CC BY
18
М1КРОБ1ОЛОГ1Я
© Кащик О. О., Воронкова О. С., Вшнков А.1. УДК 579.864:616.1
Кащик О. О., Воронкова О. С., BiHHiKOB А.1.
ФАГОЧУТЛИВЮТЬ СТАФ1ЛОКОК1В У Б1ОПЛ1ВЦ1
Днiпропетровський нацюнальний унiверситет iM. Олеся Гончара (м. Дтпропетровськ)
Роботу було виконано у межах держбюджетно'| теми «Структурно-функцюналыы особливост1 при-родних м1кробюценоз1в та механ1зми б1олог1чно1 дИ м1кробних препарат1в» (№ державно! реестраци 0115U002385), що виконуеться на кафедр1 м1кроб1о-логИ, в1русологИ та бютехнологи Днтропетровсыко-го нац1онального ун1верситету 1м. Олеся Гончара.
Вступ. Зг1дно сучасним уявленням бтышюты м1кроорган1зм1в - господар1в фаг1в, 1снуюты у на-вколишныому середовищ1 у вигляд1 специф1чно ор-ган1зованих, прикр1плених до субстрату бюпгмвок, що формуютыся на поверхн1 роздту р1зних фаз [6]. В даний час е багато визначены бюптвок. Зазвичай вони являюты собою склады агрегати м1кроорган1з-м1в, прикр1плен1 до шертних поверхоны, i включаюты продукти !х життедiялыностi [8]. Це складнi динамiч-нi структури, в яких вщбуваютыся рiзнi метаболiчнi процеси, а також взаемодiя мiж клiтинами i !х компонентами. У природныому середовищi - це змiшанi мiкробнi спiлыноти, де в бiлышостi переважаюты про-карiоти, але зустрiчаютыся i еукарiоти [5].
Лiзис бактерiалыних кгмтин в бiоплiвцi може вщ-буватися як природним шляхом при !х старiннi, так i при взаемодп з бактерiофагами. Коли фаг вступае в контакт з бiоплiвкою, подалыш взаемодiI вщбу-ваютыся в залежност вiд сприйнятливостi бактерiй бiоплiвки до фагу i наявностi рецепторних дтянок. Якщо бактерiофаг також володiе ферментами, що розкладаюты полiсахариди, або здмснюе лiзис м^ кробних клiтин, то цтюнюты бiоплiвки може бути швидко порушена. Однак може скластися i ствю-нування мiж фагом i бактерiями-господарями все-рединi бiоплiвки. Далеко не до юнця зрозумiлi вза-емовiдношення бiоплiвки з бактерiофагами, тому ця проблема потребуе подалышого вивчення [3,4].
У зв'язку з цим, метою роботи було дослщити чутливюты до лiкувалыних препаратiв бактерiофагiв штамiв Staphylococcus aureus, видiлених при дисб^ озi шлунково-кишкового тракту.
Об'ект i методи дослiдження. Дослiдження зi штамами стафiлококiв проводили на базi лаборато-рiI мiкробiологiI та iмунологiI ДУ «НД1 Гастроентеро-логií НАМН Укра!ни».
Об'ектом дослiдження була частота виявлення чутливост до бактерiофагiв бiоплiвкоутворюючих штамiв золотистого стафiлокока.
Предмет дослiдження складали штами S. aureus, видiленi вщ 51 особи з дисбiозами шлунково-кишко-вого тракту (ШКТ). Матерiалом для дослщжены були зразки фекалiй (n=51). Видiлення, iдентифiкацiю та дослiдження бюлопчних властивостей бактерiй проводили згщно з наказом «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования» [1].
Вс кулытури, iдентифiкованi як належн до виду S. aureus доотджували на прояв плазмокоагулаз-но!, лiпазноí, лецитiназноí, гемолiтичноí та фiбри-нолiтичноí активностi. Визначали !х здатнюты до утворення бiоплiвки та чутливюты до л^валыних препаратiв бактерiофагiв.
Для визначення здатност до формування бю-плiвки чисту кулытуру видiленого штаму виЫва-ли у лунки iмунологiчного планшета у кiлыкостi не менше 105 КУО/мл. Планшет iнкубували при +37°С протягом 3 дiб. Якщо у цей перюд формувалася бю-плiвка - поверхневий чи придонний рют у лунцi, що давав плiвку, яка при видаленнi середовища осщала на стiнках, то штам вважали плiвкоутворюючим.
Вивчення чутливостi до бактерюфапв здмснюва-ли крапелыним методом [2] для препара^в стафто-коковий бактерюфаг стафiлококовий рiдкий, Ытест^ фаг та пюбактерюфаг (НПО «Микроген», РФ).
Результати дослщжень та 'Гх обговорення. При проведеннi дослiджены було вобрано 51 зра-зок бiологiчного матерiалу. За резулытатами досл^ джены було встановлено, що у 31 зразку з 51 до-слiдженого було виявлено стафтококи, що склало 60,8% (рис. 1).
За резулытатами видово'| щентифкаци вста-новлена належнiсты видтених штамiв до 3 видiв (рис. 2).
Частка S. aureus серед видтених штамiв стаф^ лококiв була найбтышою i становила 51% (26 шта-мiв). Також зi значною частотою, яка була майже однаковою з попередым значенням, видтяли S. еpidermidis - 45% (23 штами). Найменша частка
39%
61%
Сгафшокок И 1нш1
4%
W
45%
51%
Н S.aureus □ S.epidermidis H S.saprophyticus
Рис. 1. Частота виявлення стафшокоюв при дисбiозi ШКТ
Рис. 2. Видовий спектр стафшокомв
серед видiлених штамiв - 4% (2 штами) була щенти-фiкована як належна до виду S. saprophyticus.
Для Bcix iiraMiB S. aureus було проведено до-слщження здатностi утворювати бiоплiвку. Показано, що 19 (73%) штамiв утворювали бiоплiвку, iншi 7 (27%) - не проявили здатност до утворення бюплiв-ки (рис. 3).
Вивчення чутливост до бактерiофагiв дозволило встановити, що вс 26 штамiв золотистого стафто-кока мали чутливють до фагiв з якого-небудь iз за-стосованих лiкувальних препаратiв (Пюбактерюфаг, lнтестiфаг та Бактерiофаг стафiлококовий рщкий). Деякi штами проявляли чутливiсть до вЫх препара-тiв, iншi - до окремих (рис. 4).
Значно! рiзницi мiж чутливiстю до фапв з лку-вальних препаратiв «Пюбактерюфаг» та «Бактерю-фаг стафiлококовий» не виявлено. Близько 80-90% штамiв були чутливими до них. Виняток складало ви-користання препарату «lнтестi-бактерiофаг»: серед плiвкоутворюючих iзолятiв чутливими було 51%.
Плями лiзису були повними або з бактерiальним ростом, що свщчило про бiльше чи менше виражену
чутливють до фапв з певних препара^в. У груп плiв-коутворюючих штамiв зливний лiзис зафiксовано для 51% штамiв.
Вiдсутнiсть 100%-го ефекту чутливостi е типо-вим явищем для фаготерапiI, адже рецептори на поверхн бактерiальноI клiтини та рецептори фапв е варiативними структурами. При використанн мо-новалентних фагiв ефект зазвичай не сягае i 15% для штамiв бактерiй, отриманих з рiзних джерел. Саме того на сучасному етап дослiджень рекомен-дуеться [9] використання «фагових коктейлiв», до складу яких входять рiзнi бактерюфаги. Така змша-на система дозволить при використанн фагiв досяг-ти бтьшо! ефективностi дiI.
Слiд вiдмiтити, що одним з недолiкiв фапв, з-за якого вони поступилися антибютикам, е висока спе-цифiчнiсть до клггини господаря. Так, вiрус здатен знищити лише чутливi штами, а тому при дiагнос-тичнiй помилц (неправильне визначення збудника) або при нечутливост штаму бактерiI до даного в^ русу, можливi невдачi терапп. У цьому сенсi антиб^ отики широкого спектру дiI мають значн переваги
27%
73%
S3 Г1твкоутворююч1 Ш Не утворюють бюпл1вки
Рис.3.Частота виявлення здатних до утворення бiоплiвки штамiв
100 90 80 § 70
СО
§ 60
к
^ 50
OS
89
87,5
51
40302010 0 -
Стафтококовий 1нтест1бактерюфа бактерюфаг
Ш Пл1вкоутворююч1 штами
Рис. 4. Частота виявлення чутливих до фапв з лтувальних препаратiв штамiв золотистого стафiлокока
Пюбактерюфаг
над бактерiофагами: вони знищують Bei MiKpoopra-ызми, у тому чист i збудника ураження [7].
Висновки
1. Встановлено, що частота виявлення стафто-KOKiB при дисбioзi ШКТ у досдщжуваному мaтеpiaлi складала 60,8% (31 зразок мютив цi бактерп).
2. Всi виделенi штами стафтокоюв було щенти-фiкoвaнo як належн до видiв: S. aureus - 26 (51%), S. epidermidis - 23 (45%), S. saprophyticus - 2 (4%).
3. Показано, що 16 (61,5%) штaмiв S. aureus утворювали бioплiвку. Понад 70% птвкоутворюючих штaмiв продукували плазмокоагулазу, лiпaзу, леци-тiнaзу, желатиназу та гемoлiзини.
4. Понад 87,5% штaмiв були чутливими до «nio-бaктеpioфaгу» та «Бактерюфагу ста фiл о ко ко во го»,
до «lнтестiфагу» серед птвкоутворюючих iзолятiв чутливими були 51%.
Перспективи подальших дослiджень. З огля-ду на думку про те, що лише антибютикотерапп при пiдозрi на дисбюз може бути недостатньо слщ здм-снювати пошук додаткових маркерiв, у тому числi i серед бюлопчних властивостей мiкроорганiзмiв, що можуть вирiшити проблему дисбiозу. Насам-перед мова йде про бактерюфаготератю, як один з шляхiв лiкування дисбюзу.
Автори висловлюють подяку завiдувачу лабора-торií мiкробiологiI та iмунологiI ДУ «НД1 Гастроенте-рологiI НАМН Укра'ши» (м. Днiпропетровськ) кандидату бюлопчних наук, доценту В. 6. Кудрявцева за можливють проведення дослiджень на базi лабора-торiI.
Лiтература
1. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностиче-
ских лабораториях лечебно-профилактических учреждений: приказ № 535. - [чинний вщ 22.04.1985р.]. - М.: МОЗ СССР, 1985. - 65 с.
2. Полщук В. П. ПоЫбник з практичних заняты з курсу «Загалына вiрусологiя» / В. П. Полщук, I. Г. Будзашвсыка, Т. П. Шевченко. -
К.: Ф^осоцюцентр, 2005. - 204 с.
3. High abundance of viruses found in aquatic environments / O. Bergh, K. Borsheim, G. Bratbak, M. Heldal // J. Nature. - 1989. -
Vol. 340. - P. 467-468.
4. Levin B. R. Coevolution in bacteria and their viruses and plasmids / B. R. Levin, R. E. Lenski // Co-evolution. Sunderland / eds.
D.J. Futuyama, M. Slatkin. Massachusetts: Sinauer Associates, Inc. - 1983. - P. 99-127.
5. Microbial biofilms / J. W. Costerton [et al.] // J. Annu. Rev. Microbial. - 1995. - Vol. 49. - P. 711-745.
6. O'Toole G. A. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling
pathways: a genetic analysis / G. A. O'Toole, R. Kolter // Mol Microbiol. - 1998. - Vol. 28 (3). - P. 449-461.
7. O'Flaherty S. Bacteriophage and their lysins for elimination of infectious bacteria / S. O'Flaherty, R. P. Ross, A. Coffey // J. FEMS
Microbiol. Rev. - 2009. - Vol. 33. - P. 801-819.
8. Stent G. S. Molecular Biology of Bacterial Viruses / G. S. Stent. - San Francisco, CA: WH Freeman and Co., 1963.
9. The interaction of phage and biofilms / W. Sutherland [et al]. // J. FEMS Microbiol. Lett. - 2004. - Vol. 232. - P. 1-16.
УДК 579.864:616.1
ФАГОЧУТЛИВЮТЬ СТАФ1ЛОКОК1В У Б1ОПЛ1ВЦ1 Кащик О. О., Воронкова О. С., Вшшков А. I.
Резюме. Активне поширення штамiв стафтокоюв як збудниюв уражены людини та значна |'х стмюсты до антибютиюв вказуюты на необхщнюты пошуку лкарсыких засобiв, до яких мiкроорганiзми е чутливими. По вщношенню до стафтокоюв такими препаратами можуты стати бактерюфаги. Метою роботи було до-слщити чутливюты до л^валыних препара^в бактерюфапв штамiв S. aureus, видтених при дисбiозi шлунко-во-кишкового тракту. Для проведення доотджены використан бактерюлопчы та вiрусологiчнi методи. У ре-зулытат доотдження встановлено, що у 31 (60,8%) зразку були виявлен стафтококи, з яких 26 (51%) штамiв вщнесено до виду S. aureus, 23 (45%) штамiв - до S. epidermidis та 2 (4%) - до S. saprophyticus. Понад 87,5% штамiв були чутливими до «Пюбактерюфагу» та «Бактерюфагу стафтококового рщкого», а до «1нтес^фагу» серед плiвкоутворюючих iзолятiв чутливими були 51%.
Ключовi слова: стафтокок, бiоплiвка, фагочутливюты, дисбюз.
УДК 579.864: 616.1
ФАГОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ СТАФИЛОКОККОВ В БИОПЛЕНКЕ Кащик А. А., Воронкова О. С., Винников А. И.
Резюме. Активное распространение штаммов стафилококка как возбудителей поражений человека и значителыная их устойчивосты к антибиотикам указывают на необходимосты поиска лекарственных средств, к которым микроорганизмы чувствителыны. По отношению к стафилококкам такими препаратами могут статы бактериофаги. Целыю работы было исследоваты чувствителыносты к лечебным препаратам бактериофагов штаммов S. aureus, выделенных при дисбиозе желудочно-кишечного тракта. Для проведения исследований исполызованы бактериологические и вирусологические методы. В резулытате исследования установлено, что у 31 (60,8%) образцах были обнаружены стафилококки, из которых 26 (51%) штаммов отнесены к виду S. aureus, 23 (45%) штаммов - к S. epidermidis и 2 (4%) - к S. saprophyticus. Более 87,5% штаммов были чувствителыны к «Пиобактериофаг» и «Бактериофага стафилококкового жидкого», а к «Ин-тестифагу» среди пленкообразующих изолятов чувствителыными были 51%. Ключевые слова: стафилококк, биопленка, фагочутливисты, дисбиоз.
UDC 579.864:616.1
SENSITIVITY TO PHAGES OF STAPHYLOCOCCI IN BIOFILM
Kashchik O. O, Voronkova O. S., Vinnikov A. I.
Abstract. According to modern concepts, most microorganisms are carried the phages and been in the environment in the form of specific organized structure, attached to the substrate, known as the biofilms. Lysis of bacterial cells in the biofilm can occur naturally when they are aging, and under the interaction with bacteriophages. When phage have a contact with cells in biofilm, further interactions occur depending on the bacterial susceptibility in film status to phages that depend on the presence of specific phage receptor sites on surface of bacterial cell. If bacteriophage also has enzymes that decompose polysaccharides, or performs lysis of microbial cells, the integrity of the biofilm can be quickly broken. However, it may arise and coexistence between phage and bacteria inside the biofilm-owners. Not well understood the relationship of biofilm and bacteriophages, so this issue needs further study. Active dissemination of staphylococci strains as causative agents of human infection and fact of their resistance to antibiotics point to the need to find the drugs to which these organisms are sensitive. In relation to staphylococci such drugs can be find among bacteriophages.
Phages can be multiply in the biofilm in large amounts to achieve complete infection and kill bacteria - this is a passive process. In contrast, treatment with the active biofilms for achieving direct antibacterial effect requires much less phages. Passive treatment may be carried by the phages modified so that they could not occure productive infection. In some cases passive processing may be implemented using many phages to bacteria that were lysed literally. At least under the passive treatment the phage added as needed to achieve the desired level of destruction of bacterial biofilms, without relying on the completion of phages produced by replication in situ within biofilms. The death of cells in biofilm by a passive treatment is a function of the rate of absorption of the phage, and the opportunities arising from this velocity lysis (active penetration of the phage). With active handling phages should give enough offspring to infection (a large number of output) for their high activity. Thus, the active biofilm treatment requires a high activity during the growth of the phage population. Various attacking enzymes may be combined with phages, or to run the penetration phages or for spreading of bacteria or biofilms, against which may be effective in the or another ingredient exposure. When destroying biofilms are no special differences between the authors of active and passive methods of processing. This is due to the fact that when detecting the formed biofilm bacteria density is already relatively high, and implies that there is at least a small possibility to amplify phage densities sufficient to control biofilms. The aim of research was to investigate the sensitivity to bacteriophages drugs of strains of S. aureus, isolated from persons with signs of gastrointestinal tract dysbiosis. For research were use bacteriological and virological methods. In the study was found that 31 (60.8%) samples contain staphylococci, of which 26 (51%) strains identified as S. aureus, 23 (45%) strains - as S. epidermidis and 2 (4%) - as S. saprophyticus. More than 87.5% of strains were susceptible to "Piobacteriophage" and to "Bacteriophage staphylococcal liquid", and to "Intestiphage" among filmforming isolates susceptible were 51%.
In view of the opinion that the only antibiotic therapy for suspected dysbiosis may not want to search additional markers, including biological properties of microorganisms that can solve the problem of dysbiosis. First of all, it is about phage therapy as one of alternative way to treat the dysbiosis.
Keywords: staphylococci, biofilm, sensitivity to phages, dysbiosis.
Рецензент - проф. Лобань Г. А.
Стаття надшшла 28.10.2015 року
