CC BY
20
УДК: 616.981. 452: 575
Г.А.Ерошенко, Е.И.Кошель, Г.Н.Одиноков, Н.Ю.Шавина, Я.М.Краснов, Н.П.Гусева, В.В.Кутырев
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ phoP/phoQ И rovA - ГЛОБАЛЬНЫХ РЕГУЛЯТОРОВ ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Проведено сравнение нуклеотидных последовательностей генов - глобальных регуляторов транскрипции phoP/phoQ и rovA у природных штаммов Yersinia pestis разных подвидов. Выявлена полная идентичность у них последовательности секвенированного фрагмента phoQ и высокий консерватизм гена rovA. В гене phoP у всех штаммов возбудителя чумы основного подвида присутствует миссенс-мутация - замена единичного нуклеотида G^-A в позиции 643 от начала гена, которая вызывает смену аминокислотного остатка Gly ^ Ser в позиции 215 а.о. полипептидной цепи белка PhoP и, возможно, является причиной изменения транскрипционной активности PhoP у штаммов Y. pestis основного подвида.
Ключевые слова: возбудитель чумы, регуляторные гены, вариабельность нуклеотидных последовательностей.
G.A.Eroshenko, E.I.Koshel’, G.N.Odinokov, N.Yu.Shavina, Ya.M.Krasnov, N.P.Guseva, V.V.Kutyrev
Variability of phoP/phoQ and rovA Genes Sequences - Global Regulators of the Plague Agent Life Span
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Compared are the gene sequences of the global phoP/phoQ and rovA transcription regulators in original Yersinia pestis strains of different subtypes. Detected is overall identity of the sequenced phoQ fragment and high conservatism of the rovA gene. All the plague agent strains belonging to the main subspecies have a missense mutation in phoP gene. It is a substitution of a single nucleotide G^A in the position 643 from the beginning of the gene, which causes amino-acid residue shift Gly^Ser in the position 215 in polypeptide chain of the PhopP protein, and, is a possible cause of alteration of the PhoP transcription activity in Yersinia pestis strains belonging to the main subspecies.
Key words: plague agent, regulatory genes, variability of the nucleotide sequences.
Жизненный цикл Yersinia pestis - возбудителя особо опасной природно-очаговой инфекции представляет собой последовательную смену фаз существования, включающих пребывание в организме хозяина - грызуна (или других теплокровных животных) и вне его - в переносчике блохе или во внешней среде. Возбудитель чумы имеет сложную систему генетической регуляции дифференциальной экспрессии систем жизнеобеспечения на разных стадиях своего жизненного цикла. Важное место в этой системе занимают глобальные регуляторные гены, такие как phoP/phoQ и rovA, осуществляющие контроль транскрипции значительного числа генов патогенности и жизнеобеспечения в соответствии с сигналами, поступающими из внешней среды [5, 7, 8, 9, 11, 13].
Для эффективной трансмиссии Y pestis перенос-чиком-блохой необходимо формирование в предже-лудке насекомого массивной биопленки - «чумного» блока [2, 4]. Недавно было показано, что для образования биопленки в пищеварительном тракте блохи обязательно наличие двухкомпонентной сенсорной системы PhoP/PhoQ [12]. У мутантного штамма AphoP - производного Y pestis KIM6+ в преджелудке блохи значительно снижалась экспрессия 133 генов и существенно повышалась экспрессия других 62 генов. Это
означает, что ген phoP необходим для повышения выживаемости Т pestis в пищеварительном тракте блох и для длительного сохранения при хронической инфекции этого переносчика чумы [12]. Наличие гена р^Р также обязательно для развития инфекционного процесса в теплокровном хозяине, поскольку транскрипционный регулятор Р^Р необходим для выживания в макрофагах и, следовательно, для проявления вирулентности возбудителем чумы [7, 9].
Все патогенные виды иерсиний содержат также транскрипционный регулятор RovA, который у энтеропатогенных иерсиний контролирует экспрессию фактора инвазии - инвазина-адгезина 1пу обеспечивающего транслокацию бактерий через эпителий кишечника [5]. У возбудителя чумы этот инва-зин инактивирован, однако RovA все же участвует в проявлении вирулентности Т pestis, поскольку установлено, что мутант АгоуА в 80 раз снижал свою вирулентность (LD50) и терял способность к распространению/колонизации селезенки и легких после заражения. Показано также, что RovA участвует в регуляции таких генов, как psaEFABC, и тем самым, вносит вклад в вирулентность возбудителя [5].
Штаммы возбудителя чумы существенно отличаются друг от друга по вирулентности и эпидемической значимости. Штаммы Т pestis, относящиеся
к основному подвиду, как правило, высоковирулентны и имеют высокий эпидемический потенциал, в то время как штаммы неосновных - кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов имеют избирательную вирулентность и низкий эпидемический потенциал. По сравнению с основным подвидом штаммы неосновных подвидов хуже колонизируют блох и с меньшей эффективностью образуют биопленку на кутикуле нематод [1, 6]. Они приспособлены к существованию в определенных ландшафтногеографических условиях, в то время как штаммы основного подвида распространены по всему миру. Причины различий в патогенности и в особенностях экологии у разных подвидов возбудителя чумы остаются до сих пор не выясненными. Возможно, они связаны с наличием различий в регуляции экспрессии систем жизнеобеспечения и патогенности у разных подвидов У. рвъиъ.
В этой работе нами впервые проведено сравнение нуклеотидных последовательностей генов phoP/phoQ и гоуЛ у природных штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов для выявления возможных различий между ними в
структурно-функциональной организации этих регуляторных генов.
Материалы и методы
В работе использовано 22 природных штамма Y. pestis, полученных из Государственной коллекции патогенных бактерий (таблица). Штаммы культивировали на 1,5 % агаре и бульоне LB (pH 7,2) при 28 °С в течение 18-24 ч. Выделение ДНК штаммов проводили общепринятым способом [3]. ПЦР выполняли в стандартных условиях при следующем температурном режиме: 1 цикл - 94 °С в течение 5 мин, 30 циклов - 94 °С 30 с, 55 °С 30 с, 72 °С 1 мин и завершающий цикл - 72 °С в течение 5 мин. Продукты, полученные в ПЦР, анализировали методом электрофореза в 1 % агарозном геле.
Амплифицированные фрагменты гена phoP/ phoQ и rovA у штаммов Y. pestis секвенирова-ли на генетическом анализаторе модели «CEQ 8000» (Beckman Coulter) по методу F.Sanger [10]. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов проводили с использованием ал-
Вариабельность нуклеотидных последовательностей геновphoP/phoQ и rovA у штаммов Y. pestis разных подвидов
Штамм, природный очаг ГЕНЫ
phoP (G ^ A, б43*) 34б** phoQ (G ^ A, 214) 729 rovA (A ^ C, б5) 539
Основной подвид:
С092 ^СВ1 GenBamk)
М956 Волго-Уральский песчаный
А-1822 Кызылкумский пустынный
А-1824 Кызылкумский пустынный
807 Кобыстанский равнинно-предгорный
А-1793 Зауральский степной
И-1270 Забайкальский степной
И-1996 Забайкалький степной
И-3244 Боян-Улегейский аймак, МНР
177 Прикаспийский песчаный
С-471 Центрально-Кавказский высокогорный
212 Африка
Кавказский pestodies F ^СВ1 GenBank)
3544 Арм Ленинаканский горный 1146 Зангезуро-Карабахский горный
Алтайский И-2359 Алтайский горный И-2998 Алтайский горный И-3086 Баян-Хонггорский аймак, МНР
Улегейский И-3068 Убур-Хангай, МНР И-3071 Южно-Гобийский аймак, МНР И-3130 Южно-Гобийский,МНР
Гиссарский А-1633 Гиссарский высокогорный А-1728 Гиссарский высокогорный А-1724 Гиссарский высокогорный
+C после 351
Т ^ А в позиции 200
А ^ G в позиции 203 Т ^ А в позиции 204
*Положение мутации. **Размер секвенированного фрагмента гена.
+
2б
горитма BLAST (NCBI) и программного обеспечения MEGA 5.0.
Результаты и обсуждение
На первом этапе нами был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов phoP/phoQ и rovA у штаммов Y. pestis CO92 (ori-entalis), KIM (medievalis), Antiqua (antiqua), Nepal516 (antiqua), Angola, 91001 (microtus), Pestoides F (кавказский подвид), Z176003, D106004, D182038, представленных в базе данных NCBI GenBank. В результате было установлено, что ген phoQ, имеющий размер 1455 пар нуклеотидов (п.н.) и кодирующий сенсорный белок PhoQ, имеет идентичное строение у штаммов CO92, KIM, Antiqua, Nepal516, Angola. 91001, Z176003, D106004 возбудителя чумы. В отличие от них у штамма Pestoides F в 214 позиции от начала гена phoQ присутствует миссенс-мутация G ^ A, приводящая к смене кодона GTT ^ ATT и кодируемой аминокислоты Val ^ Ile в позиции 72 аминокислотного остатка (а.о.) белка PhoQ. Только у одного штамма - D182038, относящегося к основному подвиду, присутствует миссенс-мутация Т ^ G в 662 позиции от начала гена phoQ, вызывающая смену кодона CTG ^ CGG и кодируемой им аминокислоты Leu ^ Arg в позиции 221 а.о. Кроме того, у штамма D182038 в гене phoQ содержится еще одна мутация -делеция единичного нуклеотида (АС) в 719 позиции, приводящая к сдвигу рамки считывания и термина-ции трансляции белка PhoQ после 247 а.о. Однако данная мутация может не вызвать потери функции сенсорного белка PhoQ, поскольку она не затрагивает структуру его активного центра.
В гене phoP (размер гена 672 п.н.) у всех штаммов Y. pestis основного подвида (CO92. KIM, Antiqua, Nepal516, Z176003, D106004, D182038) наблюдалось наличие миссенс-мутации в 643 позиции от начала гена - замены единичного нуклеотида G ^ A относительно штаммов Angola, 91001, Pestoides F, которая приводит к смене аминокислотного остатка Gly ^ Ser в позиции 215 а.о. полипептидной цепи, кодируемой этим геном. Выявленная мутация в гене phoP, по-видимому, может быть связана с различной патогенностью или разной выживаемостью в блохах, поскольку присутствует у всех штаммов основного подвида и отсутствует у штаммов неосновных подвидов.
Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности еще одного глобального регулятора - гена rovA (размер гена 432 п.н.) - выявил идентичность его структуры у всех штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis за исключением штамма Antiqua, у которого в 65 позиции этого гена обнаружена миссенс-мутация А ^ С, приводящая к смене триплета САТ ^ ССТ и кодируемой аминокислоты His ^ Pro в позиции 22 а.о. полипептидной цепи белка - регулятора транскрипции RovA.
Для выявления изменчивости генов phoP, phoQ и rovA у природных штаммов возбудителя чумы основ-
ного и неосновных подвидов нами с использованием программы Primer Express были рассчитаны праймеры на вариабельные участки этих генов, которые имели следующий состав: phoP-S TTATCCGCAACGCAGGGAAAGT
phoP-As ATGGGCTCTGAAGGTGCTTT
phoQ-S СGGTGGTAGGTTATATCG
phoQ-As TAAGGCTGTGAGTGAGGT
rovA-S ATAGACTGGACTCTGGGA
rov-As GTACTGTGGGGCTTGTTT
Размеры амплифицированных с помощью этих праймеров фрагментов ДНК составляли для p^Q -729 п.н, phoP - 346 п.н., rovA - 539 п.н. Полученные с применением рассчитанных праймеров ПЦР фрагменты природных штаммов Y. pestis были секвени-рованы и определены нуклеотидные последовательности вариабельных фрагментов генов phoP, phoQ и всего гена rovA. Всего изучено 22 природных штамма Y. pestis, 11 из которых принадлежали к основному подвиду и 11 (по три штамма алтайского, гиссарско-го и улегейского подвидов и два штамма кавказского подвида) - к неосновным подвидам (таблица).
Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов phoP у штаммов Y. pestis выявило наличие вариабельного локуса в позиции 643 от начала гена. У всех 11 штаммов неосновных подвидов в этой позиции присутствовал нуклеотид G. У штаммов предшественника возбудителя чумы -псевдотуберкулезного микроба Y pseudotuberculosis PB1/+, YPIII, IP 32953, IP 31758 , представленных в базе NCBI GenBank, в этой позиции также содержался нуклеотид G. В отличие от них все 11 секве-нированных нами штаммов Y. pestis основного подвида содержали миссенс-мутацию в 643 позиции от начала гена - замену единичного нуклеотида G ^ A, которая приводит к замене аминокислотного остатка (Gly ^ Ser) в позиции 215 регуляторного белка PhoP. Регуляторный белок PhoP состоит из 223 а.о. и включает согласно базе данных Pfam (http://pfam.janelia. org/) два домена. Первый из них - N-концевой регуляторный домен (3-112 а.о.) и второй С-концевой домен (146-220 а.о.), обладающий ДНК-связывающей активностью с HTH (от англ helix-turn-helix) мотивом. Выявленная в штаммах Y. pestis основного подвида мутация приводит к замене аминокислоты в положении 215 а.о. С-концевого ДНК-связывающего домена, что, возможно, вызывает изменение активности белка PhoP у штаммов Y. pestis основного подвида по сравнению со штаммами неосновных подвидов.
Сравнение нуклеотидных последовательностей другого гена - phoQ этой двухкомпонентной сенсорной системы PhoP/PhoQ выявило полную идентичность секвенированного фрагмента гена (729 п.н.) у всех 22 изученных штаммов основного и неосновных подвидов, в том числе и у двух штаммов кавказского подвида (таблица). Ранее у штамма кавказского подвида Y. pestis pestoides F, представленного в базе данных NCBI GenBank, нами выявлено наличие замены единичного нуклеотида G ^ A в позиции 214 от нача-
ла гена, однако ее отсутствие у двух изученных нами природных штаммов этого подвида означает, что выявленная у pestoides Б мутация является либо индивидуальной для этого штамма, либо она характерна для определенной группы штаммов этого подвида.
В гене гоуЛ у исследованных штаммов У. pestis установлено наличие индивидуальных замен, встречающихся только у отдельных штаммов. У штамма алтайского подвида У. pestis И-3086 присутствовала замена единичного нуклеотида Т ^ А в позиции 200, у штаммов гиссарского подвида И-3068 замена А ^ в в позиции 203 и у И-3071 - Т ^ А в позиции 204. Все три штамма выделены на территории Монголии. У других штаммов эти мутации отсутствовали. Только у одного из штаммов основного подвида - А-1824 из Кызылкумского песчаного очага чумы выявлена другая мутация - вставка единичного нуклеотида С после 351 позиции. Эта мутация приводит к сдвигу рамки считывания, что влечет за собой изменение аминокислотного состава белка RovA в его концевой части (таблица).
Таким образом, в этой работе нами проведено сравнение нуклеотидных последовательностей генов phoP/phoQ и гоуЛ, кодирующих глобальные транскрипционные регуляторы PhoP/PhoQ и RovA. В гене phoP у всех штаммов основного подвида присутствует миссенс-мутация, которая вызывает замену единичного нуклеотида и смену кодируемого аминокислотного остатка глицина на серин в позиции 215 регуляторного белка Р^Р. Возможно, что эта мутация, общая для всех штаммов основного подвида, приобретенная на ранней стадии эволюции этого подвида, привела к изменению вторичной структуры одного из доменов белка Р^Р, что вызвало изменение его регуляторной активности. Известно, что штаммы основного подвида обладают большей патогенностью и способностью выживать в блохах по сравнению со штаммами неосновных подвидов. Последовательность гена phoQ, кодирующего сенсорный белок двухкомпонентной системы PhoP/PhoQ, была высококонсервативна у штаммов всех подвидов, несмотря на большой размер секве-нированного нами фрагмента (729 п.н.) этого гена. что указывает на важность сохранения структурнофункциональной целостности гена phoQ и кодируемого им белка PhoQ.
Последовательность небольшого (432 п.н.) гена гоуЛ оказалось достаточно консервативной у исследованных штаммов У. pestis разных подвидов, что также свидетельствует о важности сохранения его структурно-функциональной целостности для патогенности У. pestis.
Работа выполнена по государственному контракту № 70-Д от 25 июля 2011 г. в рамках федераль-
ной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Базанова Л.П., Иннокентьева Т.И. О роли блох - основных и второстепенных переносчиков чумы - в циркуляции возбудителя в сибирских природных очагах. Мед. паразитол. и пара-зитарн. бол. 2008; 3:4-60.
2. Кутырев В.В., Коннов Н.П., Волков Ю.П. Возбудитель чумы: ультраструктура и локализация в переносчике. М.: Медицина; 2007. 222 с.
3. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукДж. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984. 480 с.
4. Bacot A.W., Martin C.J. Observation on the mechanism of the transmission of plague by fleas. J. Hyg. (Lond). 1914; 13 (Suppl.):423-39.
5. Cathelyn J.S., Grosby S.D., Lathem W.W., Goldman W.E., Miller V.l. RovA - a global regulator of Yersinia pestis, specifically required for bubonic plague. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103:13514-19.
6. Eroshenko G.A., Vidyaeva N.A., Kutyrev V.V. Comparative analysis of biofilm formation by main and nonmain subspecies of Yersinia pestis strains. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2010; 59:513-20.
7. Grabenstein J.P., Fukuto H.S., Palmer L.E., Bliska J.B. Characterization of phagosome trafficking and identification of PhoP-regulated genes important for survival of Yersinia pestis in macrophages. Infect. Immun. 2006; 74:3727-41.
8. Hitchen P.G., Prior G.L., Oyston P.C., Panico M., Wren B.W., TitballR.W. etal. Structural characterization of lypo-oligosaccharide (LOS) from Yersinia pestis: regulation of LOS structure by the PhoPQ system. Mol. Microbiol. 2002; 44:637-50.
9. Oyston P.C.F., Dorell N., Williams K., Li S.-R., Green M., Titball R.W., Wren B.W. The response regulator PhoP is important for survival under conditions of macrophage-induced stress and virulence in Yersinia pestis. Infect. Immun. 2000; 68:3419-25.
10. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977; 74:5463-7.
11. Tran H.J., Heroven A.K., Winkler L., Spreter T., Beatrix B., Dersch P. Analysis of RovA, a transcriptional regulator of Yersinia pseudotuberculosis virulence that acts through antirepression and direct transcriptional activation. J. Biol. Chem. 2005; 280:42423-32.
12. Vadivaloo V.V. PhoP regulation of Yersinia pestis during flea infection. In: Yersinia 2010. 10th Intern. Symp.; 2010 Oct 23-27. Brazil; 2010. P. 67.
13 Zhou D., Han Y., Qin I., Chen Z., Qin J., Song Y. et al. Transcriptome analysis of the Ms2+-responsive PhoP regulator in Yersinia pestis. FEMS Microbiol. Lett. 2005; 250:85-95.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Bazanova L.P., Innokent’eva T.I. [Concerning the role of fleas -primary and secondary vectors of plague - for the agent circulation in the Siberian natural foci]. Med. Parazitol. Parazitarn. Bol. 2008; 3:54-60.
2. Kutyrev V.V., Konnov N.P., Volkov Yu.P. [Plague Agent: Ultrastructure and Localization in the Vector]. M.: Meditsina; 2007. 222 p.
3. Maniatis T., Frich E., Sembruk G. [Molecular Cloning]. M.: Mir; 1984. 480 p.
Authors:
Eroshenko G.A., Koshel’ E.I., Odinokov G.N., Shavina N.Yu., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrev V.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Об авторах:
ЕрошенкоГ.А., КошельЕ.И., ОдинокоеГ.Н., ШавинаНЮ., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Поступила 20.12.11.
