Научная статья на тему 'Сравнение полной нуклеотидной последовательности гена rhaS у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов'

Сравнение полной нуклеотидной последовательности гена rhaS у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов Текст научной статьи по специальности «Биология»

CC BY
2
0
Поделиться
Область наук
Ключевые слова
ВОЗБУДИТЕЛЬ ЧУМЫ / ОСНОВНОЙ И НЕОСНОВНЫЕ ПОДВИДЫ Y. PESTIS / ФЕРМЕНТАЦИЯ РАМНОЗЫ / НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ / Y. PESTIS MAIN AND MINOR SUBSPECIES

Аннотация научной статьи по биологии, автор научной работы — Куклева Л. М., Ерошенко Г. А., Куклев В. Е., Краснов Я. М., Гусева Н. П., Одиноков Г. Н., Кутырев В. В.

Определена полная нуклеотидная последовательность гена rhaS регуляторного гена rha локуса хромосомы у штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов, а также у Y. pseudotuberculosis I-III сероваров. Установлено наличие в гене rhaS значимых и несущественных нуклеотидных замен, которые, по-видимому, являются причиной различной способности к ферментации рамнозы у штаммов возбудителя чумы (основного и неосновных подвидов) и псевдотуберкулеза.

Похожие темы научных работ по биологии , автор научной работы — Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Куклев В.Е., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Одиноков Г.Н., Кутырев В.В.,

Comparison of Complete Nucleotide Sequence of rhaS Gene in the Strains of Plague Etiological Agent of Main and Minor Subspecies

Determined was complete nucleotide sequence of rhaS gene, the regulatory gene of rha locus of chromosome in Yersinia pestis strains of main and minor subspecies and in Y. pseudotuberculosis of I-III serovariants. The presence of significant and inessential nucleotide replacements in rhaS gene was shown. Evidently, these replacements are the cause of different abilities for rhamnose fermentation in the strains of plague etiological agent (main and minor subspecies) and those of pseudotuberculosis agent.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Текст научной работы на тему «Сравнение полной нуклеотидной последовательности гена rhaS у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов»

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. М.: Медицина; 1982.

2. Ильина Т.С., Смирнов Г.Б., Смирнова Н.И. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез В-субъ-единицы холерного токсина, способ ее конструирования и штамм бактерий Vibrio cholerae продуцент В-субъединицы холерного токсина. АС № 1505022 от 18.09.87.

3. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Безсмертный В.Е. и др. Холера в мире, странах СНГ и России: эпидемиологическая обстановка (1998—2007 г.) Холера и патогенные для человека вибрионы. Сб. матер. пробл. комиссии. Ростов н/Д, 2008; 21:13-6.

4. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Федоров Ю.М., Подосинникова Л.С., Горобец А.В. Холера в начале ХХ1 века. Прогноз. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005; 3:44-8.

5. Осин А.В., Ливанова Л.Ф., Ерошенко Г.А., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Изучение особенностей наследования и экспрессии рекомбинантной плазмиды с клонированными генами холерного токсина в авирулентном штамме. Холера и патогенные для человека вибрионы. Сб. матер. пробл. комиссии. Ростов н/Дону. 2002; 15:103-6.

6. Alam M, Hasan N.A., Sadique A., Bhuiyan N.A., Ahmed K. U., Nusrin S. et al. Seasonal cholerae caused by Vibrio cholerae serogroups O1 and O139 in the coastal aquatic environment of Bangladesh. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(6):409б-104.

7. Albert M.J., Siddique A.K., Islam M.S. Large outbreak of clinical cholerae due to Vibrio cholerae non-O1 in Bangladesh. Lancet. 1993; 341:704.

8. Cray W.C., Tokunaga E., Pierse N.F. Successful colonization and immunization of adult rabbits by oral inoculation with Vibrio cholerae O1. Infect. Immun. 1983; 41(20):735-41.

9. Faruque S.M., Chowdhury N., Kamruzzaman M., Shafi Ahmad Q., Faruque A.S.G., Salam M.A. et al. Emerg. Infect. Dis. 2003; 9(9):1116-22.

10. Evans D.G., Evans D.J., Clegg S., Pauley J.A. Purification and characterization of the CFA1 antigen of enterotoxigenic

Escherichia coli. Infect. Immun. 1979; 25(2):738-48.

11. Ledon T., Valle E., Valmaseda T., Faruque A.S.G.,

Ansaruzzaman M., Faruque S.M. et al. Construction and characterization of O139 cholera vaccine candidates. Vaccine 2003; 21(11—12):1282—91.

12. Outbreak verification list. 27. WHO. Geneva, Switzerland

2005.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

13. Spira W.M., Sack R.B., Froelich J.F. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Esherichia coli deiar-rhea. Infect. Immun. 1981; 32:739-47.

I.M.Krepostnova, L.F.Livanova, S.A.Bugorkova,

N.I.Smirnova

Investigation of Protective Properties of the Constructed

Recombinant Biplasmid Strain of Vibrio cholerae O139 Serogroup Producing Cholera Toxin B Subunit and Escherichia coli Colonization Factor CFA/1

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe",

Saratov

The constructed avirulent biplasmid Vibrio cholerae strain KM182 producing cholera toxin B subunit and Escherichia coli colonization factor CFA/1 (providing for antitoxic and anti-colonization immunity formation, correspondently) was demonstrated to protect immunized model laboratory animals from experimental cholera caused by the virulent Vibrio cholerae O139 strain. The optimal doses for immunization and challenging were determined.

Key words: Vibrio cholerae O139 Serogroup, plasmid, RITARD method, cholera toxin B subunit, colonization factor CFA/1.

Поступила 10.07.08.

УДК 616.981.452:575

Л.М.Куклева, Г.А.Ерошенко, В.Е.Куклев, Я.М.Краснов, Н.П.Гусева, Г.Н.Одиноков, В.В.Кутырев

СРАВНЕНИЕ ПОЛНОЙ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА МАБ У ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ОСНОВНОГО И НЕОСНОВНЫХ ПОДВИДОВ

ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Определена полная нуклеотидная последовательность гена rhaS - регуляторного гена rha локуса хромосомы у штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов, а также у Y. pseudotuberculosis I-III сероваров. Установлено наличие в гене rhaS значимых и несущественных нуклеотидных замен, которые, по-видимому, являются причиной различной способности к ферментации рамнозы у штаммов возбудителя чумы (основного и неосновных подвидов) и псевдотуберкулеза.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Ключевые слова: возбудитель чумы, основной и неосновные подвиды Y. pestis, ферментация рамнозы, нуклеотидная последовательность.

Ферментация рамнозы является одним из важнейших диагностических признаков, позволяющих дифференцировать возбудителей чумы и псевдотуберкулеза. Yersinia pseudotuberculosis активно использует этот углевод в качестве источника углерода и энергии, тогда как штаммы основного подвида Y. pestis не способны к ферментации рамнозы [1, 5]. Штаммы неосновных подвидов чумного микроба, занимающие промежуточное положение между основным подвидом Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, способны ферментировать рамнозу, хотя выраженность этого признака у разных подвидов варьирует. Так, штаммы кавказского и алтайского подвидов активно ферментируют рамнозу в первые 24-48 ч от начала культивирования, а штаммы улэгейского подвида - в более поздние сроки через (48-96 ч)

[3]. Для штаммов гиссарского подвида отмечена изменчивость сроков проявления этого признака (от 1-2 сут до ее полного отсутствия) [4]. Причины столь существенных различий в проявлении способности к ферментации рамнозы у штаммов основного и неосновных подвидов остаются к настоящему моменту невыясненными. Устойчивое отсутствие этого признака у штаммов основного подвида У. pestis свидетельствует о наличии генетического дефекта в генах локуса гка, кодирующего ферменты утилизации рамнозы.

Ь-рамноза (метилпентоза) утилизируется бактериальными клетками с помощью группы ферментов, синтез которых детерминируется генами, расположенными в гка локусе. Строение рамнозного регуло-на подробно изучено на модели кишечной палочки.

Установлено наличие четырех структурных генов: гкаА, кодирующего рамнозоизомеразу, гкаВ - рам-нулокиназу, гкаБ - рамнулозо-1-фосфат-альдолазу [8] и гкаТ, детерминирующий транспортный белок для рамнозы [7]. Регуляцию функционирования гка локуса осуществляют продукты генов гкаЯ и гкаБ. Продукт гена гкаЯ при наличии в среде рамнозы активирует транскрипцию оперона гкаБЯ, далее ИЬа8 активирует транскрипцию генов гкаВАВ, кодирующих ферменты катаболизма Ь-рамнозы и гкаТ -транспортного белка для Ь-рамнозы - ЯЪаТ [6]. Аминокислотные последовательности белков ИЬа8 и ИЬаЯ совпадают на 30 %, и оба этих фермента являются членами семейства активаторов транскрипции - ЛгаС/Ху18 [10].

Проведенный нами математический анализ генов гка локуса возбудителей чумы и псевдотуберкулеза на основе полных нуклеотидных последовательностей геномов 6 штаммов возбудителя чумы и 2 штаммов псевдотуберкулезного микроба, представленных в базе данных ХСБ1 ОепБапк, показал полное совпадение строения гка локуса у возбудителя чумы и кишечной палочки и выявил наличие у чумного микроба генов гкаА, В, В, Я, ^ и Т.

По результатам математического анализа наибольшей вариабельностью структуры у возбудителя чумы по сравнению с псевдотуберкулезным микробом обладает ген гкаБ, что позволяет предположить, что изменение нуклеотидной последовательности

именно этого гена является причинои различного отношения к рамнозе у штаммов основного и неосновных подвидов У рв8ІЇ8. Результаты математического анализа, а также предварительные собственные экспериментальные данные свидетельствуют об отсутствии различии в нуклеотиднои последовательности генов гкаА, гкаВ и гкаЯ у изученных нами штаммов чумного микроба (основного и неосновных подвидов), а также возбудителя псевдотуберкулеза (данные готовятся к публикации). В структурном гене пермеазы - гкаТ математический анализ отличий не выявил.

Для выяснения причин различной ферментативной активности в отношении рамнозы нами было проведено секвенирование гена гка8 у штаммов У реъиъ основного и неосновных подвидов, а также изучена возможность использования выявленных различий в нуклеотидной последовательности гена гка8 для генетической дифференциации этих подвидов.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы. В работе использовано 15 типичных штаммов У рЄ8ІЇ8 основного, алтайского, кавказского, улэгейского и гиссарско-го подвидов, таласской группы, выделенных в различных природных очагах России и сопредельных государств, а также 3 штамма возбудителя псевдотуберкулеза I—III сероваров (табл. 1). Штаммы по-

Таблица 1

Характеристика использованных штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis

Штаммы Подвид/серовар Время и место выделения (природный очаг) Источник выделения Ферментация рамнозы, сут

Yersinia pestis

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

M-231 Основной 1947, Аксайский Серый сурок -

A-161 1962, Устюртский Блохи большой песчанки -

А-1836 1988, Сарыджасский Серый сурок -

М-519 1977, Копетдагский Большая песчанка -

А-1793 1978, Зауральский Малый суслик -

1146 Кавказский 1962, Зангезуро-Карабахский Обыкновенная полевка 1

818 1968, Приараксинский Блохи гнезда обыкновенной полевки 1

A-1728 Гиссарский 1972, Гиссарский Арчовая полевка 2

A-1249 1970, Гиссарский Арчовая полевка 2

И-2998 Алтайский 1982, Алтайский горный Монгольская пищуха 1

И-2З59 1973, Алтайский горный Блохи гнезда монгольской пищухи 1

И-З069 Улэгейский 1982, МНР, Убурхангай Полевка Брандта 2

И-3131 1984, МНР, Южно-Гобийский аймак Монгольская пищуха 2

А-1802 Таласский 1980, Таласский хребет, Киргизия Блохи 2

А-1815 1980, Таласский хребет, Киргизия Блохи мыши-полевки 2

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Y. pseudotuberculosis

I Получен из института Пастера (Франция) Коллекция Г.Моляре 1

III III Получен из института Пастера (Франция) Коллекция Г.Моляре 1

312 1973, Владивосток Больной дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой 1

лучены из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», где они хранились в лиофильно высушенном состоянии. Культивирование штаммов и изучение их биохимической активности проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по профилактике чумы [2].

Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности регуляторного гена rhaS проводили с использованием баз данных NCBI GenBank у штаммов Y. pestis KIM (биовар medievalis), CO92 (био-вар orientalis), Nepal156 и Antiqua (биовар antiqua), Pestoides F (по отечественной классификации - кавказский подвид) и Y. pseudotuberculosis IP32953 и IP31758.

Конструирование праймеров и условия проведения полимеразной цепной реакции. Для определения нуклеотидной последовательности гена rhaS с помощью программы Primer Express были рассчитаны праймеры, фланкирующие полную нуклеотидную последовательность указанного гена [(rhaSc-s (GGT TTA GTC ATC ACT GCT GC) и rhaSc-a (GTT CAC GCC CTT TCT TGC)]. ПЦР проводили на амплифика-торе БИС-110 (ООО «БИС-Н», Россия). Реакционная смесь имела состав: 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0); 2,5 мМ MgCl2; по 0,2 мМ каждого из нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP, dTTP; по 0,6 мМ каждого праймера;

5 ед. Taq ДНК-полимеразы (Бионем, Москва) и 10 нг ДНК. Температурный профиль амплификации: 1 цикл 95 °С в течение 5 мин, затем 30 циклов (95 °С -30 с, 58 °С - 30 с, 72 °С - 1 мин) и завершающий цикл при 72 °С в течение 5 мин. В качестве матрицы в ПЦР использовали препараты тотальной ДНК штаммов Y pestis. Синтез олигонуклеотидных праймеров осуществляли на автоматическом синтезаторе ДНК АСМ-800 (Биоссет, Россия) в РосНИПЧИ «Микроб». Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов проводили в 2 % агарозном геле (Bio-Rad, США) и регистрировали в УФ-свете. Для контроля молекулярной массы использовали коммерческие маркеры GenRuler TM 50 bp DNA Ladder (MBI Fermentas, Литва).

Определение нуклеотидной последовательности гена rhaS исследуемых штаммов проводили с помощью ферментативного секвенирования методом «терминаторов» [9].

Для первичной обработки данных использовали программы: «3100 Data Collection Software 1.1» и «DNA Sequencing Analyis Software 3.7». Выравнивание и сравнение полученных последовательностей проводили в программе MEGA 4. Для сравнения секвенированных нами нуклеотидных по-мледовательностей с представленными в базе данных NCBI GenBank использовали алгоритм BLAST.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования проведен сравнительный анализ нуклеотидной последовательности регуляторного гена rhaS штаммов Y. pestis KIM, CO92, Antiqua, Nepal 156, Pestoides F и Y. pseudotu-

berculosis IP32953 и IP31758, представленных в базе данных NCBI GenBank.

Представленные в международной базе данных штаммы возбудителя чумы относятся к различным биоварам основного подвида Y. pestis и не ферментируют рамнозу, тогда как штаммы Y. pseudotuberculosis способны катаболизировать этот углевод. Штаммы возбудителя псевдотуберкулеза были использованы для сравнения с возбудителем чумы, поскольку, по современным представлениям, этот микроорганизм является непосредственным предшественником чумного микроба и целый ряд генов, продукты которых участвуют в метаболических процессах, у чумного микроба повреждены в процессе эволюционного перехода к новому способу существования.

Результаты, полученные при анализе нуклеотидных последовательностей гена rhaS у Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, свидетельствуют о наличии ряда нуклеотидных замен в изучаемом гене у штаммов возбудителя чумы по сравнению с псевдотуберкулезным микробом, некоторые из которых, возможно, являются причиной различной способности этих возбудителей ферментировать рамнозу.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Для выяснения причин неодинаковой ферментативной активности в отношении рамнозы у штаммов возбудителя чумы, циркулирующих на территории России и ближнего зарубежья, нами была определена полная нуклеотидная последовательность регуляторного гена rhaS у 5 штаммов основного подвида Y pestis (Зауральский степной, Устюртский, Копетдагский пустынные, Сарыджасский и Аксайский высокогорные очаги чумы) и 10 штаммов неосновных подвидов: по 2 изолята кавказского (Зангезуро-Карабахский и Приараксинский горные), алтайского (Алтайский горный), гиссарского (Гиссарский высокогорный), улэгейского (Монголия) подвидов чумного микроба, а также 2 штамма из Таласского высокогорного очага чумы. Были изучены также 3 штамма Y. рseudotuber-cu lo sis I-III сероваров (табл. 1).

Результаты анализа структуры гена rhaS, размер которого составляет 822 п.н., свидетельствуют о том, что штаммы Y. рseudotuberculosis I, III, 312 (секвенированы нами), как и Y. рseudotuberculosis IP31758 (NCBI GenBank), содержат в позициях 416 и 495 п.н. - аденин, в отличие от штамма Y. рseudo-tuberculosis IP32953 (GenBank), у которого в этих положениях находится гуанин. В штаммах Y. рseudotu-berculosis I и III в позициях 183 п.н. и 702 п.н. содержится тимин, тогда как в геноме штамма Y. рseudotu-berculosis 312 и представленных в базе данных NCBI GenBank Y. рseudotuberculosis IP32953 и IP31758-цитозин. Нами выявлены также уникальные нуклеотидные замены у штаммов Y. рseudotuberculosis 312 в позиции 789 п.н. (гуанин вместо аденина у остальных штаммов) и Y. рseudotuberculosis IP31758 в позиции 790 п.н. (гуанин вместо цитозина у остальных изолятов). Однако выявленные нами единичные нуклеотидные замены, очевидно, не имеют значения для проявления изучаемого свойства у возбудителя

псевдотуберкулеза, поскольку все штаммы возбудителя способны к ферментации рамнозы и, следовательно, способность катаболизировать этот углевод является видоспецифическим признаком для У. рseu-dotubeгculosis.

На следующем этапе исследования проведен сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена гка8 штаммов чумного микроба основного подвида (не ферментируют рамнозу) и неосновных подвидов (ферментируют рамнозу). Было установлено, что штаммы кавказского, алтайского, гиссарского, улэгейского подвидов и таласские изоляты в позиции 671 п.н. гена гка8 содержат гуанин. Этот же нуклеотид выявлен и у штаммов У. рseudotubeгculosis как представленных в базе данных КСБ1 ОепБапк, так и секвенированных нами (табл. 2). В отличие от них, у всех изученных нами штаммов основного подвида У. рestis - А-1836, А-161, М-519, М-231, А-1793 (не ферментируют рамнозу), выделенных на территории России и приграничных государств, как и у штаммов,

представленных в базе данных NCBI GenBank (KIM, CO92, Nepal156, Antiqua), в позиции 671 п.н. находится аденин (табл. 2). Поскольку это единственное общее отличие между штаммами основного подвида возбудителя чумы и штаммами неосновных подвидов, а также псевдотуберкулезным микробом, то, вероятно, наличие именно этой нуклеотидной замены является причиной отсутствия способности к ферментации рамнозы у штаммов основного подвида.

Для обработки полученных результатов мы использовали программное обеспечение Mega 4, с помощью которого установлено, что выявленная нами нуклеотидная замена в положении 671 п.н. приводит к смене триплета CGC, кодирующего аминокислоту аргинин (Y. pseudotuberculosis, неосновные подвиды Y. pestis) на триплет CAC, детерминирующий синтез гистидина (основной подвид Y. pestis). Эти аминокислоты различаются между собой по строению боковых цепей: в состав аргинина входит гидроксильная группа, тогда как молекула гистидина содержит

Таблица 2

Вариабельность гена RhaS (822 н.п.) у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis

Штамм

Подвид, Положение единичных замен

серовар 789 790 780 702 671 494 495 482 416 18З

Yersinia pestis

А 18З6 Основной A C C C A T A G A C

М 519 A C C C A T A G A C

А 161 " A C C C A T A G A C

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

2З1 A C C C A T A G A C

А179З " A C C C A T A G A C

А-1728 Гиссарский A C C C G T A A A C

А-1249 Гиссарский A C C C G T A A A C

81S Кавказский A C C C G C A G A C

1146 Кавказский A C C C G C A G A C

И-2З59 Алтайский A C C C G T A G A C

И-2998 Алтайский A C C C G T A G A C

И-З069 Улэгейский A C C C G T A G A C

И-З1З1 Улэгейский A C C C G T A G A C

А-1802 Таласский A C C C G T A G A C

А-1815 Таласский A C C C G T A G A C

Pestoides F* Кавказский A C C C G C A G A C

СО92* Оrientalis A C C C A Т A G A C

KIM* Мedievalis A C C C A Т A G A C

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Antiqua, Nepal 516* ^tiqua A C C C A Т A G A C

Yersinia pseudotuberculosis

III III A C C T G C A G A T

I I A C C T G C A G A T

З12 I G C A C G C A G A C

IP З1758** A G A C G C A G A C

IP З295З** A C C C G C G G G C

* Штаммы Y. pestis KIM, CO92, Nepal156, Antiqua биоваров antiqua, medievalis, orientalis, и Pestoides F. **Штаммы Y. pseudotuberculosis №З295З и IP31758 представлены в базе данных NСBI GenBank.

имидазольное кольцо. Возможно, что такое изменение первичной структуры молекулы регуляторного белка RhaS способно видоизменять его вторичную или третичную структуру и затруднять контакт фермента с молекулой-мишенью.

При анализе структуры гена rhaS у штаммов кавказского подвида (818 и 1146), ферментирующих рамнозу на 1-е сутки, выявлена идентичность с нуклеотидной последовательностью секвенированного нами гена rhaS штаммам Y. pseudotuberculosis, что свидетельствует о наличии у штаммов кавказского подвида гена rhaS «дикого» типа и, в конечном итоге,

об эволюционной древности этого подвида.

У штаммов гиссарского подвида выявлена уникальная нуклеотидная замена в позиции 482 п.н. (аденин), отсутствующая у штаммов других подвидов (гуанин). По данным математического анализа с использованием программы Mega 4, эта замена приводит к изменению аминокислотной последовательности регуляторного белка RhaS у штаммов гиссар-ского подвида - появление тирозина вместо цистеи-на. Возможно, что эта нуклеотидная замена является причиной неустойчивого фенотипического проявления признака ферментации рамнозы у штаммов гис-сарского подвида и может рассматриваться как генетическая особенность этих штаммов (табл. 2).

У штаммов гиссарского, алтайского, улэгейского подвидов и штаммов из Таласского природного очага чумы, в отличие от кавказского подвида, обнаружена нуклеотидная замена в позиции 494 п.н. (тимин вместо цитозина у Y. pseudotuberculosis), что приводит к появлению в составе регуляторного белка RhaS аминокислоты валин вместо аланина. По-видимому, эта замена не является значимой, поскольку штаммы алтайского подвида, несущие эту замену, ферментируют рамнозу в короткие сроки.

Таким образом, секвенирование полной нуклеотидной последовательности регуляторного гена rhaS свидетельствуют о наличии в этом гене синонимических и несинонимических нуклеотидных замен в геноме чумного микроба основного и неосновных подвидов по сравнению с возбудителем псевдотуберкулеза, которые, по-видимому, являются причиной различной способности основного и неосновных подвидов ферментировать рамнозу. Выявленные единичные нуклеотидные замены позволяют дифферен-

цировать штаммы возбудителя псевдотуберкулеза и кавказского подвида Y. pestis от остальных подвидов чумного микроба, основной подвид от неосновных подвидов возбудителя чумы, а также, благодаря наличию уникальных нуклеотидных замен, дифференцировать штаммы гиссарского подвида.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Работа поддержана грантами РФФИ 06-04-08152 ОФИ, 07-04-00100а, 08-04-00731а.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кутырев В.В., Проценко О.А. Классификация и молекулярно-генетические исследования Yersinia pestis. Пробл. особо опасных инф. 1998; 78:11-22.

2. Наумов А.В., СамойловаЛ.В., редакторы. Руководство по профилактике чумы. Саратов; 1992.

3. Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Кутырев В.В., Попов Н.В. и др. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М.: Медицина; 2004. 192 с.

4. Слудский А.А., Дерлятко К.И., Головко Э.Н., Агеев В.С. Гиссарский природный очаг чумы. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та; 2003. 248 с.

5. Шурыгина И.А., Чеснокова М.В., Климов В.Т. и др. Псевдотуберкулез. Новосибирск: Наука; 2003.

6. Holcroft C., Egan S. Interdependence of activation at rhaRS by cyclic AMP receptor protein, the RNA polymerase alpha subunit C-terminal domain, and RhaR. J. Bacteriol. 2000; 182(23):6774-82.

7. MoralejoP., Egan S., HidalgoE. etal. Sequencing and characterization of a gene cluster encoding the enzymes for L-rhamnose metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1993; 175(17):5585-94.

8. Power J. L-rhamnose genetic system in Escherichia coli. Genetics. 1967; 55:557-68.

9. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1977; 74(12):5463-67.

10. Wicktrum J., Santangela T., Egan S. Cyclic AMP receptor protein and RhaR synergistically activate transcription from the L-rhamnose-responsive rhaSR promoter in Escherichia coli. J. Bacteriol. 2005; 187(19):6708-18.

L.M.Koukleva, G.A.Yeroshenko, V.E.Kouklev, Ya.M.Krasnov, N.P.Guseva.

G.N.Odinokov, VV.Kutyrev

Comparison of Complete Nucleotide Sequence of rhaS Gene in the Strains of Plague Etiological Agent of Main and Minor Subspecies

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov

Determined was complete nucleotide sequence of rhaS gene, the regulatory gene of rha locus of chromosome in Yersinia pestis strains of main and minor subspecies and in Y. pseudotuberculosis of I-III serovariants. The presence of significant and inessential nucleotide replacements in rhaS gene was shown. Evidently, these replacements are the cause of different abilities for rhamnose fermentation in the strains of plague etiological agent (main and minor subspecies) and those of pseudotuberculosis agent.

Key words: etiological agent of plague, Y. pestis main and minor subspecies, rhamnose fermentation, nucleotide sequence.

nocTynu^a 26.02.08.