CC BY
11
Науковий в1сник Льв1вського нацюнального ушверситету ветеринарно'1 медицини та бютехнологш 1меш С.З. Гжицького.
Сер1я: Ветеринарш науки
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. Series: Veterinary sciences
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
doi: 10.32718/nvlvet9405 http://nvlvet.com.ua
UDC 619:615.283.015.099:639.215.2
Study of acute and subacute toxicity parameters of "Rybokhin" biological product on the model of carp
A.V. Yevtushenko, O.S. Sirenko, V.S. Boyko, M.E. Romanko
National Scientific Center "Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine ", Kharkov, Ukraine
Article info
Received 22.03.2019 Received in revised form
22.04.2019 Accepted 23.04.2019
National Scientific Center
"Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine ", Pushkinska Str., 82, Kharkov, 61023, Ukraine Tel.: +38067-706-88-22 E-mail: [email protected]
Yevtushenko, A.V., Sirenko, O.S., Boyko, V.S., & Romanko, M.E. (2019). Study of acute and subacute toxicity parameters of "Rybokhin" biological product on the model of carp. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. Series: Veterinary sciences, 21(94), 25-32. doi: 10.32718/nvlvet9405
The goal of the work was to study of acute and subacute toxicity parameters of "Rybokhin" biological product (AI — chloroquine refer to derivatives 4-aminohinolines) on the model of carp. This drug is effective in the treatment of diseases caused by parasitic Protozoa and Monogenea. Carp scales of two years old were used in experiments. To determine acute toxicity, the fish were prescribed with chloroquine (by AI) in doses of 100; 200; 300; 400; 500; 600; 800; 1000 mg/kg of live weight. Two experimental and control fish groups of 30 individuals each were formed to determine subacute toxicity of "Rybokhin". Experimental groups offish were prescribed with "Rybokhin " in a dose (by AI) of 50 mg/kg and 10 mg/kg for two consecutive days. Blood samples were collected from six fish species from each group for clinical and biochemical indicators after 48 hours, 7, 14, 21 and 28 days. The hemoglobin content, number of red blood cells and leukocytes blood were determined. The intensity of peroxide oxidation oof lipids (POL), catalase activity, level of total antioxidant capacity (TAC), total proteins, albumin, globulins and glucose, circulating immune complexes (CIC) and seromucoids concentration, level of enzymatic activity: aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT), a-amylase blood plasma were determined. According to the research results, indicators of acute toxicity for carp were determined, namely LD50 oof chloroquine is 528.66 ± 68.01 mg/kg; LD16 — 224.512 mg/kg; LD&4 — 832.81 mg/kg; LDjaa — 984.89 mg/kg, which indicate that the drug is low-toxic to fish (belongs to the fourth group of toxicity). When administrating of 50.0 mg/kg of "Rybokhin" (by AI) twice a day, the most expressed metabolic changes in fish body were observed on 21 day after its last administration. Thus, the drug's toxic impact is in proteinogram alteration, transamination processes and in decreasing offish immune reactivity. It points to the prevalence of catalytic processes over anabolic. Metabolic alterations are obviously directed to the activation of detoxication processes with increased energy use in fish body after getting of higher dosage of the product. So, on 28 day of experiment, the major part of studied parameters retrieved to control level. It was found that when the product was administrated twice a day in the dosage 10.0 mg/kg (by AI), which is used for treatment of parasitic diseases, no reliable changes of clinical and biochemical indices were detected in fish blood during the experiment.
Key words: chloroquine, fish, lethal dose, acute toxicity, submerged toxicity, blood, clinical and biochemical indicators.
Вивчення napaMeTpiB гостроУ та шдгостроУ токсичной препарату "Рибохш" на модeлi коропа
А.В. бвтушенко, О.С. С1ренко, В.С. Бойко, М.£. Романько
Нацюналъний науковий центр "1нститут експерименталъног i кпшчног ветеринарног медицини м. XapKie, Украгна
Метою до^джень було визначити параметры гострог та тдгострог moKCU4Hocmi препарату "Рибохт " (ДР - хлорохт, якш е похiдною 4-амiнохiнолiнiв) на моделi коропа лускатого. Даний препарат е ефективним при л^вант захворювань, спричинених паразитичними нашпростШими (Protozoa) та моногенетичними присиснями (Monogenea). У експериментах використовували коропа лускатого дволШнього вi-ку. При визначенш гострог токсичностi рибам задавали хлорохт (ДР) у дозах 100; 200; 300; 400; 500; 600; 800; 1000 мг/кг маси тта. Для визначення тдгострог токсичностi препарату "Рибохн " було сформовано двi до^дн та контрольна групи риб по 30 особин у кожнш. P^i до^дних груп двi доби поспть задавали препарат "Рибохт " у добовт дозi 50 мг/кг та 10 мг/кг маси тта (за ДР). Через 48 год, 7, 14, 21 та 28 дiб з метою клтто-бюхмчних до^джень проводили вiдбiр кровi у шести особин риб з кожног групи. У кровi визначали вмкт гемоглобту, кмьтсть еритроцитiв i лейкоцитiв. У плазмi кровi визначали ттенсивтсть процесiв пероксидного окиснення лiпiдiв (ПОЛ), каталазну активтсть, рiвень загальног антиокиснюваль-ног активностi (загальна АОА); вмкт загальних протегтв, альбумту i глюкози; концентращю циркулюючих мунних комплекЫв (Ц1К) i серомукоШв; рiвень ензиматичног активностi: аспартатамтотрансферази (АсАТ), алантамтотрансферази (АлАТ) i а-амтази. За результатами до^джень визначено показники гострог токсичностi для коропа: LD50 хлорохту становить 528,66 ± 68,01 мг/кг; LD16 - 224,512 мг/кг; LD84 - 832,81 мг/кг; LD100 - 984,89 мг/кг маси тта, як вказують, що препарат е малотоксичним для риб (належить до четвертог групи токсичностг). Максимальну виражетсть метаболiчних змт в органiзмi риб за дворазового застосування препарату "Ри/бохт " в добовт дозi 50,0 мг/кг маси тта (за ДР) виявляли на 21-шу добу тсля останнього задавання. Так, мехатзми токсичног дИ препарату полягають у перебудовах в протегнограмi i процесах переамтування та гальмуванн ii^^ ног реактивностi в органiзмi риб, що вказуе на превалювання катаболiчних процеЫв над анаболiчними. Метаболiчнi перебудови, очевидно, спрямован на активацю процеЫв детоксикацИ з тдвищенням енергетичних затрат в органiзмi риби вна^док потрап-ляння тдвищених доз препарату. Отже, на 28-му добу експерименту левова частка до^джених показнимв за значенням вiднов-лювалась до контрольного рiвня. Встановлено, що за дворазового введення препарату в добовт дозi 10,0 мг/кг маси тта (за ДР), яка е л^вальною при боротьбi iз паразитарними хворобами, у динамщ експерименту не виявляли достовiрних змт клтто-бiохiмiчних показнимв кровi до^днихриб.
Ключовi слова: хлорох1н, риба, летальна доза, гостра токсичтсть, тдгостра токсичтсть, кров, клiнiко-бiохiмiчнi показники.
Вступ
Хлорохш (C18H26ClN3) належить до похщних 4-ашнохшолтв, мехашзм дп яких полягае у пригш-ченш синтезу ДНК, що спричиняе загибель плазмодш паразилв та амеб. У ссавщв препарат швидко та практично повшстю всмоктуеться з ШКТ, створюючи максимальну концентращю у кров1 через 2-6 год. У великих концентращях виявляеться в органах та тканинах (печшщ, нирках, селезшщ). Постшний р1вень хлорах1ну в плазм1 кров1 рееструеться через с1м д1б шсля початку застосування. У незначнш м1р1 метабо-л1зуеться в оргашзм^ 70% виводиться у незмшному видь Видшяеться з оргашзму повшьно: концентращя в плазм1 кров1 знижуеться на 50% протягом трьох д1б (Vaziri & Warburton, 1994).
Хлорохш застосовуеться у медицин для лшування та профшактики малярп, позакишкового амебюзу, амебного абсцесу печшки, хрошчно! та шдгостро! форми системного червоного вовчака, склеродермп, ревматоидного артриту, фотодерматозу, шзньо! шшр-но! порф1рп (Krafts et al., 2012).
Актуальшсть дослщжень обумовлено ефектившс-тю даного засобу при ткуванш захворювань, спричинених паразитичними найпростшими (Protozoa) та моногенетичними присиснями (клас Monogenea) (Hemdal, 2013), тому визначення його впливу на орга-шзм риб вимагае проведення додаткових дослщжень.
Метою дослщжень було визначити параметри го-стро! (летально!) та пщгостро! токсичносп препарату "Рибохш" на модел1 коропа лускатого.
MaTepia™ i методи дослщжень
Дослщ з визначення гостро! токсичносп хлорох1ну проводили, як описано (Коцюмбас 1.Я., 2006), моди-фшованих для коропа (Kotsiumbas, 2006). У дослщ використовували коропа лускатого дволггнього вшу. При цьому було проведено попереднш дослщ з ви-
значення ор1ентовно! середньо смертельно! дози, тсля чого у трьох послщовностях здшснювали розгор-нутий дослщ з визначення основних параметр1в гостро! токсичносп: DL50 ± m, DL0, DL100 DL16, DL84, яш розраховували за Прозоровским В.Б. (2007) (Prozorovskij, 2007).
На наступному еташ дослщжень визначали вплив препарату "Рибохш" на б1ох1м1чн1 та клшчш показники кров1 риб у динамщ пщгострого токсиколопч-ного експерименту. Дослщ проводили з використан-ням коропа дволгтнього вшу. При цьому було сформовано дв1 дослщш та контрольна групи риб по 30 особин у кожнш. Риби кожно! групи утримувались в окремих аквар1умах емшстю 200 дм3 з1 штучною аерац1ею та температури 18-22 С. У перш1й та другш досл1дних групах риб1 дв1 доби посп1ль задавали препарат "Рибохш" у добовш доз1 50 мг/кг та 10 мг/кг маси тша (за ДР) вщповщно. Препарат рибам задавали 1ндив1дуально за допомогою катетеру на основ1 1% крохмального клейстеру. У контрольн1й груш риб1 задавали крохмальний клейстер без препарату (Demidov & Berezkina, 1986). З метою клшшо-б1ох1м1чних дослвджень через 48 год, 7, 14, 21 та 28 д1б проводили ввдб1р кров1 у шести особин риб з кожно! групи. Кров забирали пастер1вською шпеткою 1з хвостово! артер1! за загальноприйнятим методом. При цьому для дослщжень кл1н1чних показнишв кров стаб1л1зували гепарином, для визначення бюх1м1чних показник1в отримували сироватку кров1.
Ман1пуляц1! над рибами зд1йснювали вщповщно до 1снуючих нормативних документ1в, що регламен-тують орган1зац1ю роб1т 1з використанням експериме-нтальних тварин i дотримання принцип1в "Свропей-сько! конвенцп про захист хребетних тварин, що ви-користовуються в експериментальних та шших нау-кових цiлях" (European convention ...).
Iнтенсивнiсть процесiв пероксидного окиснення лшщв (ПОЛ) у плазмi кровi визначали за рiвнем утворення його продуктiв: первинних - дiенових
кон'югапв (ДК) i к1нцевих - малонового д1альдепду (ТБК-активних продуктiв) за умов екстракцп у сумiшi гептанiзопропанол (1:1), як описано (Gavrilov & Mishkorudnaja, 1983); за довжини хвиль 233 i 247 нм; значення ДК виражали у mkmole/dm3, а МДА - в оди-ницях питомого поглинання у 1,0 cm3 (AD/cm3).
Каталазну активнiсть (К. F. 1.11.1.6) у плазмi кровi визначали, як описано (Koroljuk, 1988), з використан-ням Н2О2 у середовищi iнкубацiï (0,04412 N розчин Н2О2, 0,01 N розчин КН2РО4, 0,1 М Tris-HCl буфер, рН 7.4, 4.5 % розчин амошю молiбденовокислого); за температури 37 ± 1 °С; за довжини хвилi 410 нм; виражали у mkmole Н2О2/dm3 за 1 хв.
Рiвень загально1 антиокиснювальноï активностi (загальна АОА) у плазмi кровi визначали, як описано (Klebanov, 1988), за сумарною здатнiстю структурних антиоксидантiв гальмувати накопичення ТБК-активних продуклв, iндукованих в середовищi 25 mM FeSO4 у 0,002 N HCl; за довжини хвилi 535 нм; виражали у % шпбщп утворення ТБК-активних продуктiв.
Рiвень гематологiчних показник1в та вмiст загаль-них протеïнiв, альбумiну, глюкози та рiвень ензима-тично1 активностi: аспартатамшотрансферази (AST, К. F. 2.6.1.1), аланшамшотрансферази (ALT, К. F. 2.6.1.2), â-амшази (К. F. 3.2.1.1) у плазмi кровi визначали загальноприйнятими методами та з вико-ристанням наборiв реактивiв виробництва CORMAY
(Poland), як описано в довщнику (Vlizlo, 2012). Кон-центрацш циркулюючих iмунних комплексiв (Ц1К) середньоï молекулярноï маси визначали, як описано (Kondrahin, 1985), осаджуванням бшкових комплексiв антиген-антитiло PEG-6000; серомукоïдiв, як описано (Men'shikov, 1987); за довжини хвиль 260 i 280 нм; виражали у mg/cm3.
Реестрацш бiохiмiчних показник1в здiйснювали на спектрофотометрi SHIMADZU UV-1800 (Japan).
Статистична обробка отриманих результатiв здш-снювали згiдно з рекомендащями з бiометрiï за допо-могою пакета прикладних програм Microsoft Excel for Windows XP.
Результата та ïx обговорення
При проведенш орieнтовного дослiду з визначення гостро1' токсичностi хлорохiну (ДР) для ставкових риб препарат задавали у дозах 0,1 г, 1 г, 5 г, 10 г на 1 кг маси тша. У групах риб, яким задавали препарат у дозi вище за 1 г/кг реестрували 100% загибель риб, у дозi 0,1 г/кг маси тша загибелi риб не реестрували. За результатами цього дослщу було проведено розгорну-тий дослщ в якому рибам задавали хлорохш (ДР) у дозах 100 мг/кг, 200 мг/кг, 300 мг/кг, 400 мг/кг, 500 мг/кг, 600 мг/кг, 800 мг/кг, 1000 мг/кг маси тша. Результати проведеного дослщу наведеш у таблищ 1.
Таблиця 1
Результати дослщжень щодо визначення параметрiв гостро!' летально!' дози хлорох^ (n = 8)
Група риб Юльюсть риб у грут Доза хлорохшу (ДР), мг/кг маси тша Кшьюсть загиблих риб % Початок загибелi (доба)
1 8 100 0 0 -
2 8 200 0 0 -
3 8 300 1 13 2
4 8 400 4 50 2
5 8 500 6 75 1
6 8 600 3 38 1
7 8 800 6 75 1
8 8 1000 8 100 1
9 8 контроль 0 0 -
Шсля задавання препарату протягом першоï доби загинули всi вiсiм риб у восьмш дослiднiй групi, по шють риб у п'ятiй та сьомш групах, три риби у шос-тiй групi. На другу доби загинуло чотири риби у чет-вертiй дослiднiй групi та одна риба у третш дослщнш групi. Бiльше загибел1 риб в жоднш дослiднiй групi протягом 21 доби спостережень не реестрували. У дев'ятiй (контрольнш) групi загибелi риб протягом всього перюду дослщжень також не реестрували.
За отриманими даними було проведено розраху-нок параметрiв токсичностi хлорохшу для коропа, результати якого наведеш у таблищ 2.
Отже, для коропа лускатого LD50 хлорохiну стано-вить 528,66 ± 68,01 мг/кг; LD16 = 224,512 мг/кг; LD84 =
832,81 мг/кг; LD100 = 984,89 мг/кг маси тша, яш вка-зують, що препарат е малотоксичним для риб (нале-жить до четвертоï групи токсичностi).
Для визначення впливу препарату "Рибохш" на оргашзм риб були проведенi дослщження з визначення деяких клiнiко-бiохiмiчних показник1в кровi при введеннi лiкувальноï дози та дози, що перевищуе таку у п'ять разiв.
Протягом усього перюду дослщжень змiн поведш-ки у риб дослiдних та контрольноï груп не рееструва-ли: риби активно плавали та вживали корм, жодна особина риби не загинула.
У таблищ 3 наведеш результати дослщжень дина-мiки гематологiчних показник1в.
Таблиця 2
Результати розрахунку параметр1в токсичност хлорохшу для коропа
Стимул (Доза) Ыдсоток (%) N Пробгг (Y) Ваговип коефщент (Z)
200 0,03125 8 3,1368 1,2737
300 0,125 8 3,8496 3,0487
400 0,5 8 5,0000 5,000
500 0,75 8 5,6742 4,1516
600 0,375 8 4,6818 4,6818
800 0,75 8 5,6742 4,1516
1000 0,96875 8 6,86315 1,2737
Регресшна статистика
ЛД50 528,66 ЛД50 Стандартна похибка 68,01
Нижня границя ЛД50 (LD50 LCL) 286,67 Верхня границя ЛД50 (LD50 UCL) 770,65
Бета 0,00329 Y-перетинання (intercept) 3,2618
Бета Стандартна похибка 0,0010
ЛД10 138,82 ЛД16 224,512
ЛД84 832,81 ЛД90 918,50
ЛД100 984,89
Таблиця 3
Динамша гематолопчних показник1в у коропа за дворазового введення препарату 50,0 мг/кг та 10 мг/кг маси тша (за ДР) (n = 6; М ± m)
'Рибохш" у добовш доз1
Показники Група риб Строки дослiджеиия
дт доби 7 Д16 14 Д16 21 доба 28 д16
Iгрупа 93,1 ± 3,0 77 7 ± 2 3*** 79,4 ± 4,8* 71,3 ± 3,6**** 76,7 ± 1,8****
гемоглобш, г/л II група 98,5 ± 3,1 86,3 ± 2,5* 91,5 ± 5,6 96,0 ± 5,7 99,9 ± 1,4
Контроль 99,5 ± 3,7 92,2 ± 1,5 96,3 ± 5,1 100,2 ± 2,7 101,3 ± 0,9
еритроцити млн./мкл I група II група Контроль 0,72 ± 0,04 0,74 ± 0,02 0,76 ± 0,02 0,75 ± 0,04 0,77 ± 0,02 0,78 ± 0,04 0,88 ± 0,03** 0,80 ± 0,02 0,76 ± 0,01 0,97 ± 0,05** 0,79 ± 0,01 0,78 ± 0,01 0,89 ± 0,03* 0,80 ± 0,02 0,78 ± 0,03
лепкоцити тис./мкл I група II група Контроль 19,80 ± 0,74 19,75 ± 0,48 19,55 ± 0,56 19,70 ± 0,52 19,65 ± 0,31 19,55 ± 0,51 19,55 ± 0,73 19,90 ± 0,60 19,75 ± 0,85 19,50 ± 0,96 20,0 ± 0,71 19,80 ± 0,64 19,35 ± 0,57 19,40 ± 0,55 19,90 ± 0,59
Примтка: * - р1зниця в1рог1дна при * - (Р < 0,1); ** - (Р < 0,05);
по в1дношенню до контрольних значень в1дпов1дних показниюв у цеп терм1н досл1джень *** - (Р < 0,01) ; **** - (Р < 0,001)
Даш таблиц 3 свщчать, що при задаванш препарату "Рибохш" у доз1 (за ДР) 50,0 мг/кг маси тша, почи-наючи з сьомо! та по 28-му добу включно, рееструва-ли в1ропдне зниження вмюту загального гемоглобшу в кров1 риб дослщно! групи пор1вняно з контрольни-ми значениями показника. Так, на 7-; 14-; 21- i 28-му добу експерименту в кровi дослщних риб зниження показника складало 15,7; 17,5; 28.8 i 24,3% (Р < 0.05) вщповщно.
При цьому варто зазначити, що кшьшсть еритро-цитiв у кровi дослщних риб, починаючи з 14-1 та по 28-му добу включно, вiрогiдно збiльшувалась пор1в-няно з контролем, що в середньому дорiвнювало 18,1% (Р < 0.05). Отримаш результати вказують на наявнип вплив препарату на гемопоез риб, якип су-проводжувався зменшенням наповнения "червоних" клiтин гемом поряд зi зростанням 1хньо1 кiлькостi, що може бути ознакою згущення кровi дослщних риб.
Водночас при задаванш "Рибохiну" в дозi (за ДР) 10,0 мг/кг маси тша протягом всього перюду дослiду
змiн гематологiчних показник1в порiвняно з контрольною групою риб не реестрували, лише на сьому добу спостерiгали достов!рне зменшення вм1сту гемо-гло61ну на 9,4%.
Динашка 61ох1м1чних показнишв кров! та маркер!в вродженого iмунiтету риб наведена у таблищ 4.
Даш, наведеш у таблищ 4, свщчать, що у шизм! кров1 риб I дослщно! групи статистичних змш вм1сту загальних проте!шв впродовж експерименту не реест-рували. Виняток складала тенденцiя щодо зниження р1вня показника на 21-шу добу п1сля введення препарату. Але введення препарату в токсичнш доз1 справляло вплив на рiвень альбумiнiв плазми кров1 риб. Так, на 14-ту i 21-шу добу к1льк1сть альбумшв в1рог1-дно знижувалась пор1вняно з 1х контрольним рiвнем в середньому на 16,0 i 9,8% (Р < 0,05), залишаючись такою за тенденщею п на 28-му добу експерименту, але не в1рог1дно.
Таблиця 4
Бюх1м1чш показники кров1 та маркери вродженого 1мун1тету риб за дворазового введения препарату "Рибохш" у добовш доз1 50,0 мг/кг та 10 мг/кг кг маси тша (за ДР) (n = 6; М ± m)
Показники Група риб Строки дослщження
дт доби 7 дiб 14 дiб 21 доба 28 дiб
Загальш проте!ни, г/л Iгрупа 33,37 ± 0,78 32,05 ± 0,93 32,34 ± 0,71 30,97 ± 0,95 32,01 ± 1,04
II група Контроль 32,37 ± 0,84 33,42 ± 1,00 33,69 ± 1,27 34,21 ±1,01 32,73 ± 0,47 33,81 ±1,14 32,82 ± 1,0 33,62 ± 1,05 33,02 ± 1,03 32,62 ±0,76
Альбумши, г/л I група 20,70 ± 0,53 19,09 ± 0,54 17,55 ± 0,59** 17,88 ± 0,42* 17,99 ± 1,0
II група 20,0 ± 0,21 19,68 ± 0,42 20,0 ± 0,31 18,85 ± 0,84 17,79 ± 0,65
Контроль 19,60 ± 0,30 20,12 ±1,28 20,9 ±1,03 19,83 ±0,78 19,64 ±1,04
Глобулши, г/л I група 12,67 ± 0,94 12,96 ± 0,82 14,79 ± 1,31 13,10 ± 0,62 14,02 ± 0,80
II група 12,37 ± 0,64 14,01 ± 1,65 12,73 ± 0,38 13,97 ± 1,13 15,23 ± 1,58
Контроль 13,82 ± 0,71 14,10 ± 1,88 12,91 ± 0,66 13,79 ± 0,66 12,98 ± 0,84
Ц1К мг/мл I група 0,115 ± 0,006 0,110 ± 0,004 0,105 ± 0,003** 0,105 ± 0,003* 0,113 ± 0,008
II група 0,113 ± 0,005 0,113 ± 0,005 0,118 ± 0,005 0,113 ± 0,005 0,115 ± 0,006
Контроль 0,110 ± 0,004 0,118 ± 0,009 0,120 ± 0,004 0,120 ± 0,004 0,118 ± 0,007
Sm мг/мл I група 0,18 ± 0,004 0,188 ± 0,004 0,180 ± 0,004 0,20 ± 0,01 0,20 ± 0,01
II група 0,17 ± 0,004 0,17 ± 0,005 0,18 ± 0,004 0,20 ± 0,005 0,198 ± 0,005
Контроль 0,17 ± 0,01 0,18 ± 0,01 0,178 ± 0,005 0,19 ± 0,01 0,193 ± 0,003
Примтка: * - р1зниця в1рог1дна при * - (Р < 0,1); ** - (Р < 0,05);
по в1дношенню до *** — (р < 0 01) ' **
контрольних значень в1дпов1дних показиикв у цеи терм1н досл1джень ** - (Р < 0,001)
Поряд з цим, на 14- i 21-шу добу дослщу реестру-вали зниження утворення циркулюючих iмунних комплексiв (Ц1К) середньо! молекулярно! маси в се-редньому на 12,5% (Р < 0,05) щодо !х контрольних значень, що узгоджуеться з визначеним типом проте!-нограми плазми кровi та поряд iз зниженим вмiстом гемоглобiну вказуе на тимчасове пригнiчения iмунноl реактивносп в органiзмi дослвдних риб. Встановлеш змiни показникiв наприкiнцi експерименту мали част-кове ввдновлення.
Зрушення бшкового обмiну, а також посилення утворення лшопротещв, як1 е необхiдними для вщно-влення уражених клiтинних мембран, показано за ди
низки ксенобiотикiв (Al-Akel et al., 2010; Gutyj et al., 2017; Khariv et al., 2017).
Iншi показники стану неспецифiчноl резистентно-стi в органiзмi риб (кiлькiсть леИкоцитiв та гострофа-зних проте!шв - серомукощв) не набували статисти-чних змiн впродовж експерименту та не вiдрiзиялись ввд !х контрольного рiвия.
Достовiрних змш бiохiмiчних показник1в кровi та маркерiв вродженого iмунiтету у риб II дослвдно! групи, порiвияно з контрольною, протягом всього перiоду дослвджень не реестрували.
Данi щодо динамiки ензимiв та глюкози у плазмi кровi коропа за дворазового застосування препарату "Рибохш" наведеш у таблицi 5.
Таблиця 5
Динамша ензимiв та глюкози у плазмi кровi коропа за дворазового введения препарату "Рибохш" у добовш дозi 50,0 мг/кг та 10 мг/кг маси тша (за ДР) (n = 6; М ± m)
Показники група Строки дослщжень
дт доби 7 дiб 14 дiб 21 доба 28 дiб
АлАТ, ммоль/год.л I група 0,35 ± 0,01 0,35 ± 0,003 0,32 ± 0,01** 0,3 ± 0,01* 0,39 ± 0,01
II група Контроль 0,36 ± 0,01 0,36 ± 0,003 0,37 ± 0,01 0,37 ±0,02 0,39 ± 0,04 0,38 ±0,01 0,42 ± 0,03 0,40 ±0,04 0,40 ± 0,01 0,41 ±0,01
АсАТ, ммоль/год.л I група 2,69 ± 0,02** 2,69 ± 0,08*** 2,58 ± 0,03** 2,29 ± 0,02 2,16 ± 0,04
II група Контроль 2,15 ± 0,02 2,13 ± 0,12 2,04 ± 0,11 2,1 ±0,06 1,82 ± 0,23 2,07 ±0,11 2,03 ± 0,08 2,11 ±0,10 2,11 ± 0,03 2,09 ± 0,09
а-амшаза, мг/сек.л I група II група Контроль 5,18 ± 0,09 5,06 ± 0,05 4,98 ± 0,03 5,09 ± 0,07 5,07 ± 0,09 4,97 ± 0,03 5,12 ± 0,08 4,87 ± 0,19 4,97 ± 0,03 5,55 ± 0,03**** 5,19 ± 0,07 5,01 ± 0,02 5,19 ± 0,07 5.07 ± 0,07 5.08 ± 0,07
Глюкоза, ммоль/л I група 4,09 ± 0,04*** 3,33 ± 0,08* 3,15 ± 0,05** 3,12 ± 0,03** 3,26 ± 0,09
II група 3,63 ± 0,07 3,35 ± 0,10 3,45 ± 0,17 3,30 ± 0,10 3,55 ± 0,18
Контроль 3,56 ± 0,06 3,51 ±0,03 3,52 ±0,14 3,57 ±0,14 3,56 ±0,13
Примтка: * -при * - (Р < 0,
- рiзниця вiрогiдиа 1); ** - (Р < 0,05);
по вдаошеиию *** - (Р < 0,01)
до контрольних значень вiдповiдиих показиикв у цеи термш дослвджень
**** - (Р < 0,001)
Як показано в таблиц 5, динашка глюкози в плаз-мi кровi риб I дослшно! групи впродовж експерименту мала коливальний характер. Так, умiст глюкози в
плазмi кровi риб дослшно! групи через 2 доби шсля введения препарату зростав у середньому на 14,9% (Р < 0.05), через 7 дiб - знижувався i не вiдрiзнявся вiд
контролю, а в наступи термши дослщжень - на 14- i 21-шу добу - вiрогiдно знижувався в середньому на 10,5 i 12,6% порiвняно з контролем. На остаточному термш дослщу - на 28-му добу - рiвень глюкози у плазмi кровi риб за значенням статистично не вiдрiз-нявся ввд контрольного. При цьому в риб II дослвдно1 групи достовiрних змiн умюту глюкози в плазмi кровi не реестрували, спостерiгалась лише тенденцiя до його зменшення у перюд iз сьомо! до 21-ï доби. Отже, за шдсумком отриманих результатiв можна припусти-ти, що визначена спочатку експерименту мобiлiзацiя енергетичного обмiну носить адаитацшний характер, але в подальшому - характеризуеться компенсатор-ним витрачанням енергетичних ресурсiв, спрямова-ним на активацш процесiв детоксикацiï внаслiдок введення лшарського засобу в токсичнiй дозi.
Вважають, що величина iндукцiï активностi гепа-тоспецифiчних ензимiв у кровi е пропорцшною сту-пеню руйнування гепатоцилв i активностi патолопч-ного процесу (Hazanov, 1988; Bono, 1994; Todoriuk et al., 2018).
Введення препарату також справляе вплив на ш-тенсивнiсть процесiв переамiнування в печшщ та мiокардi риб (табл. 5). Так, на 14- i 21-шу добу експерименту в риб I дослiдноï групи реестрували вiрогiдне зниження ензиматичноï активностi АлАТ у плазмi кровi риб в середньому на 15,8 i 25,0% (Р < 0.05) порь вняно з контролем, що узгоджуеться з динамшою вмiсту глюкози та вказуе на зниження утворення не-доокиснених продукпв у риб, в тому числ1 - пiрувату.
Поряд з цим впродовж експерименту у риб I дос-лiдноï групи визначено поступову активащю iншого ензиму - АсАТ, який бере участь у забезпеченш ци-топлазми субстратами для глюконеогенезу при пере-твореннi пiрувату до глюкози (Dirksen et al., 1990). Так, пвдвищення рiвня активностi ензиму в плазмi кровi дослвдних риб на 2-; 7-; 14- i 21-шу добу склада-ло 26,3; 28,1; 24,6 i 8,5% (Р < 0,05) порiвняно з ïï кон-трольними значеннями. З одного боку, отримаш результати також узгоджуються з динамiкою вмiсту глюкози, а з шшого - е ознакою ураження паренхiма-тозних клггин i додаткового навантаження на мюкард в органiзмi дослвдних риб.
Зниження вмюту глюкози в плазмi кровi риб I дос-л1дно1' групи на 14- i 21-шу добу шсля введення препарату, очевидно, ввдбуваеться також за участю акти-вносп a-амiлази, яка на 21-шу добу експерименту за значенням була вiрогiдно вищою за контрольний рiвень ензиму на 10,8%.
Варто зазначити, що, за даними таблищ 5, достовь рних змш активностi ензимiв АлАТ, АсАТ та a-амшази у риб II досл1дно1' групи порiвнянно з контрольною не реестрували.
На тимчасове пвдвищення iнтенсивностi деструк-тивних процеав у печiнцi через можливий розвиток оксидативного стресу за дй' препарату в токсичнш дозi вказуе динашка утворення продукпв лшоперок-сидацiï - ДК i ТБК (табл. 6).
Таблиця 6
Штенсивнють процесiв лшопероксидацп та активнiсть антиокислювальноï системи в органiзмi коропа за дворазового введення препарату "Рибохш" у добовш дозi 50,0 мг/кг та 10 мг/кг маси тша (за ДР) (n = 6; М ± m)
Показники
Строки дослвджень
ДК мкмоль/л
ТБК АД
дт доби 7 дiб 14 дiб 21 доба 28 дiб
Щтенсившсть процесш ПОЛ
Iгрупа 32,31 ± 0,86** 32,87 ± 0,47** 38,24 ± 2,31** 33,06 ± 1,51*** 27,22 ± 1,63
II група 25,83 ± 1,34 24,53 ± 1,45 25,61 ± 0,67 25,83 ± 0,50 26,18 ± 0,33
Контроль 26,02 ± 1,51 25,85 ± 1,67 26,15 ± 0,42 26,31 ± 0,28 25,96 ± 2,08
Iгрупа 3,10 ± 0,16** 4,48 ± 0,14** 5,84 ± 0,19 5,86 ± 0,12 6,03 ± 0,58
II група 5,38 ± 0,14 5,59 ± 0,18 5,60 ± 0,28 5,65 ± 0,26 5,68 ± 0,30
Контроль 5,64 ± 0,28 5,74 ± 0,27 5,74 ± 0,38 5,80 ± 0,16 5,81 ± 0,41
Актившсть АОС
Iгрупа 20,2 ± 0,9 18,5 ± 0,7 19,2 ± 1,0 18,9 ± 0,5 19,8 ± 1,5
II група 21,9 ± 0,9* 19,1 ± 0,4 19,6 ± 0,6 19,8 ± 0,5 19,8 ± 0,4
Контроль 19,6 ± 0,7 19,6 ± 0,6 20,1 ± 0,3 19,9 ± 0,6 20,2 ± 0,7
Iгрупа 52,8 ± 6,9 53,9 ± 3,3 48,5 ± 3,7** 43,8 ± 3,1*** 50,6 ± 3,3*
II група 55,8 ± 4,6 57,6 ± 3,0 58,1 ± 0,9 57,9 ± 0,6 58,4 ± 3,6
Контроль 57,7 ± 4,6 58,6 ± 6,3 58,7 ± 1,1 57,3 ± 0,7 59,1 ± 1,6
Каталазна активнiстъ, ммоль Н2О2/г бшка у хв.
загальна АОА % шпбщц
У плазмi кровi риб I дослiдноï групи встановлено вiрогiдне зростання утворення первинних продукпв ПОЛ - ДК, починаючи з друпн та 21-ï доби включно (вш 24,2 до 46,3%; Р < 0,05), порiвняно з контрольним рiвнем показника. Значення показника наприкшщ експерименту (через 28 дiб) наближались до його контрольного рiвня. На цей час (на другу i сьому добу експерименту) реестрували, навпаки, зниження рiвня утворення к1нцевих продукпв ПОЛ - ТБК, що у сере-
дньому складало 45,0 i 12,0% (Р < 0.05) ввдповшно. Починаючи з 14- та до 28-ï доби включно вмют ТБК у плазмi кровi дослвдних риб статистично не вiдрiзняв-ся вш його контрольного рiвня. У риб як II досл1дно1, так i контрольноï групи змiн у динамщ утворення продуктiв лiпопероксидацiï ДК i МДА не реестрували.
При дослвдженш показнишв антиокиснювальноï системи (АОС) за впливу препарату в токсичнш дозi впродовж експерименту не реестрували змш рiвня
каталазно! активносп (табл. 6). 1нший характер змш мав показник загально! АОА у плазм1 кров1 риб в динамщ експерименту. Внаслщок введения препарату у плазм1 кров1 риб I дослано! групи встановлювали поступове зниження р1вня загально! АОА, яке на 14-; 21- i 28-му добу експерименту набувало в1ропдних змш i складало в середньому 17,4; 23,6 i 14,4% щодо контролю. У риб II дослано! групи показник загаль-но! АОА у плазмi кровi не змiнювався.
Таким чином, за дворазового застосування препарату "Рибохш" у добовш дозi (за ДР) 50,0 мг/кг маси тша наприкшш експерименту (28-ма доба) в органiзмi риб iнтенсивнiсть процесiв ПОЛ (за рiвнем утворення його первинних i кшцевих продуктiв) перебувала на рiвнi фiзiологiчного контролю, що, очевидно, вшбува-еться за рахунок компенсаторного витрачання пулу ендогенних структурних антиоксидаш1в (за знижен-ням рiвия загально! АОА; Р < 0,05): найменшi значен-ня показника фiксували на 21-шу добу дослiду. За умов дворазового застосування рибi препарату "Рибохш" у добовш дозi (за ДР) 10,0 мг/кг iнтенсивнiсть процеав ПОЛ та активнiсть окислювально! системи порiвняно з контролем не змшювались.
Але, варто зазначити, що за дворазового введення препарату у добовiй дозi 10,0 мг/кг маси тша (за ДР), яка е л^вальною при боротьбi з паразитарними хворобами, у динамщ експерименту в кровi дослщних риб не виявляли достовiрних змш клiнiко-бiохiмiчних показник1в.
Висновки
1. Визначено параметри гостро! токсичностi для коропа LD50 хлорохiну становить 528,66±68,01 мг/кг; LD16 = 224,512 мг/кг; LD84 = 832,81 мг/кг; LD100 = 984,89 мг/кг маси тша, яш вказують, що препарат е малотоксичним для риб (вшноситься до четверто! групи токсичностi).
2. Максимальну виражешсть метаболiчних змiн в органiзмi риб за дворазового застосування препарату "Рибохш" в добовш дозi 50,0 мг/кг маси тша (за ДР) виявляли на 21-шу добу шсля останнього задавання. Мехашзми токсично! дп препарату полягають у пере-будовах в протешограш i процесах переамiнувания та гальмуванш iмунноï реактивностi в органiзмi дослш-них риб, що вказуе на превалювання катаболiчних процесiв над анаболiчними. Метаболiчнi перебудови, очевидно, спрямоваш на активацiю процесiв детокси-кацп з пщвищенням енергетичних затрат в органiзмi риби внаслщок потрапляння пщвищених доз препарату. На 28-му добу експерименту левова частка досль джених показник1в за значенням була близькою до 1х контрольного рiвия.
3. Встановлено, що за дворазового введення препарату у добовiй дозi 10,0 мг/кг маси тша (за ДР), яка е л^вальною при боротьбi iз паразитарними хворобами, у динамщ експерименту в кровi дослшних риб не виявляли достовiрних змш клiнiко-бiохiмiчних показник1в.
Перспективи подальших до^джень. Враховуючи отримаш результати та даш попереднiх дослiджень, в подальшому планусться впровадження препарату "Рибохiн" у практику ветеринарно! медицини та риб-ного господарства для боротьби i3 захворюваннями риб, спричиненими паразитичними найпростiшими (Protozoa) та моногенетичними присиснями (клас Monogenea).
References
Al-Akel, A.S., Alkahem-Al-Balawi, H.F., Al-Misned, F., Mahboob, S., Ahmad, Z., & Suliman, E.M. (2010). Effects of dietary copper exposure on accumulation, growth, and hematological parameters in Cyprinus carpio. Toxicological and Environmental Chemistry, 92, 1865-1878. doi: 10.1080/02772248.2010.486230. Bono, D.P. (1994). Free radicals and antioxidants in vascular biology: the roles of reaction kinetics, environment and substrate turnover. QJM, 87(8), 445-453. doi: 10.1093/oxfordjournals.qjmed.a068954. Demidov, N.V., & Berezkina, S.V. (1986). Metodicheskie rekomendacii po ocenke angel'mintikov v veterinarii. M.: VASHNIL (in Russian). Dirksen, G., Gründer, H.-D., Stöber, M. (1990). Die klinische Untersuchung des Rindes. Berlin; Hamburg: Paul Parey, 367-385. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the approximation of laws, regulations and administrative provisions of the Member States regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes. Offical Journal of the European Communities L. 358. 1986. 1-29.
Gavrilov, V.B., & Mishkorudnaja, M.I. (1983). Spektro-fotometricheskoe opredelenie soderzhanija gidrope-rekisej lipidov v plazme krovi. Lab. delo, 3, 33-36 (in Russian).
Gutyj, B., Martyshchuk, T., Bushueva, I., Semeniv, B., Parchenko, V., Kaplaushenko, A., Magrelo, N., Hirkovyy, A., Musiy, L., & Murska, S. (2017). Morphological and biochemical indicators of blood of rats poisoned by carbon tetrachloride and subject to action of liposomal preparation. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 8(2), 304-309. doi: 10.15421/021748. Hazanov, A.I. (1988). Funkcional'naja diagnostika boleznej pecheni. 2 e izd., pererab. i dop. M. : Medicina (in Russian). Hemdal, J.F. (2013). Aquarium Fish: Chloroquine: A "New" Drug for Treating Fish Diseases. https://www.advancedaquarist.com/2013/2/fish. Khariv, M., Gutyj, B., Ohorodnyk, N., Vishchur, O., Khariv, I., Solovodzinska, I., Mudrak, D., Grymak, C., & Bodnar, P. (2017). Activity of the T- and B-system of the cell immunity of animals under conditions of oxidation stress and effects of the liposomal drug. Ukrainian Journal of Ecology, 7(4), 536-541. doi: 10.15421/2017 157.
Klebanov, G.I. (1988). Ocenka antiokislitel'noj aktivnosti plazmy krovi s primeneniem zheltochnyh lipoprotei-dov. Lab. delo, 5, 59-62 (in Russian).
Kondrahin, I.P. (1985). Klinicheskaja laboratornaja diag-nostika v veterinarii. M.: Agropromizdat (in Russian).
Koroljuk, M.A. (1988). Opredelenie aktivnosti katalaz. Lab. Delo, 1, 16-18 (in Russian).
Kotsiumbas, I.Ia. (2006). Doklinichni doslidzhennia veterynarnykh likarskykh zasobiv. Lviv (in Ukrainian).
Krafts, K., Hempelmann, E., & Skorska-Stania, A. (2012). From methylene blue to chloroquine: a brief review of the development of an antimalarial therapy. Parasitology Research, 111(1), 1-6. doi: 10.1007/s00436-012-2886-x.
Men'shikov, V.V. (1987). Laboratornye metodicheskie issledovanija v klinike. M.: Medicina (in Russian).
Prozorovskij, V.B. (2007). Statisticheskaja obrabotka rezul'tatov farmakologicheskih issledovanij. Psi-hofarmakologija i biol. narkologija, 7(3-4), 20902120 (in Russian).
Todoriuk, V.B., Hunchak, V.M., Gutyj, B.V., Gufriy, D.F., Hariv, I.I., Khomyk, R.I. , & Vasiv, R.O. (2018). Pre-clinical research of the experimental preparation "Ferosel T". Ukrainian Journal of Veterinary and Agricultural Sciences, 1(1), 3-9. doi: 10.32718/ujvas1-1.01.
Vaziri, A., & Warburton, B. (1994). Slow release of chloroquine phosphate from multiple taste-masked W/O/W multiple emulsions. Journal of Microencapsulation, 11(6), 641-648. doi: 10.3109/02652049409051114.
Vlizlo, V.V. (2012). Laboratorni metody doslidzhen u biolohii, tvarynnytstvi ta veterynarnii medytsyni: dovid. Lviv: Spolom (in Ukrainian).
