CC BY
21
УДК 578.81
Науменко О.В., к.т.н., ст. науковий ствроб1тник © (naumenkoo@list.ru) 1нститут продоволъчихресурав НААН, м.Кшв
ДОСЛ1ДЖЕННЯ РОЛ1 ЕК30П0Л1САХАРИДН01 КАПСУЛИ В ЗАХИСТ1 КЛ1ТИН STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS В1Д ФАГОВОГО
УРАЖЕННЯ
Дослгджено вплыв видоспециф1чних фаг1в fSj та S-2 на штами S. thermophilus з колекцп 1ПР. Выявлено eiÖMiHHoemi м1ж фагорезистентними та фагочутливими штамами S. thermophilus у продукувант втъного та капсулъного пол1сахарыд1в клтинног сттки. Показано, що екзополкахаридна капсула захищае клтини eid лтичног dii певних munie фаг1в S. thermophilus. Bidiöpano штам S. thermophilus IMB В-7247, що характеризуется здатшстю до продукуеання капсулъних екзопол1сахарыд1в i е фагосттким до широкого кола фаг1в.
Ключов{ слова: бактерюфаги, Streptococcus thermophilus, капсулы, екзополгсахарид.
Вщомо, що деяю штами S. thermophilus здатш утворювати екзополкахариди двох вид1в: вшьний позакл1тинний слиз (Eps) та капсульш полкахариди (Cps), щшьно прикршлеш до поверхш кл1тини. Наявшсть та розм1р капсули е важливою властивютю, котра дозволяе бактер1альнш кл1тиш виживати за несприятливих умов середовища та е одшею з найважливших рис, що визначае И бюлопчш характеристики [1].
Чутливкть лактобактерш до бактерюфапв залежить вщ комплементарное^ та наявност1 специф1чних сайт1в на кл1тиннш стшщ (первинних рецептор1в), приеднання в1русних часток до них, а у pa3i наявност1 капсули вщбуваеться вшзнавання капсульних полкахарид1в (вторинних рецептор1в).
Штами Eps+, мають гщрофшьшшу поверхню кл1тин, опосередковану структурою екзополюахариду, який маскуе рецептори на поверхш кл1тини, що вщповщають зазв'язування бактерюфагу з бактер1альною кл1тиною [2-3]. 1снуе думка, що в pa3i ураження бактерюфагом Cps+ штам1в, полкахариди, яю входять до складу кл1тинно! стшки, депол1меризуються. Внаслщок цього фаг не може приеднатись до рецептор1в на поверхш кл1тини [4].
Отже, наявшсть, вид та структура екзополкахарид1в вадграе важливу роль у фагостшкост1 лактобактерш унаслщок зменшення дшянок адсорбцп специф1чних фапв на поверхш бактер1ально! кл1тини, ускладнення руху фапв до кл1тини кр1зь слизовий шар, або ж маскуванш певних рецептор1в.
Метою роботи було дослщження здатносп S. thermophilus продукувати екзополкахариди та вивчення впливу останшх на взаемодш з фагами.
© Науменко О.В., 2013
110
Матер1али та методи. Об'ектами дослщжень були штами S. thermophilus, фаги видоспециф1чш щодо S. thermophilus з колекци вщдшу бютехнологи 1ПР. Стшкють культур до бактерюфапв визначали традицшним в1русолопчним методом шляхом нанесения л1зат1в фапв на чашку Петр1 з твердим поживним середовищем на основ! гщрол1зованого молока та дослщжуваною культурою в логарифм1чнш фаз1 росту [5]. У дослщах використовували фаги титру 107 БУО/см3 об' емом по 0,02 см . Чутливими вважали Ti штами, на газонах яких у мюцях нанесения фагол1зату спостер1гали наявшсть зони л1зису. 1ндекс л1тично! активност1 (1л ) фапв вираховували як вщношення кшькост1 л1зованих штам1в до числа вииробуваних. Встановлення здатносп штам1в S.thermophilus утворювати капсули дослщжували за анал1зом мжроскотчних препарат1в. Для цього готували негативно забарвлеш мжропрепарати за методом Eyppi, змшуючи дослщний матер1ал i3 тушшю i висушуючи мазок за юмнатно! температури на предметному склг Дал1 фарбували капсули за методом Гшса: фксували одержан! препарати 95% етиловим спиртом, промивали водою, фарбували фуксином Циля 5 i мжроскопшвали пщ iMepciero. За допомогою програмного забезпечення Motic Images 2000 (верс1я 1.3) робили мкрофотографп фжсованих препарата штам1в S.thermophilus а також вим1рювали величину ix капсул. Для видшення екзополюахариду нарощували дослщжувану культуру у 100 см3 10% стерильного знежиреного молока за 37°С упродовж 24 год. (3% шокуляту), центрифугували за 6000 об/хв упродовж 15 хв. Надосадову рщину зливали у м1рний цилшдр, вим1рювали вихщний об'ем супернатанту. Даний об'ем дшили на дв1 piBHi частини. Перший зразок надосадово! рщини переносили у д1ал1зний м1шок Fisherbrand (ширина - 45 мм, товщина стшок - 20 мкм) та проводили д1ал1з проти дистильовано! води - видшення вшьного екзопол1сахариду. До другого зразка добавляли один об'ем сульфоцалщилово! кислоти 8% та витримували розчин упродовж 30 хв за температури 4°С, пот1м помщали у д1ал1зний м1шок - видшення капсульного екзополюахариду. Процес д1ал1зу проводили у холодному примщенш, мшяючи дистильовану воду кожну годину до повно1 вщсутност1 низькомолекулярних вуглевод1в. Шсля заюнчення д1ал1зу обидва розчини зливали у MipHi цилшдри, щоб вим1ряти об'ем розчишв на виходг До кожного зразку д1ал1зату добавляли три об'еми холодного етанолу та витримували за температури 4°С упродовж 24 годин. Отримаш зразки центрифугували за 6000 об/хв упродовж 15 хв. Осад переносили у зал1зш бокси для висушування. Вим1рювали окремо вихщну масу бокЫв та разом i3 мокрим осад ом. Обидва бокси ставили у сушильну шафу за температури 55°С. Проводили перюдичне вим1рювання маси даних бокЫв, висушування припиняли теля досягнення стало! ваги [6-9].
Результата дослщження. Встановлено, що 74% вщ загально! кшькоси обстежених штам1в S. thermophilus були резистентними щодо видоспециф1чних фапв fS1 та St-2 з колекци бактерюфапв, видшених за промислових умов (табл.1).
111
За шдексом л1тично! активное^ встановлено, що фаг 8Г2 е агресившшим по вщношенню до дослщжених бактерш. Значения 1л для нього становило 0,26, що у 1,5 раза бшьше шж для фага йь
Мжроскошювання фагостшких (FR) штамв показало, що вони мали гомогенну популяцш кл1тин у культур! - диплококи, ланцюжки коюв, як1 мали капсули. Пщ час морфолопчного анал1зу капсул було встановлено, що !хнш розм1р у FR штам1в термофшьних стрептокоюв варшвав у достатньо широких межах 4,0 - 12,6 мкм (табл. 1) (д1апазон товщини капсули у р1зних штам1в).
Таблиця 1
Взаемозв'язок фагост1йкост11 капсулоутворювально'1 здатносп
S. thermophilus
Номер штаму Наявшсть капсули Розм1р капсули, мкм Фаг 1$1 Фаг St-2
мш-макс середне
2136 + 5,8-8,9 6,3 FR" FR
2142 - - - FS FS
66 + 2,5-9,0 4,9 FR FR
612 - - - FS FS
27с + 3,8-10,9 6,7 FR FR
27 - - - FS FS
2137 + 10,3-10,6 10,5 FR FR
6-15 + 1,5-2,4 1,9 FR FS
2138 + 5,6- 7,7 6,7 FR FR
2196 + 4,9-6,9 5,9 FR FR
2145 + 2,6-6,1 4,3 FR FR
74 + 3,2-4,9 4,0 FR FR
27/2 + 1,2-2,3 1,7 FR FS
2120 + 4,1-8,0 6 FR FR
2185 + 4,1-10,3 6,2 FR FR
2178 + 6,6-9,6 8,1 FR FR
2192 + 8,3-17,0 12,6 FR FR
81 + 10,4-11,6 11,0 FR FR
2168 - - - FS FS
2193 + 9,7-10,1 9,9 FR FR
2147 - - - FS FS
А8М + 11,1-12,7 11,9 FR FR
381/1 + 4,1 - 9,2 6,6 FR FR
Прим1тка: - не мае капсули ; FR/FS - фагостшкий/фагочутливий штам
Фагочутлив1 (FS) штами утворювали дв1 морфогрупи: 1) культури з гетерогенною, неоднор1дною морфолог1ею кл1тин - диплококи без капсул, багато «пустих кл1тин» (кл1тини, що втратили здатн1сть до забарвлення цитоплазми); 2) диплококи в капсулах невеликого розм1ру 1,7 - 1,9 мкм. Капсули такого розм1ру не захищали бактери в1д впливу бактер1офагу St-2, в той час як до фагу 1$ 1 вони були стшкими.
112
Було проведено дослщження рол1 екзополкахаридно! капсули у захисп кл1тин вщ фагового ураження. Для цього пор1внювали фагостшюсть культур S. thermophilus, що продукують Cps, до та теля обробки 30% трихлороцтовою кислотою (ТХО). Вплив кислоти на капсули спостережено безпосередньо пщ мжроскопом, приклад показано для культури St 381/1 нарис. 1.
А Б
Рис. 1 - Фжсоваш препарати культури S. thermophilus 381/1 зафарбоваш за методом Омелянського (збтьшення 10x100):
А - довп ланцюжки kokîb i3 капсулою р1зного розм1ру;
Б - ланцюжки kokîb без капсул.
Кл1тини, яю було оброблено кислотою за температури 20°С, мали характерну для них морфологш - ланцюжки kokîb pi3HOÏ довжини у капсулах. При цьому розм1р капсул варшвав вщ 4,1 до 9,2 мкм (рис.1 А).
Зразок культури St 381/1, який було пщдано не т1льки fliï ТХО, але й нагр1ванню впродовж 5 хв за температури 100°С, не показав наявност1 капсул (рис.1 Б).
Дослщження вщношення до фаг1в fSi та St-2 показало, що оброблен1 культури, позбавлеш природного захисного чохла були вразливими до впливу фаг1в.
У результат! даного досл1дження було виявлено, що приеднання капсули до поверхт кл1тинно1 ctîhkh бактер1й в1дбуваеться дуже м1цно. Robitaille висловлював припущення, що даний зв'язок icHye завдяки електростатичним силам [10].
Оброблення кл1тин культур кислотою призводило до руйнац11 Cps пол1сахариду та, ймов1рно, полегшенню доступу фапв до специф1чних сайт1в-рецепци на бактер1альн1й ст1нц1.
Було встановлено, що здатн1сть культур протистояти впливу бактерюфагу може бути обумовлена р1внем продукц11 як капсульного, так i в1льного пол1сахариду. Так, штами St 381/1 та St 2192 були фагостшкими та мали найвищ1 показники продукц11 Eps та Cps полкахарид1в (рис. 2).
113
Рис. 2 - Вмкт вшьного (Eps) та капсульного (Cps) полкахариду FR та FS культур S. thermophilus
Зроблено пщтвердження кнуючого рашше припущення, що Cps запобкае негативному впливу бактерюфапв. Наприклад, штам St 2136 характеризувався здатнктю до продукци лише Cps полкахариду i був резистентним до фапв (див. рис. 2).
Необхщно зауважити, що невелика за розм1ром капсула не захищала повнктю штами вщ ycix тишв фапв. Культури St 6-15 та St 27/2, хоча i продукували Cps полкахарид, але в значно меншш кшькост1 пор1вняно з FR штамами, i були чутливими до фагу St-2.
Отже, в результат! проведеного дослщження було встановлено структурно-функцюнальш вщмшност1 м1ж FR та FS культурами S. thermophilus та пщтверджено роль Cps полкахариду у захист1 кл1тин вщ фагол1зису.
Таю результата узгоджуються з даними шших дослщниюв, яю стверджують про те, що здатнкть молочнокислих бактерш утворювати капсули позитивно впливае не тшьки на реолопчш властивост1 кисломолочних продукт1в, зокрема, збшьшенням вязкоси, посиленням пластичност1 згустку та його стшкост1 до синерезису при мехашчному втручанш, але й е природшм захисним мехашзмом вщ фагового ураження [11-13]. Про зв'язок м1ж здатнктю до продукци екзополкахарид1в i фагостшкктю повщомляеться у стати Deveau H. et all [14]. Проте автори наголошують, що фагостшккть Eps+ штам1в обумовлена не лише цкю властивктю культури a i, як правило, комплексом шших фагозахисних мехашзм1в.
Однак, на нашу думку, при первинному вщбор1 перспективних штам1в для включения ÏX до складу заквашувальних композицш доцшьно проводите ретельний морфолопчний анал1з штам1в S. thermophilus щодо здатност1 утворювати капсули впродовж росту у молощ або поживному середовищг
У результат! проведено! робота було ввдбрано штами S.thermophilus, яю характеризувались здатнктю до продукування капсульних екзополкахарид1в, фагостшкктю, перспективш до застосування у бютехнолопчних розробках. Штам ГМВ В-7247 захищено патентом Украши № 92287.
114
Висновки.
Виявлено вщмшност! м1ж фагорезистентними та фагочутливими штамами S. thermophilus у продукуванш вшьного та капсульного полкахарид1в кл1тинно1 стшки.
Показано, що екзополюахаридна капсула може захистити кл1тини вщ л1тично1 дп певних тишв фапв S. thermophilus.
Л1тература
1. Gancel F., Novel G. Exopolysaccharide production by Streptococcus salivarius ssp. thermophilus cultures. Conditions of production/Journal of Dairy Science. - 1994. - Vol. 77. - № 3. - P. 124-129.
2. Casteren W. H. M., P. de Waard, Dijkema C., Schols H. A., Voragen A. G. J. Structural characterisation and enzymatic modification of the exopolysaccharide produced by Lactococcus lactis subsp. cremoris B891//Carbohydr. Res. - 2000. - Vol. 327. - P. 411-422.
3. Saxelin M.-L., Nurmiaho E.-L., Korhola M. P., Sundman V. Partial characterization of a new C3-type capsule-dissolving phage of Streptococcus cremoris.//Can. J. Microbiol. - 1979. - Vol. 25. -P. 1182-1187.
4. Van Geel-Schutten G. H., Faber E. J., Smit E., Bonting K. Biochemical and structural characterization of the glucanandfructanexopolysaccharides synthesized by the Lactococcus reuteri wild-type strain and by mutant strain//Applied and Environmental Microbiology. - 2000. - Vol. 65, № 7. - P. 3008-3014.
5. Адаме M. Бактериофаги. - M.: Мир. - 1961. - 527 с.
6. Пирог Т.П., 1ванушкша Г. О., Гарбачук С. О. Модифжащя вагового методу кшькюного визначення пол1сахариду етаполану//Харчова промисловкть. - 2008. - № 7. - С. 14-16.
7. Cerning J. Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria//FEMS Microbiol. - 2007. - Vol. 87. - P. 113-130.
8. Gruter M., Leeflang B. R., Kuiper J., Kamerling J. P., Vliegenthart J. F. G. Structural characterization of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus RR grown in skim milk//Carbohydr. Res. - 2003. -Vol. 239. - P. 209-226.
9. Ricciardi A., Parente E., Crudele M. A., Zanetti F., Scolari G., Mannazzu I. Exopolysaccharide production by Streptococcus thermophilus SY: production and preliminary characterization of the polymer//Journal of Applied Microbiology. -2002. - Vol. 92. - P. 297-306.
10. Robitaille G., Moineau S., St-Gelais D., Vadeboncoeur C., Britten M. Detection and quantification of capsular exopolysaccharides from Streptococcus thermophilus using lectin probes//J. Dairy Sci. - 2006. - Vol. 89. - P. 4156-4162.
11. Hassan A.N., Frank J.F., Smidt K.A., Shalabi S.I. Rheological properties of yogurt made with encapsulated nonropy lactic cultures//Journal of Dairy Sciense. -1996. - № 79. - P. 2091-2097.
12. Hassan A.N., Corredig M., Frank J. F. Capsule formation by nonropy starter affects the viscoelastic properties of yogurt during structure formation// Journal of Dairy Science. - 2002. - Vol 85. - №4. - P. 716-720.
115
13. Hassan A. N., Ipsen R., Janzen T., Qvist K.B. Microstructure and rheology of yogurt made with cultures differing only in their ability to produce exopolysaccharides//Journal of Dairy Science. - 2003. - № 86. - P. 1632-1638.
14. Deveau H., Marie-Rose Van Calsteren, Moineau S. Effect of exopolysaccharides on phage-host interactions in Lactococcus lactis//Appl. Environ. Microbiol.-2002.- Vol. 68, N 9. - P.4364-4369.
Summary
O. V. Naumenko, Ph. D., Senior Researcher Institute of Food Resources of National Academy of Agrarian Sciences, Kiev,
Ukraine
INVESTIGATION OF EXOPOLYSACCHARIDE CAPSULE IN PROTECTION OF STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS CELLS FROM
PHAGES
The influence of species specific phages fSj and St-2 on strains S. thermophilus from the collection of Institute of Food Resources were investigated. The differences between phage-resistant and phage-sensitive strains S. thermophilus in producing free and capsular polysaccharides of cell wall were detected. It was shown that exopolysaccharide capsule can facilitate cells protection from lytic action of some types of phage S. thermophilus. The strain S. thermophilus 1MB B-7247 was selected, it is characterized by its ability to produce capsular polysaccharides and it is phage-resistant to a wide range of phages.
Рецензент - д.б.н., професор Куртяк Б.М.
116
