CC BY
33
© Дзигуненко А. С., Воронкова О. С., Вшнков А. I. УДК 579.61: 616-078
Дзигуненко А. С., Воронкова О. С., BiHHiKOB А. I.
ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТ1 Б1ОПЛ1ВКОУТВОРЮЮЧИХ ТА НЕУТВОРЮЮЧИХ ПЛ1ВКУ ШТАМ1В ЗОЛОТИСТОГО СТАФ1ЛОКОКУ ДО БАКТЕР1ОФАГ1В
Днiпропетровський нацюнальний унiверситет iM. Олеся Гончара
(м. Днiпро)
Робота виконана у рамках держбюджетно! теми № 1-294-15 «Структурно-функцюналыы особливостi природних мiкробiоценозiв та мехаызми бiологiчноI дiI антимiкробних препара^в».
Вступ. 1снування бактерiй у навколишньому се-редовищi та органiзмi людини вiдбуваeться у складi структурно оргаызованих конгломератiв, оточених захисним полiсахаридним матриксом, знаних як бiоплiвки. Такий стан е основним i надае певн переваги порiвняно з юнуванням у планктоннiй формi [1].
Найбтыш вiдомим плiвкоутворюючим мiкроор-ганiзмом, що викликае ураження людини, е стафг локок [2]. Цi бактерiI активно формуюты бiоплiвки в органiзмi людини i на поверхнi медичного приладдя (катетерiв, протезiв, iмплантатiв).
При юнуваны у плiвцi вiдмiчаетыся пiдвищена стмюсты бактерiй до несприятливих факторiв зо-внiшныого середовища, у тому чи^ до впливу рiз-них антимiкробних агентiв, а також до дм iмунноI системи органiзму-господаря [3,4].
Незважаючи на те, що зараз з'явиласы велика кiлыкiсты робiт, присвячених доогмдженню мiкро-бних бiоплiвок та методiв боротыби з ними, вiдносно мало вивчаетыся вплив рiзних факторiв на бюптвки, що мае на мет розробку заходiв боротыби з ними в клмычних умовах. Дослiдження в цыому напрямку маюты стати основою для подалышого розумiння ас-пек^в взаемодiI клiтин у бiоплiвцi та розробки бтыш ефективних методiв знищення бiоплiвок рiзного по-ходження за допомогою рiзних чинникiв у медициы.
З огляду на це метою роботи було дослщити чутливiсты до лкувалыних препаратiв бактерiофагiв серед плiвкоутворюючих та неутворюючих плiвку штамiв золотистого стафтокока.
Об'ект i методи дослщжень. Дослiдження проводили на базi лабораторiI мiкробiологiI та iмунологiI ДУ «НД1 ГастроентерологiI НАМН Укра1ни» (м. Ды-про).
Об'ектом дослiдження була чутливюты бiоплiвко-утворюючих та неутворюючих плiвку штамiв золотистого стафiлокока до л^валыних фагiв.
З носу та зiву осiб-доброволыцiв було вiдiбрано 54 зразки бюлопчного матерiалу, що мютив грапо-зитивнi коки. Iдентифiкацiю стафтокоюв проводили вiдповiдно до рекомендацм Наказу № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в
клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» [5].
Для визначення здатност1 до формування бю-пл1вки чисту культуру видтеного штаму вис1вали у лунки 6-лункового планшета у ктькост не менше 105 КУО/мл у 2 мл живильного середовища (МПБ). Планшет Ыкубували при +37еС протягом 3 д1б. Якщо у цей перюд формувалася б1опл1вка - поверхневий чи придонний рют у лунц1, що давав пл1вку, яка при видаленн середовища отдала на ст1нках, то штам вважали пл1вкоутворюючим. На один 6-лунковий 1мунолог1чний планшет зазвали по 3 ком1рки для кожного штаму. Вщповщь про здатнють до пл1вко-утворення вважали позитивною, якщо принайми у одн1й лунц1 з трьох формувалася пл1вка протягом 72 годин.
Для визначення чутливост1 штам1в до бактерю-фаг1в використовували метод Ф1шера [6]. Визначення чутливост1 до л1кувальних препарат1в бактер1-офаг1в зд1йснювали для препарат1в «Пюбактерюфаг пол1валентний» (Секстафаг), «!нтест1-фаг» та «Бак-тер1офаг стаф1лококовий р1дкий» (НПП «Микроген», РФ). Враховували наявн1сть та характер зони л1зису у м1сц1 нанесення краплини фагового препарату.
Результати дослщження та Ух обговорення. З дослщженого б1олог1чного матер1алу було видте-но 26 штам1в, як1 1дентиф1кували як належн1 до виду Staphylococcus aureus. Встановлено, що 16 (61,5%) з них утворювали бюпл1вку, 1нш1 10 (38,5%) - не проявили здатност1 до утворення бюпл1вки.
Вивчення чутливост1 до бактер1офаг1в дозволило встановити, що вс1 вони були чутлив1 до фаг1в з яко-го-небудь 1з застосованих л1кувальних препарат1в (Пюбактерюфаг, !нтест1фаг та Бактер1офаг стафто-коковий рщкий). Деяк1 штами проявляли чутливють до вс1х препарат1в, 1нш1 - до окремих (рис.).
Значно! р1зниц1 м1ж чутлив1стю до фаг1в з лку-вальних препарат1в «П1обактер1офаг» та «Бактер1-офаг стаф1лококовий» серед пл1вко- та непл1вко-утворюючих штам1в не виявлено. Близько 80-90% штам1в були чутливими до них. Виняток складало ви-користання препарату «!нтест1-бактер1офаг»: серед пл1вкоутворюючих 1золят1в чутливими було 56,3%, в той час як показник для непл1вкоутворюючих штам1в становив 70%.
Плями л1зису були повними або з бактер1альним ростом, що свщчило про б1льше чи менше вираже-ну чутлив1сть до фаг1в з певних препарат1в. Зливний
Рис. Частота виявлення чутливих до фапв з лiкувальних препаратiв штамiв золотистого стафiлокока.
лiзис вiдмiчали лише для 61,5% штаммв золотистого стафтокока. Iншi штами показували рiст бактерiаль-них колонiй у мiсцi нанесення плями фагового препарата. Зливний лiзис переважно був характерний для неутворюючих плiвку штамiв (80%). У груп плiв-коутворюючих штамiв зливний лiзис зафiксовано для 50% штамiв.
Вiдсутнiсть 100%-го ефекту чутливостi е типо-вим явищем для фаготерапп, адже рецептори на поверхнi бактерiальноI клiтини та рецептори фагiв е варiативними структурами. При використаннi моно-валентних фагiв ефект зазвичай не сягае i 15% для штамiв бактерiй, отриманих з рiзних джерел. Саме тому на сучасному етап дослiджень рекомендуеть-ся [7] використання «фагових коктейлiв», до складу яких входять рiзнi бактерiофаги. Така змшана система дозволить при використанн фагiв досягти бiльшоI ефективностi дм. Слiд вiдмiтити, що одним з недолiкiв фагiв, з-за якого вони поступилися ан-тибiотикам, е висока специфiчнiсть до клiтини господаря. Так, вiрус здатен знищити лише чутливi штами, а тому при дiагностичнiй помилцi (непра-вильне визначення збудника) або при нечутливост штаму бактерiI до даного вiрусу, можливi невдачi терапiI. У цьому сенс антибiотики широкого спектру дИ мають значнi переваги над бактерiофагами: вони
знищують Bci мiкроорганiзми, у тому чи^ i збудника ураження [10]. У той же час серед бактерм зараз швидко поширюеться резистентнiсть до антибюти-KiB [9], а введення нових препара^в у ктыку стае де-далi бтыш обмеженим через 1х високу токсичнюты, низьку ефективнiсты, потребу у великих дозах тощо. Так, з 2000 року i до сыогоднi у ктычну практику було введено всыого 20 нових препаратiв [11]. З цих мiр-куваны використання «фагових коктейлiв» може ви-рiшити питання вузыкого спектру дИ вiрусiв бактерм i наблизити ефективнiсты фагових препара^в до ан-тибiотикiв. Дослiдження ефективност застосування «фагових коктейлiв» [7] показало, що при викорис-таннi 1х для терапiI iнфекцiй у тварин вщбуваетыся достовiрне зниження леталыностi. ^м того, фаги виявляютыся ефективними i проти бiоплiвок навiты антибiотикорезистентних мiкроорганiзмiв, що надае 1м додаткових переваг перед застосуванням антиб^ отикiв [8].
Висновки
1. При дослщжены 54 зразюв бiологiчного мате-рiалу з верхых дихалыних шляхiв у 26 (48%) виявлено S. aureus.
2. Встановлено, що 16 (61,5%) штамiв S. aureus утворювали бiоплiвку.
3. Понад 80% штамiв були чутливими до «Пюбак-терiофагу» та «Бактерюфагу стафiлококового», до «lнтестiбактерiофагу» серед плiвкоутворюючих iзо-лятiв чутливими було 56,3%, в той час як показник для неплiвкоутворюючих штамiв становив 70%.
Перспективи подальших дослiджень. Проблема стафтококового носiйства е однiею з най-бiлыш вiдомих та актуалыних у медичнiй практицi. Носiйство стафтокоюв може обумовлювати велику кiлыкiсты ускладнены, зокрема, виникнення хроыч-них уражены дихалыних шляхiв. Тому iснуе постмна потреба у застосуваннi лiкувалыних засобiв для ви-рiшення проблеми. lнодi застосування антибiотикiв стае обмеженим з-за високого рiвня стiйкостi до них у стафтокоюв, тому застосування бактерюфапв, до яких проявляюты високу чутливюты як плiвко-, так i неплiвкоутворюючi штами золотистих стафiлококiв, може стати ефективним напрямком терапiI.
Лiтература
1. Афиногенова А.Г. Микробные биопленки ран: состояние вопроса / А.Г. Афиногенова, Е.Н. Даровская // Травматология и ортопедия России. - 2011. - № 3. - С. 119-125.
2. Белобородова Н.В. Клиническое значение микробных биопленок / Н.В. Белобородова // Российские медицинские вести.
- 2010. - Т. XV, № 4. - С. 68-72.
3. Гостев В.В. Бактериалыные биопленки и инфекции / В.В. Гостев, С.В. Сидоренко // Журнал инфектологии. - 2010. - Т. 2, № 3. - С. 4-15.
4. Лямин А.В. Проблемы в медицине, связанные с бактериалыными биопленками / А.В. Лямин, Е.А. Боткин, А.В. Жестков // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. - 2012. - Т. 14, № 4. - С. 268-275.
5. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений: приказ № 535. - [чинний вщ 22.04.1985 р.]. - М.: МОЗ СССР, 1985. - 65 с.
6. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов / под ред. С.Г. Дзагурова, Ф.Ф. Резепова. - М: Медицина, 1995. - 116 с.
7. Chan B.K. Phage cocktails and the future of phage therapy / B.K. Chan, S.T. Abedon, C. Loc-Carrillo // Future Microbiol. - 2013.
- Vol. 8 (6). -P. 769-783.
8. Hosseinidoust Z. Formation of biofilms under phage predation: consid erations concerning a biofilm increase / Z. Hosseinidoust, N. Tufenkji, T.G.M. van de Ven // Biofouling. - 2013. - Vol. 29 (4). - P. 457-468.
9. Lloyd D.H. Alternatives to conventional antimicrobial drugs: a review of future prospects / D.H. Lloyd // Veterinary Dermatology. -2012. - Vol. 23 (4). - P. 299-304.
10. Sulakvelidze A. Bacteriophage therapy / A. Sulakvelidze, Z. Alavidze, G. Morris jr. // Antimicrobial agents andchemotherapy. -2001. - Vol. 45 (3). - P. 649-659.
11. Ziemska J. New perspectives on antibacterial drug research / J. Ziemska, A. Rajnisz, J. Solecka // Cent. Eur. J. Biol. - 2013. - Vol. 8 (10). - P. 943-957.
УДК 579.61: 616-078
ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТ1 Б1ОПЛ1ВКОУТВОРЮЮЧИХ ТА НЕУТВОРЮЮЧИХ ПЛ1ВКУ ШТАМ1В ЗОЛОТИСТОГО СТАФ1ЛОКОКУ ДО БАКТЕР1ОФАГ1В
Дзигуненко А. С., Воронкова О. С., Вшшков А. I.
Резюме. Проблема стафтококового носмства е одн1ею з найбтьш вщомих та актуальних у медичнм практицк Носмство стафтокоюв може обумовлювати велику к1льк1сть ускладнень, зокрема, виникнення хроычних уражень дихальних шлях1в. При досл1дженн1 54 зразк1в бюлопчного матер1алу з верхн1х дихальних шлях1в у 26 (48%) виявлено S. aureus. З них 16 (61,5%) штам1в утворювали б1опл1вку. Понад 80% видтених штам1в були чутливими до «Пюбактерюфагу» та «Бактер1офагу стаф1лококового», до «!нтест1бактерюфагу» серед пл1вкоутворюючих 1золят1в чутливими було 56,3%, в той час як показник для непл1вкоутворюючих шта-м1в становив 70%.
Ключов1 слова: золотистий стафтокок, нос1йство, б1опл1вкоутворення, чутливють до фаг1в.
УДК 579.61: 616-078
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩИХ И НЕ ОБРАЗУЮЩИХ ПЛЕНКУ ШТАММОВ ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА К БАКТЕРИОФАГАМ
Дзигуненко А. С., Воронкова О. С., Винников А. И.
Резюме. Проблема стафилококкового носительства является одной из самых известных и актуальных в медицинской практике. Носительство стафилококков может обусловливать большое количество осложнений, в частности возникновение хронических поражений дыхательных путей. При исследовании 54 образцов биологического материала из верхних дыхательных путей в 26 (48%) из них выявлен S. aureus. 16 (61,5%) выделенных штаммов S. aureus образовывали биопленку. Более 80% выделенных штаммов были чувствительны к «Пиобактериофагу» и «бактериофагу стафилококковому», к «интестибактериофагу» среди пленкообразующих штаммов чувствительными были 56,3%, в то время как показатель для не образующих пленку штаммов составил 70%.
Ключевые слова: золотистый стафилококк, носительство, биопленкообразование, чувствительность к фагам.
UDC 579.61: 616-078
DETERMINATION OF SENSITIVITY OF FILM-FORMING AND NON-FILM-FORMING STRAINS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS TO BACTERIOPHAGE
Dzigynenko A. S., Voronkova O. S., Vinnikov A. I.
Abstract. The existence of bacteria in the environment and the human body is composed of structured conglomerates surrounded by a protective polysaccharide matrix, known as biofilms. This status is fundamental and provides certain advantages over the existence of planktonic form. The most famous film-forming microorganisms that causes damage to the human, are staphylococci. In biofilm observed increased resistance of bacteria to adverse environmental factors, including the impact of various antimicrobial agents, and to the action of the immune system of the host, hence the need to search for more effective means against staphylococci, among them the bacteriophages have wide prospects.
The aim of research was to investigate the sensitivity to phages drugs of film-forming and non-film-forming strains of Staphylococcus aureus.
Experiments were made at the Laboratory of microbiology and immunology of SI «Research Institute of Gastroenterology NAMS Ukraine» (Dnipro city).
The object of the study was sensitivity of film-forming and non-film-forming strains of S. aureus to phages drugs. 54 samples of biological material from the nose and throat were studied. Isolation, identification, determination of the ability to form biofilms and sensitivity to phage of studied S. aureus strains were made by standard methods.
From studied biological material 26 strains identified as belonging to the species S. aureus were isolated. It was found that 16 (61.5%) of them had an ability to form biofilm, the remaining 10 (38.5%) - did not show the ability to form film. The study of sensitivity to bacteriophages revealed that they all were susceptible to phage with any of the applicable drugs (Piobacteriophage, Intestiphage and Bacteriophage staphylococcal liquid). Some strains show sensitivity to all drugs, others - to certain of it. A significant difference between the sensitivity to phages of medicinal products «Piobakteriophage» and «Bacteriophages staphylococcal» among film-forming and non-film-forming strains was not found. Approximately 80-90% of strains were susceptible to them. Exception amounted use of the drug «Intestiphage»: among film-forming strains part of susceptible isolates was 56.3%, while among non-film-forming strains - 70%. The lytical spots were complete or have bacterial growth, indicating a more or less pronounced sensitivity to phages from certain drugs. Drain lysis noted only for 61.5% of strains of S. aureus.
Other strains showed growth of bacterial colonies in place of phage preparation application. Drain lysis was mostly typical for a film forming strains (80%). The lack of 100% sensitivity effect is typical in the phage therapy because receptors on the bacterial cell surface and phage's receptors are variable structures. When using monovalent phage effect usually does not reach 15% of bacterial strains obtained from various sources. It is at this stage of the study recommended to use «phage cocktails» comprising different bacteriophages. This mixed system allow the use of phages achieve more effective action, including against antibioticresistant strains.
The problem of staphylococcal carriage is one of the most popular and relevant in medical practice. The carrier of staphylococci can cause a large number of complications, including lesions of chronic airways. Therefore, there is a continuing need in the application of remedies to address the problem. Sometimes use of antibiotics is limited due to the high level of resistance of staphylococci strains to them, so the use of bacteriophages, which exhibit high sensitivity among film-forming and non-film-forming strains of S. aureus may be an effective therapy area.
Keywords: staphylococcus aureus, carrier, biofilmformation, sensitivity to phages.
Рецензент — проф. Лобань Г. А.
Стаття надшшла 01.10.2016 року
