CC BY
30
DOI 10.29254/2077-4214-2018-1-1-142-257-260 УДК 579.61
Куц К. Р., Воронкова О. С.
ЧУТЛИВЮТЬ ДО ФАГ1В Л1КУВАЛЬНИХ ПРЕПАРАТ1В ШТАМ1В
СТАФ1ЛОКОК1В, ВИД1ЛЕНИХ ПРИ ДИСБ1ОЗ1 ШКТ
Днiпровський нацiональний унiверситет iMeHi Олеся Гончара (м. Днiпро)
voronkova_olga@i.ua
Зв'язок публшацм з плановими науково-досл1дними роботами. Дослiдження ви ко на Hi у рамках реалiзацiI завдань держбюджетно! теми № 1-294-15 «Структурно-функцюнальы властивост природних мiкробiоценозiв та механiзми бюлопчно! дiI мiкробних препаратiв».
Вступ. Нормальна мiкрофлора е необхiдним компонентом макрооргаызма, який забезпечуе його ефективне функцюнування [4,8]. Мiкрофлора не е стабтьним угрупованням, однак мае здатнiсть до пщтримання динамiчноI рiвноваги з переважанням певних груп сапрофггних мiкроорганiзмiв порiвняно 3i здiйсненням явища колонiзацiйноI резистентност для запобiгання проникненню на бютоп патогенних та умовно-патогенних видiв [1,2].
Значний комплекс зовншых факторiв може негативно впливати на динамiчну рiвновагу мiж макро-органiзмом та його мiкробiоценозом. Змiни у dcr^i мiкробних екосистем порожнин тiла людини з вщхи-ленням вiд норми називають дисбактерiозом. Най-поширенiшим е дисбактерюз кишечника [2,8].
Бактерiофаги сьогодн розглядаються як без-печне та ефективне доповнення до заходiв корек-цiI складу мiкрофлори, адже висока специфiчнiсть фагiв щодо конкретних мiкроорганiзмiв дозволяе вирiшити проблему з негативним впливом ряду пре-паратiв, зокрема антибютиюв, на сапрофiтнi бакте-рп [3,10,11].
Метою роботи було дослiдити чутливiсть вид^ лених при дисбiозi ШКТ iзолятiв стафiлококiв до л^ кувальних препаратiв бактерiофагiв.
Об'ект i методи досл1джень. Об'ектом до-слщження була чутливiсть до лiкувальних фагових препара^в iзолятiв стафiлококiв, що видтеы при дисбактерiозi шлунково-кишкового тракту (ШКТ) дорослих. Для видтених iзолятiв проводили щен-тифiкацiю до вида, вивчали 1х чутливiсть до антиб^ отикiв та бактерiофагiв з комерцiйних лкувальних препаратiв.
Дослiджували зразки випорожнень вщ осiб iз ознаками дисбактерiозу (n=52).
Дослiдження матерiалу з пiдозрою на стафто-кок проводили за схемою, що наведена у Наказi МОЗ № 535 [7]. Вивчали рют грампозитивних коюв на середовищi Чистовича, фермента^ю глюкози в анаеробних умовах з утворенням кислоти. Для встановлення видово! належност виявлених стаф^ лококiв проводили тести: S. aureus - на виявлення плазмокоагулази, ферментацю манiту в анаероб-них умовах з утворенням кислоти; S. epidermidis та
Э. заргорЬуйсиэ - визначення стмкост до новобю-цину, наявнiсть фосфатази, здатнiсть окислювати манiт. 1золяти чутливi до новобюцину, що мали фос-фатазу i здатнi окислювати манiт, вiдносили до виду Э. epideгmidis, а таю, що мали протилежн ознаки -до виду Э. sapгophyticus.
Чутливють видiлених вiд пацieнтiв iзолятiв встановлювали у лабораторiI за допомогою диск-дифузiйного методу. Використовували тiльки чист культури видiлених штамiв. Вибiр антибютиюв фун-тувався на матерiалах наказу МОЗ Укра!ни № 167 вщ 05.04.2007 «Про затвердження методичних вказiвок щодо визначення чутливостi мiкроорганiзмiв до ан-тибактерiальних препаратiв» [6]. З добово! культури отримували суспензiю iз вмiстом клiтин 1Ч106 клiтин/ мл. На стерильну чашку з МПА наносили 0,1 мл отри-мано! суспензи. Шпателем розтирали краплю по поверхн для рiвномiрного розподiлення матерiалу. Стерильним пiнцетом брали диски з антибютиками та розкладали по поверхн поживного середовища. У дослiдженнi використовували диски з цефтрiак-соном, цефетмом, гатiфлоксацином, амоксицилiн/ клавуланатом, азитромiцином, гентамщином. Облiк результатiв проводили через 18 годин пюля розкла-дання дисюв. Встановлення резистентностi штаму проводили на основi вимiрювання зони вiдсутностi росту навколо диску. Чутливють штамiв встановлю-ють вiдповiдно до таблицi зон затримання росту для стандартних дисюв з антибютиками.
Для визначення фагочутливост готували суспен-зiю клiтин стафтокока добово! агарово! культури, яка мютила 1 Ч 105 мiкробних кттин у 1 мл. Отрима-ну суспензю у об'eмi 0,5 мл наносили на поверхню добре пщсушеного МПА i розтирали шпателем. Пщ-сушували за юмнатно! температури протягом 20-30 хвилин. На отриманий газон iз нанесеною культурою шприцем по однм краплi (близько 0,05 мл) наносили зразки препара^в фапв. Чашку дiлили на 3 сек-тори. На кожен з секторiв наносили окремий фаг. Пiсля пщсихання крапель фагiв чашки iнкубували у термостат при 37еС протягом 18-24 годин. Наяв-нiсть зони лiзиса (за чотириплюсовою системою) свiдчила про ступшь чутливостi вивчаемого iзолята до л^вально-профтактичного фага [3,10].
Результати дослщжень та 'Гх обговорення. З дослiджених 52 зразкiв бiологiчного матерiалу вщ осiб з пiдозрою на дисбактерюз наявнють грампозитивних кокiв пщтверджено у 88,4% випадкiв (46 зразюв). Домiнуючою групою мiкроорганiзмiв ста-фтококи виявилися у 53,8% випадкiв (28 зразюв),
коли вони видтялися у найбтьшм кiлькостi порiвня-но i3 Ышими мiкроорганiзмами.
Видовий спектр стафiлококiв, що видiленi при дисбiозi ШКТ, представлено на рисунку 1.
Отже, видтеш iзоляти належали до одного з трьох видiв: переважна бiльшiсть - до виду S. aureus (78,6%), значно менше - до видiв S. epidermidis (7,1%) та S. saprophyticus (14,3%).
Сапроф^ний та епщермальний стафiлококи ви-являли у випадках, коли кшькгсть цieí групи бактерм не перевищувала лабораторноí норми, натомють в усiх випадках, коли стафтококи було визнано домi-нуючою групою, видiляли тiльки iзоляти золотистого стафтокока.
Нами було поставлено антибiотикограми для вах 28 iдентифiкованих iзолятiв стафтокоюв. Тестували чутливiсть до цефтрiаксону, цефетму, га^флокса-цину, амоксицилiн/клавуланату, азитромiцину та гентамщину iзолятiв iдентифiкованих як стафтококи (рис. 2).
У результат вивчення чутливост до антибюти-юв встановлено, що жоден з щентифкованих як S. aureus штамiв не був полiрезистентним. Для всiх штамiв S. aureus показано, що бтьше 72,7% з них були чутливими до всiх дослiджених препаратiв, що е доброю прогностичною ознакою для лкування па-цieнтiв. Найменш ефективними з препара^в вияви-лися гентамщин, цефепiм та цефтрiаксон, до яких чутливими були по 72,7% iзолятiв. З уах препаратiв найбiльш ефективним був га^флоксацин, до якого чутливими були понад 95,5% iзолятiв.
Вивчення чутливост штамiв S. epidermidis до ан-тибiотикiв дозволило виявити, що бтьшють штамiв
Рис. 2. Частка чутливих до антибютимв штамiв стафшокомв.
були чутливi до всiх вивчених препаратiв. Полiрезис-тентних штамiв серед iзолятiв, iдентифiкованих як епiдермальний стафтокок виявлено не було. Переважна бтьшють iзолятiв були чутливими до в^х за-стосованих препаратiв за винятком единого випадку стмкост в одного з двох штамiв до гентамщину, що дозволяе рекомендувати вс препарати, крiм остан-нього, для лкування пацiентiв в першу чергу.
Вивчення рiвня чутливостi до антибютиюв iзо-лятiв 5. saprophyticus дозволило виявити, що з уах
Рис. 1. Частота виявлення pi3^x видiв стафiлококiв.
штамiв, якi належали до цього виду, единий мав ознаки множинно'' резистентной до застосованих у тест препаратiв. Для iнших штамiв, як i для золотистого та епщермального стафiлокока, було показано, що найбтьшу чутливiсть вони мали до гатфлокса-цину - 100% штамiв чутливi. Чутливих до гентамщину штамiв не було. Однак, з огляду на малу ктькють дослщжених штамiв результати неможливо вважати цтком достовiрними та можливими для екстраполя-цií на всi кл^чш штами сапрофiтного стафiлокока.
Аналiз даних лтератури щодо спектру чутливостi стафтокоюв до антибiотикiв показав, що серед цих мiкроорганiзмiв найбiльш часто виявляються форми резистентнi до пенiцилiнiв та цефалоспоришв, що частково гндтверджено i даними на-шого аналiзу. ^м того, у нашому дослiдженнi в^о^чено тенденцiю до зниження чутливостi до гентамщину, про що е вказiвки у багатьох джере-лах. Окремi автори [5] наголошують, що саме коагулазонегативн стафi-лококи (S. epidermidis), власне i вщ-рiзняються бтьш високим рiвнем ре-зистентностi, порiвняно iз S. aureus. Аналiз отриманих нами даних навпа-ки вказуе на бтьшу резистентнiсть до антибютиюв серед штамiв, щен-тифiкованих як S. aureus.
Для в^х видтених iзолятiв ста-фiлококiв (всього 28) вивчали чут-ливiсть до бактерюфапв з трьох ко-мерцiйних препаратв: бактерiофаг стафiлококовий (стафiлофаг), iнтестi-фаг та секста-фаг (пюбактерюфаг).
Результати вивчення чутливост до бактерiофагiв з комерцмних препаратiв представленi у таблиц!.
З результатв, представлених у таблиц!, можна побачити, що найбтьшою чутливiстю до фапв вщ-рiзнялися iзоляти золотистого стафтокока, не менше 63,6% з яких були чутливими до в^х викорис-таних препаратв.
Таблиця.
Чутливють до бактерiофагiв видiлених iзолятiв стафiлококiв
Фаговий препарат 1золяти Частка чутливих iзолятiв, %
Стафтофаг 1нтес^-фаг Секстафаг
S. aureus, n=22 95,5 77,2 63,6
S. epidermidis, n=2 0 0 0
S. saprophyticus, n=4 25 0 25
Серед фагових препаратв найбiльш ефективним виявився препарат стафтофага (бактерiофаг стаф^ лококовий полiвалентний): до нього виявилися чут-ливими майже вс дослiдженi iзоляти золотистого стафтокока (95,5%). До фагiв з препарату 1нтест-фаг виявилися чутливими лише 77,2% iзолятiв золотистого стафтокока, одыею з вiрогiдних причин чого може бути те, що вказаний препарат е сумшшю фагiв проти рiзних бактерiй i загальна частка стаф^ лококового фага недостатньо велика, що е типовим для багатьох фагових препаратв [9]. Чутливють до препарату секстафаг мала найменше значення -63,6% чутливих iзолятiв, що, вiрогiдно, може бути пояснено попередыми мiркуваннями про неповну спрямованiсть препаратв проти стафiлококiв.
Серед iзолятiв епщермального стафiлококу оби-два виявилися нечутливими до вЫх фагiв, а серед iзолятiв сапрофiтного стафiлококу чутливiсть до бактерюфапв мала одиничний характер (2 штами чутливi до одного з тестованих фапв), вiрогiдно з-за того, що бтьшють препаратiв не мютить специфiч-них до них фапв. Так, е нав^ь вiдомостi про те, що бактерп двох вказаних видiв навiть не типуються стандартними фагами [3]. Отже, за результатами доотджень чутливими виявилися лише по одному з iзолятiв епщермального (до стафтофага) та сапро-фтого (до секстафага) стафтокоюв.
Для множиннорезистентних до антибю-тикiв iзолятiв показано вщсутнють стiйкостi до фагiв, що дозволяе рекомендувати !х для терапiI дисбактерiозу i сподiватися на високу ефективнють тако! терапевтично! схеми. За результатами дослщження виявлено, що ре-зистентнють до антибiотикiв нiяк не стввщ-носиться iз стiйкiстю до дм бактерiофагiв: всi випадки стiйкостi до фапв серед iзолятiв золотистого стафтокока були пов'язан зi стй кiстю до рiзних антибiотикiв та !х поеднань.
Висновки
1. Встановлено, що у 52 випадках дисбактерюзу стафтококи видiлялися у 88,4%. Дисбiоз було ви-значено як стафiлококовий у 53,8% випадюв. До виду S. aureus належали 78,6% штамiв, S. epidermidis -7,1% та S. saprophyticus - 14,3%.
2. Бтьше 95% штамiв були чутливими до га^ф-локсацину. Менш ефективними виявилися гента-мiцин, цефепiм та цефтрiаксон, до яких чутливими були по 72,7% iзолятiв.
3. До стафтофага чутливими були 95,5% iзолятiв золотистого стафтокока, до 1нтест-фагу виявилися чутливими 77,2%, а до секстафагу - 63,6%.
Перспективи подальших дослiджень. Проблема дисбiозiв е доволi поширеною, тому iснуе потреба у розробц засобiв профiлактики та ефективно! корекци подiбних станiв. З огляду на те, що дисбюзи не можна коригувати з використанням антибютиюв гiдним доповнення можуть стати л^вальы препа-рати бактерiофагiв, що мають високу специфiчнiсть дм щодо окремих мiкроорганiзмiв, не шкодячи iншим представникам мiкрофлори. Отже, перспективним напрямом дослщжень е вивчення чутливостi iзолятiв умовно-патогенних мiкроорганiзмiв до фагiв з лку-вальних препаратiв, що може надавати корекцмнм схемi додатково! ефективностi.
.iTepaTypa
1. Berezhnoy VV, Unich NK. Kishechnyy disbakterioz u detey. Perinatologiya i pediatriya. 2009;4:25-30. [in Russian].
2. Bondarenko VM, Matsulevich TV. Disbakterioz kishechnika kak kliniko-laboratornyy sindrom: sovremennoye sostoyaniye problemy. Moscow: GEOTAR-Media; 2007. 304 s. [in Russian].
3. Veselov AYa, Karmanova SYu. Liticheskaya aktivnost' i spetsifichnost' kommercheskikh bakteriofagov. Klin Lab Diagn. 1992;9-10:55-7. [in Russian].
4. Yershova IB, Vysotskiy AA, Tkachenko VI. Spornyye problemy disbakterioza: sovety prakticheskomu vrachu. Zdorov'ye rebenka. 2008;2:74-6. [in Russian].
5. Makushenko RS, Avdyeyeva LV, Macheret YaYu. Vydovyy sklad ta chutlyvist' do antybiotykiv oksatsylinrezystentnykh izolyativ stafilokokiv. AML. 2008;1-2:14-9. [in Ukrainian].
6. Nakaz MOZ Ukrayiny 167 Pro zatverdzhennya metodychnykh vkazivok shchodo vyznachennya chutlyvosti mikroorhanizmiv do antybakterial'nykh preparativ (05.04.2007). K: MOZ Ukrayiny; 2007. 63 s. [in Ukrainian].
7. Nakaz MOZ USSR 535 Ob unifikatsii mikrobiologicheskikh (bakteriologicheskikh) metodov issledovaniya, primenyayemykh v kliniko-diagnosticheskikh laboratoriyakh lechebno-profilakticheskikh uchrezhdeniy (22.04.1985). M.: MOZ USSR; 1985. 65 s. [in Ukrainian].
8. Petrovskaya VG, Marko OP. Mikroflora cheloveka v norme i patologii. Moscow: B.i.; 1996. 189 s. [in Russian].
9. Alves DR, Gaudion A, Bean JE, Perez Esteban P, Arnot TC, Harper DR, et al. Combined use of bacteriophage K and a novel bacteriophage to reduce Staphylococcus aureus biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 2014;80(21):6694-703.
10. Idelevich EA, von Eiff C, Friedrich AW, lannelli D, Xia G, Peters G, et al. In vitro activity against Staphylococcus aureus of a novel antimicrobial agent, PRF-119, a recombinant chimeric bacteriophage endolysin. Antimicrob Agents Chemother. 2011;55:4416-9.
11. Klem J, Dömötör D, Schneider G, Kovacs T, Toth A, Rakhely G. Bacteriophage therapy against staphylococci. Acta Microbiol Immunol Hung. 2013;60(4):411-22.
ЧУТЛИВ1СТЬ ДО ФАГ1В Л1КУВАЛЬНИХ ПРЕПАРАТ1В ШТАМ1В СТАФ1ЛОКОК1В, ВИД1ЛЕНИХ ПРИ ДИСБ1ОЗ1 ШКТ
Куц К. Р., Воронкова О. С.
Резюме. Встановлено, що дисбюз з переважанням стафiлококiв мав мюце у 53,8% випадкiв. Найбшьш часто виявляли S. aureus - 78,6% iiraMiB. Бiлыше 95% iiraMiB були чутливими до гатiфлоксацину. Менш ефективними виявилися гентамiцин, цефепiм та цефтрiаксон, до яких чутливими були по 72,7% iзолятiв. До стафтофага чутливими були 95,5% iзолятiв золотистого стафтокока, до lнтестi-фагу виявилися чутливими 77,2%, а до секстафагу - 63,6%.
Ключовi слова: дисбiоз, стафтококи, шлунково-кишковий тракт, лiкувалынi препарати фапв.
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ФАГАМ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ШТАММОВ СТАФИЛОКОККОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ ДИСБИОЗЕ ЖКТ
Куц К. Р., Воронкова О. С.
Резюме. Установлено, что дисбиоз с преобладанием стафилококков имел место в 53,8% случаев. Наиболее часто выявляли S. aureus - 78,6% штаммов. Более 95% штаммов были чувствительными к гатифлок-сацину. Менее эффективными оказались гентамицин, цефепим и цефтриаксон, к которым чувствительными были по 72,7% изолятов. К стафилофагу чувствительными были 95,5% изолятов золотистого стафилококка, к Интести-фагу оказались чувствительными 77,2%, а к секстафагу - 63,6%.
Ключевые слова: дисбиоз, стафилококки, желудочно-кишечный тракт, лекарственные препараты фагов.
SENSITIVITY TO PHAGE PREPARATIONS OF STAPHYLOCOCCI STRAINS, ISOLATED DURING DYSBIO-SIS OF GASTROINTESTINAL DISEASE
Kuts K. R., Voronkova O. S.
Abstract. Normal microflora is a necessary component of macroorganism, which ensures its effective functioning. Microbiome is not a stable group, but has the ability to maintain a dynamic equilibrium with the predominance of certain groups of saprophytic microorganisms in comparison with the implementation of the phenomenon of colonization resistance in order to prevent the pathogenic and pathogenic species from being infected on the biotope. A significant number of external factors can negatively affect on the dynamic balance between macroorganism and its microbiocenosis. Changes in the composition of microbial ecosystems of human body cavities with deviations from the norm are called dysbiosis. The most common is bowel dysbiosis. Today bacteriophages are considered as a safe and effective addition to the correction of the composition of the microbiota, because the high specificity of phages for specific microorganisms can solve the problem with the negative effects of a number of drugs, in particular antibiotics, on saprophytic bacteria.
The aim of the research was to investigate the sensitivity of staphylococcal strains, isolated during dysbiosis to phages from drugs.
The object of the study was the sensitivity to the phage drugs of staphylococcal strains, isolated from adults with dysbiosis of the gastrointestinal tract. For isolated strains, identification for the species was conducted, their sensitivity to antibiotics and bacteriophages from commercial therapeutic agents was studied. Among the 52 samples of biological material from individuals suspected of dysbiosis, the presence of gram-positive cocci was confirmed in 88.4% of cases (46 specimens). The dominant group of staphylococcal microorganisms was found in 53.8% of cases (28 specimens), when they isolated in the highest number compared with other microorganisms. Thus, isolated isolates belonged to one of three types: the vast majority - to the species S. aureus (78,6%), much less - to the species S. epidermidis (7,1%) and S. saprophyticus (14,3%).
As a result of the study of antibiotic susceptibility, it was found that none of the strains identified as S. aureus were polyresistant. For all strains of S. aureus, it has been shown that more than 72.7% of them were sensitive to all investigated drugs, which is a good prognostic sign for the treatment of patients. The least effective drugs were gentamicin, cefepime and ceftriaxone, to which 72.7% of isolates were susceptible. Of all the drugs, the most effective was gatifloxacin, to which more than 95.5% of isolates were susceptible. The greatest sensitivity to phages had isolates of S. aureus, at least 63.6% of which were sensitive to all used drugs. Among the phage drugs, the drug Staphylophage (bacteriophage staphylococcal polyvalent) was most effective: almost all isolated isolates of staphylococcus aureus (95.5%) were sensitive to it. Only 77.2% of isolates of S. aureus were found to be phages of the Intesty-Phage, one of the most likely reason for this is that the drug is a mixture of phages against different bacteria and the overall proportion of staphylococcal phage is not large enough, which is typical for many phage. The sensitivity to the drug, sekstaphage has the smallest value - 63.6% of sensitive isolates, which is likely to be explained by previous considerations about the incomplete orientation of drugs against staphylococci.
Key words: dysbiosis, staphylococci, gastrointestinal tract, phages drugs.
Рецензент - проф. Лобань Г. А.
Стаття надшшла 24.12.2017 року
