CC BY
33
© Воробей 6. С., Воронкова О. С., ВЫшков А. I. УДК 579.61:616-095
Воробей С. С., Воронкова О. С., BiHHiKOB А. I.
ВПЛИВ СТАФ1ЛОКОКОВОГО БАКТЕР1ОФАГУ НА Б1ОПЛ1ВКИ ШТАМ1В STAPHYLOCOCCUS AUREUS ЧУТЛИВИХ I РЕЗИСТЕНТНИХ ДО ЦЕФОТАКСИМУ ТА АЗИТРОМ1ЦИНУ ЗАЛЕЖНО В1Д Х1М1ЧНОГО СКЛАДУ 1Х МАТРИКСУ
Днiпропетровський нацiональний ушверситет iM. Олеся Гончара (м. Днiпропетровськ)
elizaveta.vorobey@mail.ru
Робота виконана у рамках держбюджетно1 теми №1-294-15 «Структурно-функцюнальы властивостi природних мiкробiоценозiв та мехаызми бiологiчноI дм мiкробних препаратiв».
Вступ. За останнi роки накопичено багато ш-формацiI про бактерiальнi бiоплiвки. Так, показано, що бiоплiвки - це високовпорядкован спiльноти бактерiй, що формуються на бiологiчних або штуч-них поверхнях [13] в результат адгезп, росту i роз-множення мiкроорганiзмiв i утворення позаклггин-ного полюахаридного матриксу, який виробляеться самими мiкробами для захисту. Самi бактери скла-дають лише 5-35% маси бiоплiвки, iнша II частина -це мiжбактерiальний матрикс, який може станови-ти бiльше 90% вщ загального органiчного вуглецю бiоплiвок [11]. Мiкроорганiзми утворюють бiоплiвку як у природ^ так i в органiзмi господаря, що ство-рюе велик проблеми у медичнiй практицi та у рiзних галузях господарсько1 дiяльностi. Особливо це сто-суеться умовно-патогенних бактерм, золотистого стафiлокока, зокрема.
Вщомо, що вiд 67% до 78% кл^чних iзолятiв S. aureus можуть формувати бiоплiвки. Основними структурними компонентами матриксу бiоплiвки золотистого стафтокока е екзополiсахариди, також до складу можуть входити бтки, глiколiпiди i бакте-рiальна ДНК [8,16].
Головним елементом полюахаридного матриксу стафтокоюв е полюахаридний мiжклiтинний адге-зин PIA (Polysaccharide Intercellular Adhesin), який бере участь як у ктмтиннм субстратна адгезп, так i в подальшому формуваннi кJliтинних кJlастерiв. PIA шщюе гемаглютинацiю i перешкоджае фагоцитозу за рахунок активацп бактерiальноI агрегацп [5]. Полiсахаридний матрикс грае важливу роль у фор-муваннi антибютикорезистентност стафiлококiв у складi бiоплiвок. Поверхнева оболонка i компо-ненти матриксу бiоплiвки перешкоджають доступу, зв'язують та шактивують протимiкробнi препарати. Тому зараз актуальним е питання про пошук до-даткових або альтернативних антибютикам засобiв у боротьбi з бактерiальними бiоплiвками. Перспек-тивним у цьому сенс може стати застосування фа-гових лiкувальних препаратiв, якi здмснюватимуть
ефект за рахунок руйнування полюахаридного матриксу кодованими фагами полюахариддепол1ме-разами [14].
Метою роботи було вивчення взаемозв'язку м1ж х1м1чним складом позаклггинного матриксу та впли-вом бактерюфапв на б1опл1вки штам1в S. aureus чут-ливих i резистентних до цефотаксиму та азитром1-цину.
Об'ект i методи дослiдження. Для реалiза-L^iT мети роботи були вобран 2 плiвкоутворюючих штами S. aureus з колекцп культур кафедри мiкро-бiологiT, вiрусологiT та бiотехнологiT Дыпропетров-ського нацiонального унiверситету iм. О. Гончара. Один з них був чутливим до цефотаксиму та азитро-мщину, Ыший - резистентним. Вибiр цих антибюти-кiв був зумовлений тим, що цефотаксим пригычуе синтез клггинноТ стiнки та потенцiйно може пригы-чувати синтез полiсахаридного компоненту матриксу, тодi як азитромщин е блокатором синтезу бiлка та потенцмно може пригнiчувати синтез бткового компоненту матриксу бiоплiвок.
Вплив л^вальних препаратiв бактерiофагiв на процес плiвкоутворення визначали за змiнами кiлькостi клнтин у бiоплiвцi та оптичноТ густини бю-плiвок. Для визначення ктькост клiтин у бiоплiвцi 1 мл суспензи дослiджуваноT культури з вмютом клiтин 1X104 КУО/мл. засiвали у 6-лунковi планше-ти у 1 мл МПБ. В одну з лунок вносили ттьки МПБ (2 мл) i використовували TT як контроль стериль-ностi. Планшети з дослщними зразками iнкубували за температури 37°С протягом 72 годин. На сформовав бiоплiвки вносили 1 мл стандартного препарату бактерюфапв та шкубували ще 24 години. Пюля iнкубацiT з лунок планшету видаляли залиш-ки поживного середовища. Вмiст лунок промива-ли тричi 0,5% iзотонiчним розчином NaCl. По™ у лунки вносили по 1 мл розчину натрiя додецил-сульфату (0,004 моль/дм3) на 15 хв для руйнування мiжкJliтинних зв'язкiв та зв'язку бiоплiвки з поверх-нею пластика. Вмiст лунок вiдбирали та вносили у стерильн пластиковi пробiрки та центрифугували тричi протягом 10 хв при 5000 об/хв. Пюля кожного центрифугування рщку фазу вщбирали та вносили iзотонiчний розчин NaCl. Для визначення кiлькостi
клiтин у бiоплiвцi робили 10-KpaTHÍ розведення (0,1 мл cycneH3ÍI вносили у npo6ipKy з 0,9 мл 0,5% Í30T0HÍ4H0r0 розчину NaCl). ВиЫв робили з кожного розведення на чашки Петрi з МПА по 0,1 мл. ПоЫви iнкубували протягом 24 годин, пщраховували юль-KicTb КУО у 1 мл проби та порiвнювали з кiлькiстю кжтин у необробленiй фагами бiоплiвцi.
Для визначення змши оптично! густини пщ дieю препаратiв бактерiофагiв добову культуру до^джу-ваних штамiв розводили у 0,5% фiзiологiчному роз-чинi за стандартом мутност 1X109 КУО/мл. Отри-ману суспензiю в кiлькостi 50 мкл вносили в лунки 96-лункового планшета, що мiстили 150 мкл м'ясо-пептонного бульйону. Планшети шкубували у тер-мостатi при температурi 37°С 72 години. Фаги додавали на сформован 72-годиннi бюптвки. Через 24 години пiсля внесення фага з лунок видаляли залишки поживного середовища, тричi промива-ли дистильованою водою (по 200 мкл), фксували 96° етиловим спиртом (50 мкл)та фарбували роз-чином кристалiчного фiолетового (50 мкл) протягом 2 хвилин. По™ барвник видаляли та тричi про-мивали дистильованою водою (200 мкл). Оптичну густину визначали на мiкропланшетному фотометрi SUNRISE, Tecan (Австрiя), у режимi вимiрювання «Поглинання», режимi зчитування «Нормальний» та довжинi хвилi 620 нм з використанням програмного забезпечення Magellan.
Для вивчення хiмiчноI будови позакттинного ма-триксу бiоплiвок S. aureus використовували речови-ни, що забезпечують специфiчну деструкцiю рiзних компонентiв матриксу [8,12]. ЗаЫв та iнкубацiю проводили як наведено вище. Пюля 72 годин iнкубацií з лунок видаляли залишки поживного середовища, додавали 50 мкл розчину фермен^в: протешазу К (Amresco, США) та ДНКазу (Fermentas, Литва) у кон-центраци 250 мкг/мл, трипсин (Merck Farma, Ымеч-чина) - у концентраци 250 мкг/мл та 50 мкл розчину перюдату натрiя (натрiя йоднокислого мета) у концентраци 40 мМ. Бiоплiвки з ферментами шкубували 60 хв за температури 37°C. У якостi контролю використовували Tris-Cl-буфер (pH 7,5) без фермен^в. Бiоплiвки з перiодатом натрiя шкубували 23 год при 4°С. У якост контроля використовували дистильо-вану воду. Пюля шкубаци з лунок видаляли речови-ни-деструктори, тричi промивали дистильованою водою (по 200 мкл), фксували 96° етиловим спиртом (50 мкл) та фарбували розчином кристалiчного фю-летового (50 мкл) протягом 2 хвилин. По™ барвник видаляли та тричi промивали дистильованою водою (200 мкл). Оптичну густину визначали на мiкроплан-шетному фотометрi SUNRISE, Tecan (Австрiя), у ре-жимi вимiрювання «Поглинання», режимi зчитування «Нормальний» та довжин хвилi 620 нм з використанням програмного забезпечення Magellan. Резуль-тати виражали у процентах вщносно контрольних зразюв [2].
Статистичну обробку результатiв проводили для рiвня значущостi 0,05 з використанням програм Origin Lab Pro 7.0.
Результати дослщжень та 'Гх обговорення.
При вивченн впливу препарату «Бактерюфаг стаф^ лококовий рiдкий» на 72-годинн бiоплiвки до^джу-
ваних штамiв було визначено, що для чутливого до цефотаксиму та азитромщину штаму спостертало-ся зменшення оптично! густини елюйованого 72-го-динною бiоплiвкою барвника на 19,1%, тодi як юлы-юсты клiтин у бiоплiвцi зменшувалася у 253,0 разiв. Для бiоплiвок резистентного до цефотаксиму та азитромщину штаму визначали бтыший вплив ста-фтококового бактерiофагу, вiн призводив до зни-ження оптично! густини на 33,9%, юлыюсты клiтин при цыому зменшувалася у 393,6 разiв.
Видалення зртих бiоплiвок е головним завдан-ням терапи, оскiлыки саме такi плiвки е основою па-тогенетичного процесу. Здатнюты матриксу активно зв'язувати i уповiлынювати дифузiю антибiотикiв крiзы бiоплiвку призводиты до неповного усунення мiкроорганiзмiв, що у свою чергу сприяе !х вижи-ванню i формуванню хронiчних процесiв [1]. Вплив на стафiлококовi бiоплiвки може бути спрямова-ний на руйнування позаклiтинного полюахаридного матриксу. Подiбне лiкування, що мае впливати на структуру бiоплiвки, е бтыш ефективним нiж стандартна антибактерiалына терапiя. Ще Ооо!11:1:!е та шшм [9] у 1996 р. описали, що потомство фага по-ширюетыся радiалыно вздовж всiе! бiоплiвки, зара-жаючи сусiднi клiтини i руйнуючи матрикс бiоплiвки. Для цыого фаги виробляюты деполiмерази, якi здатн руйнувати матрикс бiоплiвок [3,7], що в значнм мiрi залежиты вщ структури полiмерного матриксу. Тому важливим етапом нашого дослiдження було вивчення бiохiмiчного складу полiмерного матриксу стаф^ лококових бiоплiвок.
Вивчення природи матриксу бiоплiвок базувало-ся на специфiчнiй деструкцi! рiзних його компонен-тiв. Для визначення у складi бiоплiвок частки екзо-полiсахаридiв застосовували обробку сформованих 72-годинних плiвок перюдатом натрiя. Було вияв-лено, що пюля не! вщбувалося зменшення оптично! густини елюйованого барвника на 47,00 ± 2,87% для чутливого до антибютиюв штаму та 59,02 ± 2,10% -для резистентного.
Для визначення наявност бтюв у складi матриксу використовували проте!назу К та трипсин. Вста-новлено, що пiсля внесення на 72-годинну бiоплiвку проте!нази К показники оптично! густини елюйованого барвника, що затримувався бiоплiвкою, зни-жувалися на 8,52 ± 1,72% вщ контролю 72-годинно! бiоплiвки без внесення ферменту для чутливого до антибютиюв штаму та на 3,52 ± 1,11% - для резистентного. При внесены трипсину зниження показни-юв оптично! густини елюйованого барвника також було невеликим - 12,16 ± 1,49% для чутливого до антибютиюв штаму та на 7,20 ± 2,12% - для резистентного.
Також визначали вмют у матрикс позаклмтин-но! ДНК. Для цыого до вже сформовано! 72-годин-но! бiоплiвки вносили фермент ДНК-азу. Було показано зменшення оптично! густини бiоплiвок на 15,72 ± 2,55% вщ контролю 72-годинно! бiоплiвки без внесення ферменту для чутливого до антибютиюв штаму та на 14,50 ± 1,33% - для резистентного (рис.).
Порiвнюючи отриман резулытати з вщомими даними [8,21], можна припустити, що матрикс до-
необроблена пл1вка ДНКаза трипсин проте'шаза К перюдат натр1я
10 20 30 40 50 60 70 80 зниження оптично! густини, %
90
100
В штам резистентний до цефотаксиму та азитромщину 0 штам чутливий до цефотаксиму та азитромщину
Рис. 1нтенсившсть впливу специфiчних речовин-деструкторiв на матрикс у порiвняннi з контролем необроблено'Г бiоплiвки.
слщжених стафiлококових бiоплiвок складаеться пе-реважно з полюахаридного матерiалу, який мютить ДНК i домiшки бiлкiв. Це не суперечить лтературним даним [10,11,18,19], в яких вказуеться на юнування штамiв S. aureus з рiзними типами матриксу.
У рядi доотджень взаемодiT фага i бiоплiвок показано здатнють фага руйнувати екзополюахариди бiоплiвки i заражати кJliтини бiоплiвки [6]. Ще Adams and Park [4] у 1956 рощ запропонували використо-вувати фаговi полiсахаридцеполiмерази для руйну-вання бактерiйних екзополiсахаридiв. Ц ферменти приеднанi до фаговоT базально'| пластинки у виглядi шипiв [15]. Капсульний матерiал може служити вто-ринним рецептором i забезпечувати зв'язування фага, поки йде розчинення полiмеру, а по™ фаг отримуе можливють досягти зовнiшньоT оболонки клiтини, зв'язатися з рецептором та Ыфкувати клм-тину. В подальшому ряд авторiв [17,20] пщтверди-ли, що геном бактерюфага мiстить гени, експресiя яких приводить до синтезу специфiчних руйнуючих ферментiв - полiсахариццеполiмераз, що пщвищуе мобiльнiсть бактерiофагiв при контактi з полiмерною субстанцiею. Фаги, якi використовують позаклiтиннi деполiмерази, руйнують достатню частину матриксу, щоб зробити уразливими занурен в бiоплiвки бактерiT.
Тому, визначення домшуючо'| кiлькостi екзопо-лiсахаридiв у матриксi дослiджених бiоплiвок i в^ домостi про кодування фагами фермен^в депол^ мераз, якi руйнують полюахари у скJlадi матриксу, дозволяють припустити, що виявлений вплив на бю-плiвки золотистого стафiлококу був спровокований саме цим способом.
Висновки
Встановлено, що для чутливого до цефотаксиму та азитромщину штаму при обробц бiоплiвок пе-
рiодатом натрiя спостерiгали зменшення оптично! густини елюйованого барвника на 47,00 ± 2,87%, а для резистентного - 59,02 ± 2,10% порiвняно з контролем необроблено'| бiоплiвки. При обробцi бiоплiвок протеTназою К оптична густина знижува-лася на 8,52 ± 1,72% для чутливого штаму та 3,52 ± 1,11% - для резистентного, а при обробц трипсином - на 12,16 ± 1,49% та 7,20 ± 2,12% вщповщ-но. Обробка ДНКазою призводила до зменшення оптично'| густини на 15,72 ± 2,55% та 14,50 ± 1,33%. Це свщчить, що основним компонентом у складi матриксу бiоплiвок дослщжених штамiв е екзопол^ сахариди, причому Tx кiлькiсть на 12,02% вище у резистентного до антибютиюв штаму. Крiм того, при внесены стафтококового бактерiофагу на бiоплiв-ки дослщних штамiв вiдмiчали зниження оптично': густини елюйованого барвника на 19,1% та кть-костi кJliтин у бiоплiвцi до 253,0 разiв для чутливого до антибютиюв штаму i на 33,9% та 393,6 разiв вiдповiдно - для резистентного. З чого можна зробити висновок про залежнють штенсивнос^ впливу препара^в бактерiофагiв на бiоплiвки до^джених штамiв S. aureus вiд юлькос^ екзополiсаxаридiв у складi Tx матрикса.
Перспективи подальших дослiджень
Отриманi результати свщчать про ефективнiсть використання л^вальних препаратiв бактерiофагiв для контролю росту бiоплiвок штамiв золотистого стафiлокока, матрикс яких складаеться з велико! юлькос^ екзополiсаxаридiв.
З метою пригнiчення утворення бiоплiвок необ-xiдним е дослщження взаемозв'язку складу матриксу з чутливютю до антибiотикiв та пошук лкувальних препаратiв, здатних iнгiбувати продук^ю екзополi-саxаридiв.
0
Л^ература
1. Биопленки патогенных бактерий и их роль в хронизации инфекционного процесса. Поиск средств борьбы с биопленками /
Ю. М. Романова, Л. В. Диденко, Э. Р. Толордава [и др.] // Вестник РАМН. - 2011. - № 10. - С. 31-39.
2. Современные технологии исследования бактериальных биопленок / И. В. Чеботарь, А. Г. Погорелов, В. А. Яшин [и др.] //
Современные технологии в медицине. - 2013. - Т. 5, № 1. - С. 14-20.
3. Abedon S. T. Ecology of anti-biofilm agents II: bacteriophage exploitation and biocontrol of biofilm bacteria / S. T. Abedon // Phar-
maceuticals. - 2015. - Vol. 8, № 3. - P. 559-589.
4. Adams M. H. An enzyme produced by a phage-host cell system II. The properties of the polysaccharide depolymerase / M. H. Ad-
ams, B. H. Park // Virology. - 1956. - Vol. 2, № 6. - P. 719-736.
5. Bacterial extracellular polysaccharides involved in biofilm formation / B. Vu, M. Chen, R. J. Crawford [et al.] // Molecules. - 2009. -
Vol. 14, № 7. - P. 2535-2554.
6. Bacteriophage and associated polysaccharide depolymerases - novel tools for study of bacterial biofilms / K. A. Hughes, I.W. Suther-
land, J. Clark [et al.] // Journal of Applied Microbiology. - 1998. - Vol. 85, № 3. - P. 583-590.
7. Chan B. K. Bacteriophages and their enzymes in biofilm control / B. K. Chan, S. T. Abedon // Current Pharmaceutical Design. -
2015. - Vol. 21, № 1. - P. 85-99.
8. Differential roles of Poly-N-acetylglucosamine surface polysaccharide and extracellular DNA in Staphylococcus aureus and Staph-
ylococcus epidermidis biofilms / E. A. Izano, M. A. Amarante, W. B. Kher [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. -2008. - Vol. 74, № 2. - P. 470-476.
9. Doolittle M. M. Tracing the interaction of bacteriophage with bacterial biofilms using fluorescent and chromogenic probes /
M.M. Doolittle, J. J. Cooney, D. E. Caldwell // Journal of Industrial Microbiology. - 1996. - Vol. 16. - P. 331-341.
10. Extracellular DNA in biofilms / L. Montanaro, A. Poggi, L. Visai [et al.] // The International Journal of Artificial Organs. - 2011. -Vol. 34, № 9. - P. 824-831.
11. Flemming H.-C. The biofilm matrix / H.-C. Flemming, J. Wingender // Nature Reviews Microbiology. - 2010. - Vol. 8, № 9. - P. 623633.
12. Frank K. L. Poly-N-Acetylglucosamine is not a major component of the extracellular matrix in biofilms formed by icaADBC-positive Staphylococcus lugdunensis isolates / K. L. Frank, R. Patel // Infection and Immunity. - 2007. - Vol. 75, № 10. - P. 4728-4742.
13. How Staphylococcus aureus biofilms develop their characteristic structure / S. Periasamy, H.-S. Joo, A. C. Duong [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2012. - Vol. 109, № 4. - P. 1281-1286.
14. Kutateladze M. Bacteriophages as potential new therapeutics to replace or supplement antibiotics / M. Kutateladze, R. Adamia // Trends in Biotechnology. - 2010. -Vol. 28, № 12. - P. 591-595.
15. Lindberg A. A. Bacterial surface carbohydrates and bacteriophage adsorption / A. A. Lindberg // Surface Carbohydrates of the Prokaryotic Cell / ed. I. W. Sutherland. - London: Academic Press, 1977. - P. 289-356.
16. Protein A-mediated multicellular behavior in Staphylococcus aureus / N. Merino, A. Toledo-Arana, M. Vergara-Irigaray [et al.] // Journal of Bacteriology. - 2009. - Vol. 191, № 3. - P. 832-843.
17. Scholl D. Polysaccharide-degrading phages / D. School, C. Merril // Phages: their role in bacterial pathogenesis and biotechnology / eds. M. K. Waldor, D. I. Friedman, S. L. Adhya. - Washington DC: ASM Press, 2005. - P. 400-414.
18. Susceptibility of staphylococcal biofilms to enzymatic treatments depends on their chemical composition / P. Chaignon, I. Sadovs-kaya, Ch. Ragunah [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2007. - Vol. 75, № 1. - P. 125-132.
19. The anchorless adhesin Eap (extracellular adherence protein) from Staphylococcus aureus selectively recognizes extracellular matrix aggregates but binds promiscuously to monomeric matrix macromolecules / U. Hansen, M. Hussain, D. Villone [et al.] // Matrix Biology. - 2006. - Vol. 25, № 4. - P. 252-260.
20. The interaction of phage and biofilms / I. W. Sutherland, K. A. Hughes, L. C. Skillman [et al.] // FEMS Microbiology Letters. - 2004. -Vol. 232, № 1. - P. 1-6. - Mode of access: www.fems-microbiology.org.
21. Wall teichoic acids are dispensable for anchoring the PNAG exopolysaccharide to the Staphylococcus aureus cell surface / M. Ver-gara-Irigaray, T. Maira-Litran, N. Merino [et al.] // Microbiology. - 2008. - № 154, № 3. - P. 865-877.
УДК 579.61:616-095
ВПЛИВ СТАФ1ЛОКОКОВОГО БАКТЕР1ОФАГУ НА Б1ОПЛ1ВКИ ШТАМ1В STAPHYLOCOCCUS AUREUS ЧУТЛИВИХ I РЕЗИСТЕНТНИХ ДО ЦЕФОТАКСИМУ ТА АЗИТРОМ1ЦИНУ ЗАЛЕЖНО В1Д Х1М1ЧНОГО СКЛАДУ "IX МАТРИКСУ
Воробей 6. С., Воронкова О. С., Вшшков А. I.
Резюме. При до^джены складу матриксу бiоплiвок штамнв S. aureus визначено, що при обробц пл^ вок перюдатом натрiя оптична густина елюйованого барвника знижувалася на 47,00 ± 2,87% для чутливо-го до цефотаксиму та азитромщину штаму та 59,02 ± 2,10% - для резистентного, що вказуе на переваж-ний вмют екзополiсахаридiв i совпадав з найбтьшим впливом на бiоплiвки стафтококового бактерюфагу (зниження оптично! густини на 19,1% та юлькост кл™н у 253,0 рази для чутливого до антибютиюв штаму i на 33,9% та 393,6 рази вщповщно - для резистентного). При обробц бiоплiвок проте!назою К оптична густина знижувалася на 8,52 ± 1,72% для чутливого штаму та 3,52 ± 1,11% - для резистентного, а при об-робц трипсином - на 12,16 ± 1,49% та 7,20 ± 2,12% вщповщно. Обробка ДНКазою призводила до змен-шення оптично! густини на 15,72 ± 2,55% та 14,50 ± 1,33%. Це свщчить, що штенсивнють впливу фагового препарату на бiоплiвки до^джених штамiв S. aureus залежала вщ юлькост екзополюахариду у складi !х матриксу.
Ключовi слова: стафтококи, бiоплiвка, матрикс, екзополюахариди, оптична густина.
УДК 579.61: 616-095
ВЛИЯНИЕ СТАФИЛОКОККОВОГО БАКТЕРИОФАГА НА БИОПЛЕНКИ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ И РЕЗИСТЕНТНЫХ К ЦЕФОТАКСИМУ И АЗИТРОМИЦИНУ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ИХ МАТРИКСА
Воробей Е. С., Воронкова О. С., Винников А. И.
Резюме. При изучении состава матрикса биопленок штаммов S. aureus установлено, что при обработке пленок периодатом натрия оптическая плотность элюированного красителя снижалась на 47,00 ± 2,87% для чувствительного к цефотаксиму и азитромицину штамма и 59,02 ± 2,10% - для резистентного, что указывает на преобладание экзополисахаридов и совпадает с наибольшим влиянием на биопленки стафилококкового бактериофага (снижение оптической плотности на 19,1% и КОЕ/мл в 253,0 раза для чувствительного к антибиотикам штамма и на 33,9% и 393,6 раза соответственно - для резистентного). При обработке пленок протеиназой К оптическая плотность снижалась на 8,52 ± 1,72% для чувствительного штамма и 3,52 ± 1,11% - для резистентного, а при обработке трипсином - на 12,16 ± 1,49% и 7,20 ± 2,12% соответственно. Обработка ДНКазы приводила к уменьшению оптической плотности на 15,72 ± 2,55% и 14,50 ± 1,33%. Это свидетельствует о зависимости интенсивности воздействия фагового препарата на биопленки исследованных штаммов S. aureus от количества экзополисахарида в составе их матрикса.
Ключевые слова: стафилококки, биопленка, матрикс, экзополисахариды, полисахариддеполимеразы.
UDC 579.61: 616-095
AN INFLUENCE OF STAPHYLOCOCCAL BACTERIOPHAGE ON BIOFILM OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS SENSITIVE AND RESISTANT TO CEFOTAXIME AND AZITHROMYCIN, DEPENDING ON CHEMICAL COMPOSITION OF MATRIX
Vorobey E. S., Voronkova O. S., Vinnikov A. I.
Abstract. Removal of mature biofilms is the main task of therapy, because biofilms are the basement of the pathogenic process. The ability of active matrix to bind antibiotics or reduce the diffusion through the biofilm leads to incomplete removal of microorganisms, which attend to their survival and formation of chronic processes. An influence on staphylococcal biofilms can be done by destruction of extracellular polysaccharide matrix. This treatment, which may influence on the structure of the biofilm, is more effective than standard antibiotic therapy. It was established that the phage progeny spread radially through the biofilm, infecting neighboring cells and destroying the biofilm matrix. For this purposes phages producing the depolimerase, which may destroy biofilms matrix that is significantly depends on the structure of the polymer matrix.
It was showed that the effect of the drug «Bacteriophage staphylococcal liquid» on 72-hour biofilms of investigated strains, sensitive to cefotaxime and azithromycin, characterized by decreasing of absorbance level of eluted dye on 19.1%, while the number of cells in the biofilm decreased in 253.0 times. More significant effect of staphylococcal bacteriophage was determined for biofilms of strains, resistant to cefotaxime and azithromycin. This effect characterized as a decrease of optical density on 33.9%, while the number of cells decreased in 393.6 times.
An important step of our research was to study the biochemical composition of the polymer matrix of staphylococcal biofilms. Study the composition of biofilms matrix based on the specific destruction of it components. The percent of exopolysaccharides in the composition of biofilms matrix, formed by 72-hour, was determine by treatment of sodium periodate. It was found that after treatment the decreasing of optical density of eluted dye at 47.00 ± 2.87% for antibiotic sensitive strain and 59.02 ± 2.10% - for resistant took place. The presence of proteins was determine by using of proteinase K and trypsin. After treatment of the 72-hour biofilm by proteinase K absorbance of eluted dye, delayed by biofilm, decreased on 8.52 ± 1.72% compare to 72-hour control biofilm without enzyme adding for sensitive to antibiotic strain and on 3.52 ± 1.11% - for resistant strain. After trypsin adding decrease of absorbance of eluted dye was less - 12.16 ± 1.49% for sensitive to antibiotic strain and 7.20 ± 2.12% - for resistant. The content of the extracellular matrix DNA was determined with use of DNAase. The decrease of biofilms absorbance on 15.72 ± 2.55% compare to control biofilm for strain sensitive to antibiotic and 14.50 ± 1.33% - for resistant. This indicate that the main component of the biofilm matrix of studied strains are exopolysaccharides, and their number are on 12.02% higher in the antibioticresistant strain.
The results demonstrate the effectiveness of the phages drugs use to control the growth of biofilms formed by Staphylococcus aureus strains, the matrix of that consisting of a large number of exopolysaccharide. For inhibition of the biofilmformation the study of the relation of matrix structure and sensitivity to antibiotics is necessary and the search of therapeutic drugs capable to inhibit the production of exopolysaccharides is main task of microbiology.
Keywords: staphylococci, biofilm, matrix, exopolysaccharides, polysacchariddepolimerase.
Рецензент - проф. Лобань Г. А.
Стаття надшшла 21.01.2016 року
