CC BY
57
Вюник Дтпропетровського унiверситету. Бюлопя, медицина Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biología, medicina Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, medicine
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Med. 2014. 5(2), 90-93.
doi:10.15421/021417
ISSN 2310-4155 print ISSN 2312-7295 online
www.medicine.dp.ua
УДК 579:61
Фаготип i чутливкть до антибютиюв плiвкотвiрних штамiв Staphylococcus aureus, видтених Í3 дихальних шляхiв
О.С. Воронкова, О.А. Орокваша, Т.М. Шевченко, А.1. Bíhhíkob
Днтропетровський нацюнальний утверситет Мет Олеся Гончара, Дтпропетровськ, Украта
Проведено фаготипування штам1в стафiлококiв, здатних до утворення бiоплiвки. В експериментi встановлено, що здатнiстю до утворення бiоплiвки володiли 61,5% видiлених шгам1в золотистого стафшокока. Чутливiсть до фагiв i3 Мiжнародного набору проявляли 53,8% дослщжених штамв золотистого стафiлокока. 1з штамв, що давали позитивну вщповщь, 64,3% - чутливi до одного з фапв, до двох i трьох фагiв чутливi 21,4% та 14,3% вщповщно. Видiленi штами чутливi до таких фагiв: 81 - 42,9%, 75 - 35,7%, 47 та 53 - по 28,6%. Уа випадки виявлення чутливостi до фага 47 збшалися зi здаттстю утворювати бiоплiвку та стiйкiстю до ерит-ромщину, амоксицилшу та тетрациклшу та у 50% випадкiв - зi стiйкiстю до гентамцину, у 25% - до ципрофлоксацину. Серед неплiвкотвiрних шгамiв чутливих до фага 47 не було.
Ключов1 слова: бюгшвка; фаготипування; дiагностичнi препарати бактерюфапв; стафшококи; стiйкiсть до антибютиюв
Phage type and sensitivity to antibiotics of Staphylococcus aureus film-forming strains isolated from airway mucosa
O.S. Voronkova, O.A. Sirokvasha, T.N. Shevchenko, A.I. Vinnikov
Oles Honchar Dnipropetrovsk National University, Dnipropetrovsk, Ukraine
Today film-forming strains of bacteria play very important role in clinical pathology. Staphylococci are ones of most dangerous of them. This bacteria can determine different pathological processes, for example, complication of airway mucosa. The ability to form a biofilm is one of the main properties of nosocomial strains. These strains should be monitored and their carriers are to be properly treated. To determine the origin of staphylococci strains we used bacteriophages from the International kit. The aim of research was to determine the phage type of staphylococci film-forming strains, that were isolated from naso-pharingial mucosa. Phage typing has been carried out for 16 film-forming strains of S. aureus. To solve this problem, we used the International phage kit by Fisher's method. As a result, sensitivity to phages from the International kit showed 53.8% of studied strains of S. aureus. 64.3% of sensitivity strains were lysed by one of the phage, 21.4% - were by two of the phages, 14.3% - by three of the phages. Isolates were sensitive to phages: 81 - 42.9%, 75 - 35.7%, 28.6% were sensitive to phages 47 and 53. All cases of detection of sensitivity to phage 47 coincided with the ability to form biofilm. Among non-film-forming strains there was no sensitive strains for this phage. Film-forming strains resist to erythromycin (62.5%), ciprofloxacin (43.8%), gentamicin (56.3%), tetracycline (87.5%), amoxicillin (93.8%), and cefuroxime (37.5%). All cases of sensitivity to phage 47 coincided with resistance to erythromycin, amoxicillin and tetracycline. For two of these strains, we also defined resistance to gentamicin and for one of them - to ciprofloxacin. Results of research allowed to relate the bacterial cultures for determining the type. This may have implications for studying of film-forming ability, because surface structures of bacterial cell take place in this process. Belonging of an isolate to specific phage type may indicate possible differences in the structure of the cell wall, composition of the cytoplasmic membrane, receptors, etc. So, phage typing may be used as one of tests to study film-forming processes. Besides, phage typing can be helpful in finding of the source and modes of transmission of nosocomial strains of bacteria. Given the increased level of antibiotic resistance among film-forming strains of staphylococci, the importance of this monitoring is indisputable, because spreading of these strains may cause the failure of therapy.
Keywords: biofilm; phage typing; diagnostic bacteriophages kit; staphylococci; antibiotic resistance
Днтропетровський нацюнальний утверситет M. Олеся Гончара, пр. raaapiwt, 72, Днтропетровськ, 49010, Украгна Oles' Honchar Dnipropetrovsk National University, Gagarin Ave., 72, Dnipropetrovsk, 49010, Ukraine Tel.: +38-096-225-04-63. E-mail: [email protected]
Вступ
Стафшококи посвдають сьогодт одне з пров1дних мюць у CTpyKTypi захворювапосп, зумовлено1 умовно-патогенними мiкроорганiзмами. Вони е одними з найчаспше виявлюваних бактерш як у здорових оСб (носiйство), так i серед пащенпв лiкарняних закладiв. Носiйство стафшокок1в майже здоровими людьми та особливо медичним персоналом вельми поширене, але воно майже не рееструеться та виявляеться лише при травмах i знижент захисних сил макрооргатзму (Murchan and Carter, 2000; Savchuk, 2003; Paul-Satyaseela et al., 2011; Kaimal et al., 2012; Falova et al., 2013).
Серед причин стафшококових захворювань можна вщзначити численнi епiдемiологiчнi аспекти, пов'язанi зi збiльшенням контингенту осiб зi зниженою отртс-тю органiзмy, концентрацiею мюького населения, вну-трiшньолiкарняною циркyляцiею пол1резистентних штамiв, дефектами у тактицi ангибютикотерапп тощо (Labinskaia and Volina, 2008; Bondarenko, 2011). У зв'язку iз цим необхвдний монiторинг штамiв стафь локок1в, як1 циркулюють у л1карняних закладах та поза ними, що мае на метi виявлення джерел поширення цих бактерiй (Kali et al., 2013). Для мотторингу штамiв використовують Мшнародний набiр фагiв для типу-вання золотистого стафiлокока (Blair and Williams, 1961; Akimkin et al., 2010).
Певно1 значущосп питання фаготипування набувае у зв'язку з поширенням серед клiнiчних iзолятiв стафь локок1в, здатних до утворення бюпл1вок. Перебування в останньому станi надае штамам переваг виживаностi за негативних умов оточення, особливо за умов вико-ристання з лiкyвальною метою ангибютишв. У струк-тyрi бюпл1вки бактерй' набувають ознак щдвищення резистентносп до антимiкробних препарат1в (Fujisawa and Ishihara, 1968; Olson et al., 2002; Ilyina, 2004; Mehndiratta et al., 2010). Фаготипування може допомог-ти вирiшиги проблему встановлення джерела поширення стафiлокоiв, що дозволить розробити ефективт заходи санацй' (Pantucek et al., 2004).
В1дпов1дно до цього, метою дано1 роботи було ви-значити фаготипи штамiв золотистого стафшокока, здатних до утворення бющпвки, видшених iз верхиiх дихальних шляхов.
Матерiал i методи досл1джень
Дослвдження зi штамами стафiлококiв проводили на базi лабораторй' мiкробiологiï НД1 гастроентерологи НАМН Украни (м. Дншропетровськ). Матерiал в|д здорових осiб ввдбирали з носоглотки та зiва двома стерильними ватними тампонами промислового вироб-ництва. 1дентиф1кацш стафiлококiв проводили за озна-ками, наведеними у Визначнику бактерш Бердж1 (Holt et al., 1994).
Для дослвджень в1дбирали всi зразки, що мiстили грампозигивт коки (Volkov, 1999; Labinskaia and Volina, 2008). За умов виявлення остантх методом мжроскопп висiвали матерiал штрихом на живильт середовища: сольовий агар, 5% кров'яний агар, цукровий бульйон i
середовище для контролю стерильности 1нкубували за +37 °С протягом 18-24 годин. У разi виявлення росту проводили ввдавання окремих колонiй на жовтково-сольовий агар (About unification..., 1985; Holt et al., 1994). 1з колонш в1дбирали матерiал для подальшо1 iдеигифiкацiï. Належними до роду Staphylococcus вважа-ли бактери, що давали ркт на середовищi Чистовича, ферментували глюкозу в анаеробних умовах з утворен-ням кислоти. Для встановлення належносп до S. aureus проводили тест на виявлення плазмокоагулази та ферментащю маиiтy в анаеробних умовах з утворенням кислоти. За наявносп плазмокоагулази та утворення кислоти з манту при аиаеробiозi штам вважали належ-ним до вказаного виду.
Для визначення здатностi до формування бiоплiвки чисту культуру вид||леного штаму висiвали в лунки 1муно-лопчного планшета у к1лькосп не менше 105 КУО/мл. Планшет iнкyбyвали за +37 °С протягом 3 д16. Якщо у цей перiод формувалася бiопл1вка (поверхневий чи при-донний р1ст у лунц1, що давав пл!вку, яка у разi видален-ня середовища ос1дала на стшках) штам вважали пл1вкотв1рним. На один 96-лунковий 1мунолог1чний планшет заавали по 3 комрки для кожного штаму. В1дпов1дь про здатнiсть до пл!вкоутвоення вважали позитивною, якщо принаймш у однш лунц1 з трьох формувалася пл1вка протягом 72 годин.
Вивчення чутливост1 до антибютиюв проводили в1д-пов1дно до наказу МОЗ Украни «Про затвердження ме-тодичних вказ1вок щодо визначення чутливосп мшроор-гатзм1в до антибактер1альних препарапв» (Approval ..., 2007). 1з добовоï' культури готували суспенз1ю з ум1стом кл1тин 1 х 106 кл./мл. На стерильну чашку з МПА наносили 0,1 мл отриманоï' суспензи. Шпателем розтирали краплю по поверхш для р1вномрного розподшу матер1алу. Стерильним пшцетом диски з антибютиками розкладали по поверхн живильного середовища, зас1яного культурою стаф1локока. На одну чашку умшували 6 диск1в з антибютиками еритромщином, ципрофлоксацином, геигамiцином, тетрациклшом, амоксицил1ном i цефуроксимом. Обл1к результапв проводили через 24 години п1сля розкладаиня диск1в. Чутлив1сть штаму визначали на основ1 вимiрюваиия зони затримання росту навколо диска.
Для визначення чутливосп шгам1в до бактерюфапв застосовували метод Ф1шера. Готували суспензш кл1тин чистоï' добовоï' агаровоï' культури вивчених 1золяпв, яка мютила 1 х 105 кл./мл. Отриману суспензш у об'ем 0,5 мл наносили на поверхню добре щдсушеного МПА та розтирали шпателем. П1дсушували за кiмнатноï' тем-ператури протягом 20-30 хвилин. На отриманий газон 1з нанесеною культурою шсул1новим шприцом по однш крапл1 (близько 0,05 мл) наносили зразки препарапв фапв. П1сля щдсихапня крапель фалв чашки шкубували у термостат за +37 °С протягом 18-24 годин. Наявшсть зони лзису сввдчила про чутливкть вивченого штаму до фага (Blair and Williams, 1961; Dzahurov and Rezepov, 1995; Labinskaia and Volina, 2008).
Для фаготипування використовували фаги 42Е, 42D, 47, 53, 55, 75 та 81 з1 стандартного М1жнародного набору для фаготипування. Позигивну оцшку чутливосп до фалв визначали на шдсташ трьох окремих дослвджень.
Результата та ïx обговорення
За наслщками вдентифшацп 1золят1в бактерш, вид1лених ввд oci6 i3 хротчним носшством, визначено, що 26 штамв належали до Staphylococcus aureus. 1з них 16 (61,5%) штамв здатт до утворення бюпл1вки. Для цих штамв дослвджено фаговий профiль (табл.).
Таблиця
Фаготипи видтених штам1в Staphylococcus aureus
До застосованих фапв проявили чутливiсть 9 (56,3%) штамв золотистого стафшокока, решта - 7 (43,7%) - не Myrarni до жодного з використаних фапв. 1з штамiв, що давали позитивну вщповщь, 64,3% чyтливi до одного з фапв, до двох та трьох фагтв чyтливi 21,4% та 14,3% вщповщно. Найчастше видшет штами виявлялися чут-ливими до фагтв: 81 - 42,9%, 75 - 35,7%, 47 та 53 - по 28,6%. До фапв 42Е та 42D чутливих штамв не визначено.
За низкою даних (Ekmuzheva and Khadzegova, 2003; Falova et al., 2013) фаговий профшь i взагалi сама мож-ливють фаготипування культур можуть вiдрiзнятися залежно ввд того, зввдки вони видшет. Вказуеться на вiдмiнностi згаданих ознак для штамiв стафiлококiв, вид1лених iз поверхнi шк1ри здорових осiб i оаб iз дерматитами (Falova et al., 2013). Розб1жшсть у ввдсотках штамiв, що можуть бути фаготиповат, невелика, нато-мiсть фаговий профшь для штамв стафшокошв, видше-них ввд осiб iз дерматитами, значно бшьший. Кр1м того, ввдшчено, що найбшьший ввдсоток штамiв типовано фагами третьо'' групи. Подiбнi ж тенденцп описано i для штма1в стафiлококiв, видiлених iз пiхви здорових жшок (Ekmuzheva and Khadzegova, 2003). У наших дослвдженнях також показано, що бшьшють штамiв ти-пувалися фагами третьо'' групи: 7 з 9 штамв (77,8%) типувалися принаймнi одним iз фапв групи 3. До змшано'' групи належали 2 штами, яю одночасно типувалися бшьше нж 2 фагами, i один штам взаемод1яв iз фагом 55, належним до друго'' групи. 1з фагом четверто'' групи - 42D - реакци не було.
Уа випадки виявлення чyтливостi до фага 47 збпалися зi здатн1стю утворювати бiоплiвкy, жоден iз неплiвкотвiрних ташв не був чутливим до цього фага. 1нш фаги викликали лiзис у штам1в як здатних, так i не здатних до утворення бюптвки. У складi бiоплiвки бактерп набувають ознак пвдвищено'' резистентностi до
антибютиюв. У нашому дослiдженнi показано, що видшет плiвкотвiрнi штами були стшкими до еритромiцинy (62,5%), ципрофлоксацину (43,8%), гентамiцинy (56,3%), тетрациклiнy (87,5%), амоксицилшу (93,8%) та цефуроксиму (37,5%). Ва випадки визначення чутливосп до фага 47 збиалися з резистентшстю щонайменше до трьох iз застосованих антибiотикiв. Усi чотири чyтливi до вказаного фага штами стшю до еритромiцинy, амоксицилiнy та тетрациклшу. Для двох iз цих шташв також визначено стiйкiсть до гентамщину, а для одного - до ципрофлоксацину. Отримаш даш частково погоджуються з матерiалами шших досл1дник1в (Arunava et al., 2013): вказуеться на зв'язок мтж чутливютю до фага 47 та стшшстю до антибiотикiв, що збiгаеться з отриманими нами даними, натомiсть у нашому дослвдженш взагалi не визначено чутливосп до фага 42Е, яка також вщмчена для антибютикорезистентних шташв стафiлококiв у вказан1й робот1.
За ознакою специфiчностi вид1ляють полiвалентнi бактерюфаги, як1 лiзyють культури з одте1 родини або роду бактерiй, моновалентш (монофаги) - лiзyють культури тшьки одного виду бактерiй, а також типовi бакте-рiофаги, яш вирiзняються найвищою специфiчнiстю та здатт викликати лiзис т1льки певних тишв (варiантiв) бактерiальноï культури всередин1 виду бактерш. 1з цього погляду, зроблений нами аналiз штамiв, в1дпов1дно до 1х специфiчностi, дозволяе чiтко вщнести культури до певних фаготишв. Це може вказувати на можливу наявн1сть в1дм1нностей у стрyктyрi клтгинно1 ст1нки, склад1 цитоплазматично1 мембрани, рецетщлв тощо, що, у свою чергу, може мати ключове значення для вивчення формування бiоплiвок. В останньому процесi важливу роль в1д1грають саме поверхневi структури бактерiальноï клiтини. Отже, тест на фаготип може стати одним iз тестiв для ввдстеження динамiки процесу плiвко-утворення.
За допомогою методу фаготипування можна встано-вити джерело та шляхи передачi шфекцшного захворю-вання, тобто провести його ешдемюлопчний аналiз, оск1льки вiн дозволяе порiвнювати фаготип (фаговари) чистих культур бактерш, видшених у ход1 бактерюлоп-чного досл1дження в1д хворого й оаб що оточують його, можливих бaктерiоносiïв (Pantucek et al., 2004; Labinskaia and Volina, 2008). Подабне досл1дження може стати в нaгодi п1д час розробки метод1в виявлення та санацп носiйствa нозокомiaльних штам1в серед персоналу лiкyвaльно-профiлaктичних заклад1в. Особливу значу-щiсть цей мон1торинг мае щодо здатних до щшвкоутво-рення штaмiв стaфiлококiв, поширення яких зумовлюе зростання р1вня резистентност1 до антибютиюв i спричинюе невдaчi терaпiï' (Donlan and Costerton, 2002; Mehndiratta et al., 2010).
Висновки
Здатн1сть до пл1вкоутворення виявлена у 16 (61,5%) штам1в золотистого стаф1локока, вид1лених iз верхн1х дихальних шлях1в людей. 64,3% дослвджених штам1в золотистого стаф1локока чyтливi до одного з фaгiв iз М1жнародного набору для фаготипування стафшокоюв,
Штам S. aureus Фаговий профшь
1 47
2 53, 55
3 47, 75, 81
4 81
5 81
6 -
7 -
8 -
9 53
10 47, 75, 81
11 47
12 -
13 53
14 -
15 -
16 -
до двох та трьох фапв 4yxraBi 21,4% та 14,3% вщповщ-но. Чутливктъ дослвджених шгашв показана до фапв: 81 -42,9%, 75 - 35,7%, 47 та 53 - по 28,6%. До фапв 42Е та 42D чутливих штам1в не визначено. Bci випадки виявлення чутливосп до фага 47 збталися 3i здаттстю утво-рювати бюпл1вку.
Видiленi плiвкотвiрнi штами стшю до еритром1цину (62,5%), ципрофлоксацину (43,8%), гентамщину (56,3%), теIрациклiну (87,5%), амоксицшпну (93,8%) та цефурок-симу (37,5%). Уа випадки визначення чутливосп до фага 47 збиалися з резистенттстю до еритромщину, амокси-цишну та тетрацикшну. Для двох iз чутливих до фага 47 штам1в також визначено стшюстъ до гентам1цину, а для одного - до ципрофлоксацину.
Бiблiографiчнi посилання
Akimkin, V.H., Darbeeva, O.S., Kolkov, V.F., 2010. Bakterio-fahy: Istoricheskie i sovremennye aspekti ih primeneniia: Opit i perspektivi [Bacteriophages: Historical and contemporary aspects of their application: Experience and prospects]. Clinical Practice 4, 48-54 (in Russian). Arunava, K., Selvaraj, S., Umadevi, S., Shailesh, K., Noyal, M.., Sreenivasan, S., Joshy, M.E., 2013. Bacteriophage types of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a tertiary care hospital. Australas. Med. J. 6(10), 496-503. Blair, J.E., Williams, R.E.O., 1961. Phage typing of staphylococci. Bull WHO 24, 771-778. Bondarenko, V.M., 2011. Rol uslovno-patogennih bakterii pri chronicheskih vospalitelnih processah razlichnoi lokalizacii [The role of opportunistic bacteria in chronic inflammatory processes of different localization]. Triada, Twer (in Russian). Donlan, R.M., Costerton, J.W., 2002. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Micro-biol. Rev. 15(2), 167-193. Dzahurov, S.H., Rezepov, F.F. (Eds.), 1995. Spravochnik po primrneniiu bakteriinih i virusnih preparatov [Handbook of bacterial and viral preparations application]. Medicine, Moscow (in Russian). Ekmuzheva, D.Z., Khadzegova, S.B., 2003. Kharakteristika normalnoy mikroflory vlagalischa u zdorovykh zhenschin reproduktivnigo vozrasta [Characteristic of the normal vaginal microflora in healthy women of reproductive age]. Us-pekhi Sovremennogo Estestvoznaniya 6, 50-51. Falova, O.E., Potaturkina-Nesterova, N.I., Ilina, E.N., 2013. Vzaimosviaz vnutrividovogo raznoobraziia i geneticheskih determinant patogennosti stafilokokkov kozhi [Interrelation of intraspecific variety and genetic determinants of skin's staphylococcus pathogenicity]. Fundamental Research 12, 131-134 (in Russian). Fujisawa, H., Ishihara, K., 1968. Penicillin resistance correlated with phage types in Staphylococcus aureus. Japan. J. Micro-biol. 12(1), 1-6.
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Williams, S.T. (Eds.), 1994. Bergey's manual of determinative bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore.
Ilyina, T.S., Romanova, Y.M, Hinzburh, A.L., 2004. Bioplenki kak sposob sushestvovaniia bakterii v okruzhaiushei srede i orhanisme hoziaina: Fenomen, heneticheskii control i sis-temi rehuliacii ih razvitiia [Biofilms as a way of existence of bacteria in the environment and the host organism: The phenomenon, the genetic control system and the regulation of their development]. Genetic. 40, 1-12 (in Russian).
Kaimal, S., D'Souza, M., Sistla, S., Parija, S.C., 2012. Phage typing in dermatitis cruris pustulosa et atrophicans: Does staphylococcal carrier status have a role? Int. J. Dermatol. 51(11), 1335-1339.
Kali, A., Stephen, S., Sivaraman, U., Kumar, S., Joseph, N.M., Srirangaraj, S., Easow, J.M., 2013. Bacteriophage types of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a tertiary care hospital. Australas. Med. J. 6(10), 496-503.
Labinskaia, A.S., Volina, Y.H. (Eds.), 2008. Rukovodstvo po medicinskoi mikrobiolohii. Obshaia i sanitarnaia mikrobi-olohiia [Manual of medical microbiology. General and sanitary microbiology]. Binom, Moscow (in Russian).
Mehndiratta, P.L., Gur, R., Saini, S., Bhalla, P., 2010. Staphylo-coccus aureus phage types and their correlation to antibiotic resistance. Indian J. Pathol. Microbiol. 53(4), 738-741.
Murchan, S., Carter, M., 2000. Strain identities of phage non-typable MRSA in the UK. J. Hosp. Infect. 46, 157-158.
Ob unifikacii mikrobiolohicheskih (bakteriolohicheskih) meto-dov issledovaniia, primeniaemih v kliniko-diahnosticheskih laboratoriiah lechebno-profilacticheskih ucherezhdenii, 1985 [About the unification of microbiological (bacteriological) research methods used in clinical diagnostic laboratories of medical institutions: the order № 535 (1985)]. MOZ USSR, Moscow (in Russian).
Olson, M.E., Ceri, H., Morck, D.W., Buret, A.G., Read, R.R., 2002. Biofilm bacteria: Formation and compararive susceptibility of antibiotics. Can. J. Vet. Res. 66(2), 86-92.
Pantucek, R., Doskar, J., Ruzickova, V., Kasparek, P., Oracova, E., Kvardova, V., Rosypal, S., 2004. Identification of bacte-riophage types and their carriage in Staphylococcus aureus. Arch. Virol. 149, 1689-1703.
Paul-Satyaseela, M., Belkum, A., Shivannavar, C.T., Gaddad, S.M., 2011. Comparison of capsular typing of Staphylococ-cus aureus with bacteriophage typing: A study in Gulbarga, India. Indian J. Med. Microbiol. 51(3), 359-362.
Pro zatverdzhennia metodichnih vkazivok schodo viznachennya chutlivosti mikroorganizmiv do antibakterialnih preparativ, 2007 [Approval of guidelines for determining the sensitivity of microorganisms to antibiotics. The order № 167 (2007)]. Ministry of Health of Ukraine, Kyiv (in Ukrainian).
Savchuk, T.D., 2003. Stafilokokkovaia infekciia [Staphylococcal infections]. Medicine, Moscow (in Russian).
Volkov, 1.1., 1999. Sovershenstvovanie mikrobiolohicheskoi diahnostiki stafilokokkovih infekcii i ekolohicheskie aspekti ih vozbuditelei [Improving the microbiological diagnosis of staphylococcal infections and environmental aspects of their pathogens] Autoref. of candidate dissertation. Available from http://nature.web.ru/db/msg.html?mid=1163020.
Hadiumna do редкonегii 22.10.2014
