Научная статья на тему 'Вариабельные локусы генов napa, aspa, rhas, zwf и tcab как эффективные ДНК-мишени для генотипирования штаммов Yersinia pestis'

Вариабельные локусы генов napa, aspa, rhas, zwf и tcab как эффективные ДНК-мишени для генотипирования штаммов Yersinia pestis Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
152
25
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ВОЗБУДИТЕЛЬ ЧУМЫ / ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГЕНОВ / МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ / PLAGUE AGENT / VARIABILITY OF GENES / MOLECULAR TYPING

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Ерошенко Г. А., Одиноков Г. Н., Куклева Л. М., Павлова А. И., Шавина Н. Ю.

Выявлена изменчивость нуклеотидных последовательностей генов жизнеобеспечения napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB у природных штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов чумы. Установлено, что использование вариабельных локусов этих генов позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя чумы и определять принадлежность изучаемого штамма к определенному подвиду или биовару.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Ерошенко Г. А., Одиноков Г. Н., Куклева Л. М., Павлова А. И., Шавина Н. Ю.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Variable Loci of the napA, rhaS, zwf and tcaB Genes as Effective DNA-Targets for Yersinia pestis Strains Genotyping

Variability of the nucleotide sequences of the napA, rhaS, zwf and tcaB genes was elucidated in natural Yersinia pestis strains of the main and non-main subspecies from different natural plague foci. Use of variable loci of these genes enables to carry out intra-species differentiation of plague microbe strains and attribute the studied strain to certain subspecies or biovar.

Текст научной работы на тему «Вариабельные локусы генов napa, aspa, rhas, zwf и tcab как эффективные ДНК-мишени для генотипирования штаммов Yersinia pestis»

УДК 616.981.452:575

Г.А.Ерошенко, Г.Н.Одиноков, Л.М.Куклева, А.И.Павлова, Н.Ю.Шавина, Я.М.Краснов, Н.П.Гусева, В.В.Кутырев

ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ЛОКУСЫ ГЕНОВ napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB КАК ЭФФЕКТИВНЫЕ ДНК-МИШЕНИ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS

ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Выявлена изменчивость нуклеотидных последовательностей генов жизнеобеспечения napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB у природных штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов чумы. Установлено, что использование вариабельных локусов этих генов позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя чумы и определять принадлежность изучаемого штамма к определенному подвиду или биовару.

Ключевые слова: возбудитель чумы, вариабельность генов, молекулярное типирование.

Наличие многочисленных природных очагов чумы на территории Российской Федерации, неблагополучие по чуме в граничащих с ней сопредельных странах, а также возможность использования возбудителя чумы в биотеррористических актах настоятельно требуют разработки эффективной системы молекулярной диагностики штаммов Y. pestis. Создание такой системы позволит проводить быструю дифференциацию штаммов возбудителя чумы от других близкородственных иерсиний, а также устанавливать источник происхождения штамма и определять его ландшафтно-географическую принадлежность. В настоящее время достаточно остро стоит проблема обнаружения высокоразрешающих генетических локусов, которые могут быть использованы в качестве ДНК-мишеней для генотипирования Y. pestis. Однако в литературе имеется ограниченное количество публикаций по этому вопросу [1, 2, 4, 5, 6]. Для генотипирования штаммов возбудителя чумы, как правило, используются достаточно консервативные гены, применение которых позволяет проводить разделение видов внутри рода Yersinia, но не внутривидовую дифференциацию штаммов Y. pestis [5, 6].

На основе проведения сравнительного компьютерного анализа более чем двадцати генов жизнеобеспечения Y. pestis, участвующих в азотном, углеводном, и аминокислотном обменах, нами выбраны гены napA (периплазматическая нитратредуктаза), aspA (аспартатаммониумлиаза), rhaS (активатор транскрипции L-рамнозного оперона), zwf (глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа) и tcaB (белок TcaB комплекса инсектицидных токсинов), использование которых позволяет проводить внутривидовое деление штаммов возбудителя чумы и определять их принадлежность к подвидам - основному, кавказскому, алтайскому, гиссарскому, улегейскому и к биоварам -античному, средневековому и восточному.

Выявление вариабельных участков генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB проводили на основе сравнения их нуклеотидных последовательностей у всех штаммов Y. pestis, представленных в базе данных NCBI GenBank: KIM (б/в medievalis), CO92 (б/в orientalis), Antiqua, Angola, Nepal516 (б/в antiqua), 91001 (б/в mi-

crotus), Pestoides F (кавказский подвид) и Y. pseudotuberculosis PB1/+, IP 32953, IP 31758, YPIII. На выявленные вариабельные участки этих генов с помощью программы PrimerExpress нами рассчитаны праймеры, которые использованы для амплификации этих локусов в ПЦР для их последующего секвенирования. Синтез олигонуклеотидных праймеров осуществляли на автоматическом синтезаторе ДНК «АСМ-800» (Биоссет, Россия) в РосНИПЧИ «Микроб». Полученные в ПЦР фрагменты генов анализировали методом электрофореза в 1 % агарозном геле. Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB проводили на генетическом анализаторе модели «CEQ 8000» (Beckman Coulter) по методу Ф.Сэнгера (1977). Для сравнения нуклеотидных последовательностей генов природных штаммов Y. pestis с последовательностями этих генов у штаммов, представленных в базе данных NCBI GenBank, использовали алгоритм BLAST и программное обеспечение MEGA 4.0. Филогенетические деревья получали с помощью программы MEGA 4.0 с применением алгоритма UPGMA.

Изучение вариабельности нуклеотидных последовательностей генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB проводили у 80 природных штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов Российской Федерации, ближнего и дальнего зарубежья (таблица). В вариабельных локусах изученных генов выявлены различные типы мутаций, использование которых в методе мультилокус-ного сиквенс-типирования позволяет осуществлять эффективную дифференциацию штаммов Y. pestis по подвидам, биоварам и, частично, на групповом (популяционном) уровне.

Деление штаммов основного подвида по их принадлежности к одному из трех биоваров - античному, средневековому и восточному проводили на основе изменчивости нуклеотидных последовательностей генов napA и tcaB (таблица). В гене napA у всех штаммов средневекового биовара выявлена мутация, приводящая к замене нуклеотида G на T в позиции 613 от начала гена napA. Вторая мутация - делеция нуклеотида A в позиции 1037 гена tcaB обнаружена

Характеристика штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis

Штаммы Локусы

aspA i087-i089(43б)* rhaS (822)* napA бО (7i9)* Zwf 4б3 (305)* tcaB (-A), i037 (270)*

482 494 бУ!

GenBank

Y. pestis CO92 (orientalis)

KIM (medievalis)

Antiqua

Nepal516 (antique)

Angola

91001 (microtus)

Pestoides F (кавказский п/в) Y. pseudotuberculosis YPIII PB1/+

IP 32953 IP 31758

TTG

TTG

TTG

TTT

TTT

GTG

TCG

GTG

GTG

GTG

GTG

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

T

T

T

T

T

T

C

C

C

C

C

A

A

A

A

G

G

G

G

G

G

G

G

T

G

G

G

G

G

G

G

G

G

C

C

C

C

C

C

T

T

T

T

T

T

A

A

A

A

A

A

A

A

A

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

A

Y. pestis 243 65/23

Hamburg 15 Sonche

Основной п/в (subsp. pestis)

А-1836, И-3223, A-100

A-161, КМ 919, С-527, А-1793, А-1760, А-1702

231, 680

КМ 776

Кавказский п/в (subsp. caucasica) 1146, 376 Алтайский п/в (subsp. altaica) И-3000, 4857 Гиссарский п/в (subsp. hissarica) А-1249, А-1633 Улегейский п/в (subsp. ulegeica) И-2422, И-3068

TTG

TTG

TTG

TTG

TTG

TTG

TCG

TTT

TCG

GTG

GTG

TCG

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

А

G

Эксперимент

T T T T

T

T

T

T

A

A

A

A

A

A

A

A

G

G

G

G

G

T

G

T

G

G

G

G

C

C

C

C

C

C

C

C

T

T

T

T

A

A

A

A

C

G

T

A

T

G

C

A

T

G

C

A

T

G

C

A

*Указаны размеры (в п.н.) секвенированного фрагмента гена.

только у штаммов восточного биовара. У штаммов античного биовара обе эти мутации отсутствуют, а гены парА и ^саВ находятся в интактном виде.

Определение принадлежности штаммов возбудителя чумы к основному или неосновным подвидам осуществляли с помощью вариабельного локуса гена гка8 в позиции 671 от начала гена (таблица). У штаммов неосновных подвидов в позиции 671 присутствует нуклеотид G, в то время как у всех штаммов основного подвида выявлена мутация со сменой нуклеотида G на А. Таким образом, штаммы У. реъиъ основного подвида содержат в гене гка8 нуклеотид А, в то время как штаммы неосновных подвидов -нуклеотид G (таблица).

Вариабельность нуклеотидной последовательности другого гена - aspA позволяет проводить дифференциацию внутри штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы. Все изученные нами штаммы кавказского и улегейского подвидов содержат

в позиции 1087-1089 гена aspA триплет TCG, который кодирует аминокислоту серин в положении 363 белка AspA. Штаммы алтайского и гиссарского подвида содержат в этой позиции триплет GTG, детерминирующий в белке AspA аминокислоту валин. Подавляющее большинство штаммов основного подвида содержит триплет ТГС и аминокислоту лейцин в белке AspA. Однако часть штаммов из высокогорного очага чумы в Киргизии, как и штаммы кавказского и улегейского подвидов, имеют в этом локусе триплет TCG и аминокислоту серин в AspA (таблица). Еще один штамм основного подвида из высокогорного очага чумы на Кавказе содержит в этой позиции триплет ТТТ, который кодирует аминокислоту фенилаланин. Такую же мутацию имеют и два штамма - №ра1516 и А^о1а. представленные в базе данных NCBI GenBank (таблица). Таким образом, использование вариабельности нуклеотидной последовательности гена aspA позволяет выделять дополнительные группы штаммов внутри

С092

243

65/23

Sonche

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Hamburg 15

Antiqua

A-1836

I-3223

A-100

і- KM776 KIM A-161 KM919 L C-527 A-1793 A-1760 A-1702 — Nepal516

---Angola

11-2422

11-3068

---91001

■ I-3000 14857

___і A-1633

' A-1249 Pestoides F 1146 376

IP31758

YPIII PB\1 +

IP32953

-----1------------1-----------1------------1-------------1

0.004 0.003 0.002 0.001 0.000

Дифференциация штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов на основе вариабельности последовательностей генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB (MEGA 4,0; алгоритм UpGMA)

основного подвида возбудителя чумы. На основе вариабельности этого генетического локуса проводится также деление штаммов неосновных подвидов на две группы. Штаммы кавказского и улегейского подвидов содержат в позиции i087-i089 гена aspA триплет TCG, а штаммы алтайского и гиссарского подвидов -триплет GTG.

Дальнейшее разделение филогенетически близкородственных штаммов гиссарского и алтайского подвидов проводят на основе вариабельного нуклеотида в позиции 482 от начала гена rhaS. Штаммы гис-сарского подвида содержат уникальную мутацию -замену нуклеотида G на A в положении 482 гена rhaS, отсутствующую у других штаммов Y. pestis, что позволяет проводить их идентификацию среди других подвидов Y. pestis. Разделение штаммов кавказского и улегейского подвидов проводят на основе наличия двух мутаций: замены С на T в позиции 494 от начала гена rhaS и замены T на C в позиции 4б3 от начала гена zwf у штаммов улегейского подвида (таблица). В штаммах кавказского подвида эти мутации отсутствуют, и гены rhaS и zwf находятся у них в интактном состоянии. Таким образом, в результате использования вариабельности генов aspA, rhaS, zwf все штаммы неосновных подвидов можно четко раз-

делить на кавказский, алтайский, гиссарский и уле-гейский подвиды.

Нуклеотидные последовательности вариабельных локусов генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB, выявленные нами у природных штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов, а также последовательности этих генов у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, представленные в NCBI GenBank, были использованы для построения дендрограммы на основе применения программы MEGA 4,0 с использованием алгоритма UPGMA [3]. Как видно из рисунка, разработанный нами способ дифференциации штаммов Y. pestis позволяет эффективно проводить деление штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы и близкородственной патогенной иерсинии - Y. pseudotuberculosis.

Работа поддержана грантом РФФИ № 08-0400731.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Одиноков Г.Н. и др. Структурно-функциональный анализ гена araC у штаммов Yersinia pestis различного происхождения. Мол. генет., микроби-ол. и вирусол. 2009; 3:21-6.

2. ЕрошенкоГ.А., ОдиноковГ.Н., КрасновЯ.М., ГусеваН.П., Кутырев В.В. Вариабельность генов aspA у штаммов Yersinia pestis основного и неосновного подвидов. Пробл. особо опасных инф. 2009; 1(99):52-4.

3. Волков Ю.П., Ерошенко Г.А. Анализ эффективности некоторых методов построения филогенетических деревьев, используемых при оценке эволюционного родства микроорганизмов. Пробл. особо опасных инф. 2009; 1(99):35-41.

4. Куклева Л.М. Ерошенко Г.А., Куклев В.Е. и др. Изучение вариабельности нуклеотидной последовательности генов rha ло-куса у штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2008; 2:23-7.

5. Achtman M., Zurth K., Morelli G. et al. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96(24):14043-8.

6. Kotetishvili M., Kreger A., Wauters G. et al. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(6):2674-84.

7. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977; 74(12):5463-7.

G.A.Eroshenko, G.N.Odinokov, L.M.Koukleva, A.I.Pavlova, N.Yu.Shavina, Ya.M.Krasnov, N.P.Gouseva, V.V.Kutyrev

Variable Loci of the napA, rhaS, zwf and tcaB Genes as Effective DNA-Targets for Yersinia pestis Strains Genotyping

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe", Saratov

Variability of the nucleotide sequences of the napA, rhaS, zwf and tcaB genes was elucidated in natural Yersinia pestis strains of the main and non-main subspecies from different natural plague foci. Use of variable loci of these genes enables to carry out intra-species differentiation of plague microbe strains and attribute the studied strain to certain subspecies or biovar.

Key words: plague agent, variability of genes, molecular typing

Об авторах:

Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Павлова А.И., Шавина Н.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный ин-

ститут «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: microbe@san.ru

Authors:

Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Koukleva L.M., Pavlova A.I., Shavina N.Yu., Krasnov Ya.M., Gouseva N.P., Kutyrev V.V. Russian Research AntiPlague Institute “Microbe”. 410005, Saratov, Universitetskaya St., 46. E-mail: microbe@san.ru

Поступила 29.03.10.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.