CC BY
27
УДК 616.981.452:575
Г.А.Ерошенко, Г.Н.Одиноков, Л.М.Куклева, А.И.Павлова, Н.Ю.Шавина, Я.М.Краснов, Н.П.Гусева, В.В.Кутырев
ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ЛОКУСЫ ГЕНОВ napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB КАК ЭФФЕКТИВНЫЕ ДНК-МИШЕНИ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Выявлена изменчивость нуклеотидных последовательностей генов жизнеобеспечения napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB у природных штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов чумы. Установлено, что использование вариабельных локусов этих генов позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя чумы и определять принадлежность изучаемого штамма к определенному подвиду или биовару.
Ключевые слова: возбудитель чумы, вариабельность генов, молекулярное типирование.
Наличие многочисленных природных очагов чумы на территории Российской Федерации, неблагополучие по чуме в граничащих с ней сопредельных странах, а также возможность использования возбудителя чумы в биотеррористических актах настоятельно требуют разработки эффективной системы молекулярной диагностики штаммов Y. pestis. Создание такой системы позволит проводить быструю дифференциацию штаммов возбудителя чумы от других близкородственных иерсиний, а также устанавливать источник происхождения штамма и определять его ландшафтно-географическую принадлежность. В настоящее время достаточно остро стоит проблема обнаружения высокоразрешающих генетических локусов, которые могут быть использованы в качестве ДНК-мишеней для генотипирования Y. pestis. Однако в литературе имеется ограниченное количество публикаций по этому вопросу [1, 2, 4, 5, 6]. Для генотипирования штаммов возбудителя чумы, как правило, используются достаточно консервативные гены, применение которых позволяет проводить разделение видов внутри рода Yersinia, но не внутривидовую дифференциацию штаммов Y. pestis [5, 6].
На основе проведения сравнительного компьютерного анализа более чем двадцати генов жизнеобеспечения Y. pestis, участвующих в азотном, углеводном, и аминокислотном обменах, нами выбраны гены napA (периплазматическая нитратредуктаза), aspA (аспартатаммониумлиаза), rhaS (активатор транскрипции L-рамнозного оперона), zwf (глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа) и tcaB (белок TcaB комплекса инсектицидных токсинов), использование которых позволяет проводить внутривидовое деление штаммов возбудителя чумы и определять их принадлежность к подвидам - основному, кавказскому, алтайскому, гиссарскому, улегейскому и к биоварам -античному, средневековому и восточному.
Выявление вариабельных участков генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB проводили на основе сравнения их нуклеотидных последовательностей у всех штаммов Y. pestis, представленных в базе данных NCBI GenBank: KIM (б/в medievalis), CO92 (б/в orientalis), Antiqua, Angola, Nepal516 (б/в antiqua), 91001 (б/в mi-
crotus), Pestoides F (кавказский подвид) и Y. pseudotuberculosis PB1/+, IP 32953, IP 31758, YPIII. На выявленные вариабельные участки этих генов с помощью программы PrimerExpress нами рассчитаны праймеры, которые использованы для амплификации этих локусов в ПЦР для их последующего секвенирования. Синтез олигонуклеотидных праймеров осуществляли на автоматическом синтезаторе ДНК «АСМ-800» (Биоссет, Россия) в РосНИПЧИ «Микроб». Полученные в ПЦР фрагменты генов анализировали методом электрофореза в 1 % агарозном геле. Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB проводили на генетическом анализаторе модели «CEQ 8000» (Beckman Coulter) по методу Ф.Сэнгера (1977). Для сравнения нуклеотидных последовательностей генов природных штаммов Y. pestis с последовательностями этих генов у штаммов, представленных в базе данных NCBI GenBank, использовали алгоритм BLAST и программное обеспечение MEGA 4.0. Филогенетические деревья получали с помощью программы MEGA 4.0 с применением алгоритма UPGMA.
Изучение вариабельности нуклеотидных последовательностей генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB проводили у 80 природных штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов Российской Федерации, ближнего и дальнего зарубежья (таблица). В вариабельных локусах изученных генов выявлены различные типы мутаций, использование которых в методе мультилокус-ного сиквенс-типирования позволяет осуществлять эффективную дифференциацию штаммов Y. pestis по подвидам, биоварам и, частично, на групповом (популяционном) уровне.
Деление штаммов основного подвида по их принадлежности к одному из трех биоваров - античному, средневековому и восточному проводили на основе изменчивости нуклеотидных последовательностей генов napA и tcaB (таблица). В гене napA у всех штаммов средневекового биовара выявлена мутация, приводящая к замене нуклеотида G на T в позиции 613 от начала гена napA. Вторая мутация - делеция нуклеотида A в позиции 1037 гена tcaB обнаружена
Характеристика штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis
Штаммы Локусы
aspA i087-i089(43б)* rhaS (822)* napA бО (7i9)* Zwf 4б3 (305)* tcaB (-A), i037 (270)*
482 494 бУ!
GenBank
Y. pestis CO92 (orientalis)
KIM (medievalis)
Antiqua
Nepal516 (antique)
Angola
91001 (microtus)
Pestoides F (кавказский п/в) Y. pseudotuberculosis YPIII PB1/+
IP 32953 IP 31758
TTG
TTG
TTG
TTT
TTT
GTG
TCG
GTG
GTG
GTG
GTG
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
A
A
A
A
G
G
G
G
G
G
G
G
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
T
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Y. pestis 243 65/23
Hamburg 15 Sonche
Основной п/в (subsp. pestis)
А-1836, И-3223, A-100
A-161, КМ 919, С-527, А-1793, А-1760, А-1702
231, 680
КМ 776
Кавказский п/в (subsp. caucasica) 1146, 376 Алтайский п/в (subsp. altaica) И-3000, 4857 Гиссарский п/в (subsp. hissarica) А-1249, А-1633 Улегейский п/в (subsp. ulegeica) И-2422, И-3068
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG
TCG
TTT
TCG
GTG
GTG
TCG
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
А
G
Эксперимент
T T T T
T
T
T
T
A
A
A
A
A
A
A
A
G
G
G
G
G
T
G
T
G
G
G
G
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
A
A
A
A
C
G
T
A
T
G
C
A
T
G
C
A
T
G
C
A
*Указаны размеры (в п.н.) секвенированного фрагмента гена.
только у штаммов восточного биовара. У штаммов античного биовара обе эти мутации отсутствуют, а гены парА и ^саВ находятся в интактном виде.
Определение принадлежности штаммов возбудителя чумы к основному или неосновным подвидам осуществляли с помощью вариабельного локуса гена гка8 в позиции 671 от начала гена (таблица). У штаммов неосновных подвидов в позиции 671 присутствует нуклеотид G, в то время как у всех штаммов основного подвида выявлена мутация со сменой нуклеотида G на А. Таким образом, штаммы У. реъиъ основного подвида содержат в гене гка8 нуклеотид А, в то время как штаммы неосновных подвидов -нуклеотид G (таблица).
Вариабельность нуклеотидной последовательности другого гена - aspA позволяет проводить дифференциацию внутри штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы. Все изученные нами штаммы кавказского и улегейского подвидов содержат
в позиции 1087-1089 гена aspA триплет TCG, который кодирует аминокислоту серин в положении 363 белка AspA. Штаммы алтайского и гиссарского подвида содержат в этой позиции триплет GTG, детерминирующий в белке AspA аминокислоту валин. Подавляющее большинство штаммов основного подвида содержит триплет ТГС и аминокислоту лейцин в белке AspA. Однако часть штаммов из высокогорного очага чумы в Киргизии, как и штаммы кавказского и улегейского подвидов, имеют в этом локусе триплет TCG и аминокислоту серин в AspA (таблица). Еще один штамм основного подвида из высокогорного очага чумы на Кавказе содержит в этой позиции триплет ТТТ, который кодирует аминокислоту фенилаланин. Такую же мутацию имеют и два штамма - №ра1516 и А^о1а. представленные в базе данных NCBI GenBank (таблица). Таким образом, использование вариабельности нуклеотидной последовательности гена aspA позволяет выделять дополнительные группы штаммов внутри
С092
243
65/23
Sonche
Hamburg 15
Antiqua
A-1836
I-3223
A-100
і- KM776 KIM A-161 KM919 L C-527 A-1793 A-1760 A-1702 — Nepal516
---Angola
11-2422
11-3068
---91001
■ I-3000 14857
___і A-1633
' A-1249 Pestoides F 1146 376
IP31758
YPIII PB\1 +
IP32953
-----1------------1-----------1------------1-------------1
0.004 0.003 0.002 0.001 0.000
Дифференциация штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов на основе вариабельности последовательностей генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB (MEGA 4,0; алгоритм UpGMA)
основного подвида возбудителя чумы. На основе вариабельности этого генетического локуса проводится также деление штаммов неосновных подвидов на две группы. Штаммы кавказского и улегейского подвидов содержат в позиции i087-i089 гена aspA триплет TCG, а штаммы алтайского и гиссарского подвидов -триплет GTG.
Дальнейшее разделение филогенетически близкородственных штаммов гиссарского и алтайского подвидов проводят на основе вариабельного нуклеотида в позиции 482 от начала гена rhaS. Штаммы гис-сарского подвида содержат уникальную мутацию -замену нуклеотида G на A в положении 482 гена rhaS, отсутствующую у других штаммов Y. pestis, что позволяет проводить их идентификацию среди других подвидов Y. pestis. Разделение штаммов кавказского и улегейского подвидов проводят на основе наличия двух мутаций: замены С на T в позиции 494 от начала гена rhaS и замены T на C в позиции 4б3 от начала гена zwf у штаммов улегейского подвида (таблица). В штаммах кавказского подвида эти мутации отсутствуют, и гены rhaS и zwf находятся у них в интактном состоянии. Таким образом, в результате использования вариабельности генов aspA, rhaS, zwf все штаммы неосновных подвидов можно четко раз-
делить на кавказский, алтайский, гиссарский и уле-гейский подвиды.
Нуклеотидные последовательности вариабельных локусов генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB, выявленные нами у природных штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов, а также последовательности этих генов у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, представленные в NCBI GenBank, были использованы для построения дендрограммы на основе применения программы MEGA 4,0 с использованием алгоритма UPGMA [3]. Как видно из рисунка, разработанный нами способ дифференциации штаммов Y. pestis позволяет эффективно проводить деление штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы и близкородственной патогенной иерсинии - Y. pseudotuberculosis.
Работа поддержана грантом РФФИ № 08-0400731.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Одиноков Г.Н. и др. Структурно-функциональный анализ гена araC у штаммов Yersinia pestis различного происхождения. Мол. генет., микроби-ол. и вирусол. 2009; 3:21-6.
2. ЕрошенкоГ.А., ОдиноковГ.Н., КрасновЯ.М., ГусеваН.П., Кутырев В.В. Вариабельность генов aspA у штаммов Yersinia pestis основного и неосновного подвидов. Пробл. особо опасных инф. 2009; 1(99):52-4.
3. Волков Ю.П., Ерошенко Г.А. Анализ эффективности некоторых методов построения филогенетических деревьев, используемых при оценке эволюционного родства микроорганизмов. Пробл. особо опасных инф. 2009; 1(99):35-41.
4. Куклева Л.М. Ерошенко Г.А., Куклев В.Е. и др. Изучение вариабельности нуклеотидной последовательности генов rha ло-куса у штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2008; 2:23-7.
5. Achtman M., Zurth K., Morelli G. et al. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96(24):14043-8.
6. Kotetishvili M., Kreger A., Wauters G. et al. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(6):2674-84.
7. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977; 74(12):5463-7.
G.A.Eroshenko, G.N.Odinokov, L.M.Koukleva, A.I.Pavlova, N.Yu.Shavina, Ya.M.Krasnov, N.P.Gouseva, V.V.Kutyrev
Variable Loci of the napA, rhaS, zwf and tcaB Genes as Effective DNA-Targets for Yersinia pestis Strains Genotyping
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe", Saratov
Variability of the nucleotide sequences of the napA, rhaS, zwf and tcaB genes was elucidated in natural Yersinia pestis strains of the main and non-main subspecies from different natural plague foci. Use of variable loci of these genes enables to carry out intra-species differentiation of plague microbe strains and attribute the studied strain to certain subspecies or biovar.
Key words: plague agent, variability of genes, molecular typing
Об авторах:
Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Павлова А.И., Шавина Н.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный ин-
ститут «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: microbe@san.ru
Authors:
Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Koukleva L.M., Pavlova A.I., Shavina N.Yu., Krasnov Ya.M., Gouseva N.P., Kutyrev V.V. Russian Research AntiPlague Institute “Microbe”. 410005, Saratov, Universitetskaya St., 46. E-mail: microbe@san.ru
Поступила 29.03.10.
