CC BY
49
УДК 616.981.452
Г.Н.Одиноков, Г.А.Ерошенко, Н.А.Видяева, Я.М.Краснов, Н.П.Гусева, В.В.Кутырев
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ NAP ОПЕРОНА У ШТАММОВ YERSINIA PESTIS РАЗНЫХ ПОДВИДОВ
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Проведен структурно-функциональный анализ генов nap оперона, кодирующего диагностически-значимый признак - редукцию нитратов, у Yersinia pestis основного и неосновных подвидов. Установлено, что причиной неспособности части штаммов основного подвида восстанавливать нитраты является наличие замены нуклеотида (G на T в позиции 613 п.н.) в гене napA. Другая замена - G на A в позиции 1021 п.н. гена napA не может служить причиной отсутствия этого диагностического признака у неосновных подвидов и у биовара microtus, поскольку встречается как у денитрифицирующих, так и неденитрифицирующих штаммов Y. pestis.
Ключевые слова: возбудитель чумы, основной и неосновные подвиды, нитратредукция, структурный ген, му-
тации.
Способность редуцировать нитраты является одним из важнейших дифференциально-диагностических признаков, лежащих в основе современных схем внутривидовой классификации Yersinia pestis. По существующей зарубежной классификации штаммы античного (antiqua) и восточного (orientalis) биова-ров чумного микроба обладают денитрифицирующей активностью, в то время как штаммы средневекового (medievalis), а также недавно предложенного D.Zhou et al. биовара microtus не способны восстанавливать нитраты [1, 3, 5]. Согласно имеющимся данным причиной отсутствия денитрифицирующей активности у биоваров medievalis и microtus является наличие единичных нуклеотидных замен в гене napA (в позиции 613 и 1021 п.н. соответственно), которые приводят к нарушению структуры кодируемого этим геном продукта - периплазматической нитратредуктазы [5].
Штаммы основного и неосновных подвидов чумного микроба, циркулирующие в различных природных очагах на территории РФ и стран ближнего зарубежья, также различаются по их денитрифицирующей активности [1, 2]. Штаммы высоковирулентного основного подвида неоднородны по этому признаку и отличаются по их способности редуцировать нитраты, что позволяет предположить их принадлежность к различным биоварам. Кавказский подвид восстанавливает нитраты, в отличие от других неосновных - алтайского, улегейского подвидов, а также штаммов таласской группы, которые не обладают этим свойством. Штаммы гиссарского подвида преимущественно лишены денитрифицирующей активности [1].
Генетические причины неспособности к денитрификации у некоторых штаммов основного и неосновных подвидов остаются до настоящего времени не выясненными. Данные по этому вопросу в литературе отсутствуют. В связи с этим целью нашей работы было изучение структурно-функциональной организации генов nap оперона для установления причины отсутствия редуцирующей активности у штаммов Y pestis основного и неосновных подвидов.
Материалы и методы
В работе использовано 22 штамма Y. pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов Российской Федерации и ближнего зарубежья (таблица), которые получены из Государственной коллекции патогенных бактерий.
Для определения нуклеотидной последовательности вариабельных областей гена napA с помощью программы Primer Express нами рассчитаны праймеры Nap469 - TACGCGGCGTTGAAGTTG и Nap1187 -TTGCCGGTTAACAGGTGC. Амплификацию фрагмента гена napA в ПЦР осуществляли по следующей схеме: 1 цикл 94 °С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 94 °С - 45 с, 56 °С - 1 мин, 72 °С - 45 с и завершающий цикл 3 мин при 72 °С.
Результаты и обсуждение
В начале исследований был проведен сравнительный компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей пяти генов nap оперона, а также гена narP, участвующего в восстановлении нитратов
[4], у штаммов Y pestis KIM (medievalis), CO92 (orientalis), Antiqua, Angola. Nepal516 (Antiqua), 91001 (microtus), Pestoides F (кавказский подвид) и Yersinia pseudotuberculosis PB1/+, IP 32953, IP 31758, YPIII, представленных в базе данных NCBI GenBank. В результате установлено наличие единичных нуклеотидных замен в генах napB (в позиции 51, 135, 268 п.н. от начала гена), napC (54, 219, 507, 519) napD (69, 95, 192, 211), napF (322) и в гене narP (72, 139. 140, 198). Однако эти замены, по-видимому, не могли быть причиной нарушения проявления изучаемого признака, поскольку присутствовали у денитрифицирующих штаммов чумного и некоторых штаммов псевдотуберкулезного микробов.
Результаты компьютерного анализа нуклеотидной последовательности структурного гена napA, размер которого составляет 2493 п.н., показали присутствие в нем 27 единичных нуклеотидных замен у различных
Характеристика использованных в работе штаммов Y pestis
Штамм Природный очаг Позиция в гене napA Редукция
613 п.н.* 1021 п.н.* нитратов
А-161 Основной подвид Устюртский T G
А-1836 Сарыджазский G G +
С-631 Центрально-Кавказский T G -
И-3244 Монголия G G +
А-1818 Таласский T G -
818 Кавказский подвид Приараксинский G A +
С-534 Северо-Западный G A +
С-533 Прикаспийский Каракумский G A +
6499 G A +
И-2377 Алтайский подвид Горно-Алтайский G A
И-3085 Убурхангай, МНР G A -
И-2359 Горно-Алтайский G A -
А-1249 Гиссарский подвид Гиссарский G A
А-1633 Гиссарский G A -
А-1627 Гиссарский G A -
А-1724 Гиссарский G A -
А-1725 Гиссарский G A +
А-1726 Гиссарский G A +
И-2422 Улэгейский подвид Монголия G G
И-3130 Монголия G G -
А-1802 Таласская группа Таласский G A
А-1814 Таласский G A -
* Указана позиция значимых замен нуклеотидов в гене napA.
штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (GenBank). Наиболее значимой оказалась замена нуклеотида G на Т в позиции 613 п.н. от начала гена, которая была выявлена у штамма KIM (биовар medievalis). По данным математического анализа, с использованием программы MEGA4 установлено, что она приводит к смене кодона GAA на ТАА, который является стоп-кодоном и причиной преждевременной терминации трансляции полипептидной цепи (после 204-го аминокислотного остатка) молекулы периплазматической нитратредук-тазы. Эти результаты подтверждают данные других исследователей о том, что причиной отсутствия редукции нитратов у чумного микроба биовара medi-evalis является наличие замены нуклеотида в позиции 613 п.н. гена napA [5].
Причиной неспособности редуцировать нитраты биоваром microtus, согласно данным D. Zhou et al.
[5], является единичная нуклеотидная замена G на A в позиции 1021 п. н. от начала гена napA, приводящая
к смене кодона GCC на АСС и кодируемой аминокислоты аланина (Ala) на треонин (Thr) в позиции 341-го аминокислотного остатка. Однако данные проведенного нами компьютерного анализа свидетельствуют о том, что эта нуклеотидная замена не может быть причиной отсутствия денитрификации у биовара mi-crotus, поскольку она встречается и у штаммов, способных восстанавливать нитраты - Y. pseudotuberculosis PB1/+, IP 32953, IP 31758, YPIII. Таким образом, генетические причины отсутствия способности к редукции нитратов у штаммов биовара microtus остаются не установленными.
Для выявления причин отсутствия денитрифицирующей активности у некоторых штаммов возбудителя чумы нами изучено 22 штамма основного и неосновных подвидов, циркулирующих в природных очагах на территории РФ и ближнего зарубежья (таблица). Основной подвид был представлен четырьмя штаммами из Устюртского, Центрально-Кавказского. Сарыджазского, Таласского очагов чумы и одним штаммом из Монголии. Неосновные подвиды включали 18 штаммов, в том числе 4 изолята кавказского (Приараксинский, Северо-Западный Прикаспийский, Каракумский очаги), 3 - алтайского (Алтайский горный очаг), 6 - гиссарского (Гиссарский высокогорный очаг), 2 - улэгейского (Монголия) подвидов чумного микроба, а также 2 штамма из Таласского высокогорного очага чумы. Все изученные штаммы кавказского подвида обладали денитрифицирующей активностью, в отличие от штаммов алтайского, улэгейского подвидов и таласской группы. В то же время штаммы основного и гиссарского подвидов были неоднородны по проявлению этого признака (таблица).
У всех использованных в работе штаммов проведено изучение гена napA с помощью рассчитанных нами праймеров Nap469-Nap1187 на вариабельный участок, содержащий значимые замены нуклеотидов в позиции 613 п.н. и 1021 п.н (рисунок). В ПЦР был получен специфический амплификат фрагмента гена napA, имеющий размер 719 п.н., при секвенирова-нии которого установлено, что штаммы основного подвида А-161, С631, А-1818, неспособные редуцировать нитраты, имели единичную нуклеотидную замену G на Т в позиции 613 п.н., характерную для
Структура гена napA, кодирующего периплазматическую нитратредуктазу у штаммов Y. pestis. Стрелками указаны места посадки праймеров Nap469 и Nap1187, фланкирующих вариабельный участок гена. Также указано положение нуклеотидных замен (в позициях 613 и 1021 п.н.), которые, по литературным данным, приводят к нарушению функциональной активности гена napA
штаммов биовара medievalis, которая приводит к смене кодона (GAA на ТАА) и преждевременной тер-минации трансляции полипептидной цепи молекулы периплазматической нитратредуктазы. В отличие от них, штаммы основного подвида И-3244 и А-1836, обладающие денитрифицирующей активностью, а также все штаммы неосновных подвидов независимо от наличия или отсутствия этой активности подобного генетического дефекта в позиции 613 п.н. не имели.
У штаммов кавказского подвида, способного восстанавливать нитраты, в гене napA нами установлено наличие нуклеотидной замены G на A в позиции 1021 п.н., которая обнаружена и у алтайского, гиссарского подвидов и штаммов таласской группы, не обладающих таким свойством. У всех штаммов основного и улэгейского подвидов нуклеотидная замена в позиции 1021 п.н. отсутствовала. Эти данные подтверждают сделанный нами выше на основании данных компьютерного анализа вывод о том, что наличие замены нуклеотида в позиции 1021 п.н. не является причиной отсутствия редукции нитратов у биовара microtus, поскольку она выявлена нами и у штаммов разных подвидов Y. pestis как способных, так и неспособных редуцировать нитраты.
Таким образом, проведенное секвенирование нуклеотидной последовательности вариабельного фрагмента гена napA, полученного с помощью пары праймеров Nap469-Nap1187, показало наличие единичной нуклеотидной замены G на Т в позиции 613 п.н. у части штаммов основного подвида, что коррелировало с отсутствием у них способности восстанавливать нитраты. Наличие уникальной нуклеотидной замены в позиции 613 п.н., являющейся генетической меткой биовара medievalis, у штаммов А-161, С-631 и А-1818 основного подвида может служить основанием для отнесения их к биовару me-dievalis.
Нуклеотидная замена G на A в позиции 1021 п.н. обнаружена нами у всех неосновных подвидов Y. pestis как денитрифицирующих, так и не восстанавливающих нитраты, за исключением улэгейского, также неспособного к редукции нитратов, подвида. В связи с этим замена в позиции 1021 п.н., вопреки мнению D. Zhou et al. [5] не может являться причиной отсутствия денитрифицирующей активности у штаммов биовара microtus, так как обнаружена у
штаммов кавказского подвида, восстанавливающих нитраты, но не обнаружена у штаммов улэгейского подвида, не обладающих денитрифицирующей активностью. По всей видимости, генетические причины отсутствия способности редуцировать нитраты у биовара microtus и у алтайского, улегейского, части штаммов гиссарского подвидов, а также таласской группы штаммов следует искать за пределами nap оперона в других генах, функционально связанных с восстановлением нитратов. Работа поддержана грантами РФФИ № 07-04-00100, 08-04-00731а и 08-0412082 офи.
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Куклева Л. М., Проценко О. А., Кутырев В.В. Современные представления о родстве возбудителей чумы и псевдотуберкулеза. Мол. ген., микробиол. и вирусол. 2002; 1: 3-7.
2. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Попов Н.В. с соавт. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. Под ред. Г.Г.Онищенко, В.В.Кутырева. М.: Медицина; 2004.
3. Devignat, R. Varietes de l’espece Pasteurella pestis. Nouvelle hypothese. Bull OMS. 1951; 4:247-63.
4. Richardson D.J., Berks B.C., Russell D.A. et al. Functional, biochemical and genetic diversity of procariotyc nitrate reductases. CMLS. 2001; 58:165-78.
5. Zhou D., Tong Z., Song Y. et al. Genetics metabolic variations between Yersinia pestis biovar and the proposal of a new biovar, microtus. J. Bacteriol. 2004; 186:5147-52.
G.N.Odinokov, G.A.Eroshenko, N.A.Vidyaeva, Ja.M.Krasnov, N.P.Gouseva, V.V.Kutyrev
Structural and Functional Analysis of nap Operon Genes in Yersinia pestis Strains of Different Subspecies
Russian Anti-Plague Institute “Microbe", Saratov
Carried out was structural and functional analysis of nap genes coding for a significant diagnostic feature - nitrate reduction in main and non-main subspecies of Yersinia pestis. The presence of a single nucleotide substitution (A for T in position 631) in gene napA was determined to be the reason for the lack of nitrate reduction in part of the main subspecies strains. Other mutation - single nucleotide substitution G for A in position 1021 of napA is not the reason for absence of this diagnostic feature in non-main subspecies and biovar microtus as this substitution is present in denitrifying and nondenitrifying strains.
Key words: plague agent, main and non-main subspecies, nitrate reduction, structural gene, mutation.
Об авторах:
Одиноков Г.Н. (м.н.с.), Ерошенко Г.А. (вед.н.с.), Видяева Н.А. (н.с.), Краснов Я.М. (н.с.), Гусева Н.П. (с.н.с.), Кутырев В.В (директор). Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 41005, Саратов, ул. Университетская, 46. Тел.: (845-2) 26-21-31. E-mail: microbe@san.ru
Поступила 07.11.08.
