення профiлактичних заходiв вже на раннiх стадiях загоення пюляоперацм-них ран з метою попередження виникнення патолопчних руб^в.
Лтратура
1. Кайдашев И. П. Эволюционирование и современное состояние фармакогенетических исследований (часть1) / И. П. Кайдашев, О. А. Шлыкова, О. В. Измайлова // Проблеми екологп та медицини. - 2010. - № 5-6. - С. 3-12.
2. Куценко Н. Л. Связь полиморфизмов генов Toll-подобных рецепторов 2 и 4 с аллергическими заболеваниями с повышенными уровнями специфических иммуноглобулинов Е / Н. Л. Куценко, О. В. Измайлова, Л.Э. Веснина, И. П. Кайдашев // Цитология и генетика. - 2012. - № 6. - С. 5966.
3. Indik Z. Alternative splicing of human elastin mRNA indicated by sequence analysis of cloned genomic and complementary DNA / [Z. Indik, H. Yeh, Ornstein-Goldstein N., et all.] // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1987. - Vol. 84. - P. 5680-5684.;
4. P. Brown-Augsburger Functional domains on elastin and microfibril-associated glycoprotein involved in elastic fibre assembly / P. BROWN-AUGSBURGER, T. BROEKELMANN, J. ROSENBLOOM., R. P. MECHAM // Biochem. J. - 1996. -Vol. 318. - P. 149 - 155.
5. Curran M.E. The elastin gene is disrupted by a translocation causing supravalvular aortic stenosis / Curran M.E., Atkinson D.L., Ewart A.K., Morris C.A., Leppert M.F., Keating .T. // Cell. - 1993. - Vol. 73. P. 159-168]
6. Ewart A.K., Jin W., Atkinson D., Morris C.A., Keating M.T. Supravalvular aortic stenosis associated with a deletion disrupting the elastin gene. J. Clin. Invest. 1994;93:1071-1077
7. Tassabehji M., Metcalfe K., Donnai D., Hurst J., Reardon W., Burch M., Read .P. Elastin: genomic structure and point mutations in patients with supravalvular aortic stenosis. Hum. Mol. Genet. 1997;6:1029-1036
8. Ruigrok Y.M. Association of polymorphisms and haplotypes in the elastin gene in Dutch patients with sporadic aneurysmal subarachnoid hemorrhage / Ruigrok YM, Seitz U, Wolterink S, Rinkel GJ, Wijmenga C, Urban Z // Stroke. - 2004. - Vol. 35. - P. 2064 -2068
9. Cho Michael H. Analysis of Exonic Elastin Variants in Severe, Early-Onset Chronic Obstructive Pulmonary Disease / [Michael H. Cho, Dawn M. Ciulla, Barbara J. Klanderman, Craig P. et all.] // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2009. - Vol. 40(6). - P. 751-755.
10. Graul-Neumann L. M. Highly variable cutis laxa resulting from a dominant splicing mutation of the elastin gene / L. M. Graul-Neumann , I. Hausser , M. Essayie , A. Rauch , С. Kraus // Am J Med Genet A. - 2008.- Vol/146A(8). - P. 977983
11. Järveläinen H. Extracellular Matrix Molecules: Potential Targets in Pharmacotherapy / Hannu Järveläinen, Annele Sainio, Markku Koulu, Thomas N. Wight , Risto Penttinen // Pharmacological Reviews. - 2009. - Vol. 61, N. 2. - P. 198223
12. Wight T. N. The extracellular matrix: an active or passive player in fibrosis? / Thomas N. Wight and Susan Potter-Perigo // AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY (Gastrointestinal and Liver Physiology). - 2011. - Vol. 301, N. 6. - P. 950-955
13. Резникова А. Е. Клинико-морфологические особенности, лечение и профилактика рубцов лица и шеи у детей: Ав-тореф. дис. ... канд. мед. наук. — М., 1999.
14. Elastin (ELN) gene point mutation in patients with inguinal hernia / Consuelo Junqueira Rodrigues, Jin Hwan Yoo and Aldo Junqueira Rodrigues Junior // Genetics and Molecular Biology. - 2006. - Vol. 29, N.1. - P. 45-46.
Summary
POLYMORPHISM g28197A>G GENE DEFINES ELASTIN TENDENCY TO FORM SCAR PATHOLOGICAL
Skrypnyk V. M., Avetikov D. S., Shlykova O. A., Kaidashev I. P.
Key words: polymorphism, gene elastin, abnormal scars
Elastin is a major component of the extracellular matrix (ECM) of the skin. Any structural, hereditary or acquired defects and / or metabolism in ECM can cause cell and tissue changes that lead to the development or progression of the disease. To determine the role of genetic factors in the process of pathological scarring wounds studied polymorphism g28197A>G in exon 20 of the gene elastin in groups of patients who are prone to the formation of
TOM 16. N 5-6 2012 P.
pathological scars that are functionally active in the areas of the face and neck, and not prone to the formation of pathological scars. The study involved 38 patients aged 18 to 65 who were in inpatient and outpatient treatment after elective surgical interventions for various diseases, primary surgical treatment of wounds in different topographic and anatomic sites of the head and neck. According to the anamnesis and clinical observations of the process of scarring wounds patients were divided into groups: patients with the presence of pathological scars (study group (n = 18)), which are often situated in functionally active areas of face and neck, and patients with no pathological scarring (comparison group (n = 20)). Analysis of allele frequencies showed that the G allele was significantly more common in patients who are prone to the formation of pathological scars (x2 = 5,19, p = 0,023). A reliable correlation between the presence of polymorphic allele G and increased risk of formation of pathological scars (HS = 3.58, 95% CI = 1,3-9,87, p = 0.023). Considering these results may suggest that the presence of the patient's mutant allele G at misens mutations g28197A>G in the gene ELN is a factor of susceptibility to the formation of pathological scars in the process of scarring wounds.
Higher State Educational Establishment of Ukraine "Ukrainian Medical Stomatological Academy", Poltava
Mamepiaë Hadiumoe do pedaKU,ii 21.11.2012 p.
