CC BY
79
УДК 66.98: 579.842.23
Г.А.Ерошенко, Я.М.Краснов, Н.Ю.Носов, Л.М.Куклева, К.А.Никифоров, Е.Г.Оглодин, В.В.Кутырев
совершенствование ПодвидовоЙ классификации yersinia pestis на основе данных полногеномного секвенирования штаммов из россии
и сопредельных государств
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов,
Российская Федерация
Нами проведено полногеномное секвенирование 20 штаммов Yersinia pestis из всех 11 природных очагов чумы в России и части очагов сопредельных государств. Филогенетический анализ на основе выявленных 1918 ко-ровых SNPs в геномах этих штаммов и 16 штаммов Y. pestis из NCBI GenBank установил наличие 5 кластеров близкородственных штаммов, с учетом которых нами усовершенствована подвидовая классификация возбудителя чумы. Новая классификация включает пять подвидов: основной (ssp. pestis), кавказский (ssp. caucasica), улегейский (ssp. ulegeica) и два новых - центральноазиатский (ssp. central asiatica) и ангольский (ssp. angola). Центральноазиатский подвид объединяет эволюционно родственные штаммы, ранее отнесенные к алтайскому и гиссарскому подвидам, а также штаммы из Таласского высокогорного очага в Киргизии и Узбекистане и штаммы microtus из Китая. В составе центральноазиатского подвида выделено три биовара - алтайский, гиссарский и microtus. Предложено удобное обозначение штаммов: 0.PE4a для алтайских, 0.PE4h для гиссарских, 0.PE4t для таласских штаммов и 0.PE4m для штаммов microtus, а также 0.PE5 для штаммов улегейского подвида.
Ключевые слова: возбудитель чумы, подвиды, совершенствование классификации.
G.A.Eroshenko, Ya.M.Krasnov, N.Yu.Nosov, L.M.Kukleva, K.A.Nikiforov, E.G.Oglodin, V.V.Kutyrev
Updating of Intra-Specific Yersinia pestis Classification, Based on the Results of Whole-Genome Sequencing of the Strains from the Russian Federation and the Neighboring States
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Carried out has been genome-wide sequencing of 20 Yersinia pestis strains from all 11 natural plague foci in Russia and some foci in the neighboring states. Phylogenetic analysis on the basis of 1918 core SNPs, identified in the genomes of these strains and 16 Y. pestis strains from NCBI GenBank, has revealed 5 clusters of closely related strains. Taking these clusters into account, up-dated has been subspecific classification of plague agent. New taxonomy has combined 5 subspecies: major (ssp. pestis), Caucasian (ssp. caucasica), ulegeisk (ssp. ulegeica), and two novel ones - Central Asian (ssp. central asiatica) and Angolan (ssp. angola). Central Asian subspecie comprises evolutionally related strains, earlier classified as altaica and hissarica, as well as the strains from Talas highmountain focus in Kirghizia and Uzbekistan, and microtus strains from China. Central asiatica is divided into three biovars - altai, hissar, and microtus. Set forward is a serviceable designation for the strains: 0.PE4a - for altai ones, 0.PE4h - for hissar, 0.PE4t - for talas, and 0.PE4m - for microtus, and also for ulegeica subspecie - 0.PE5.
Key words: plague agent, subspecies, updating of classification.
Бактерия Yersinia pestis является возбудителем особо опасной природно-очаговой болезни - чумы, носителями которой являются различные виды грызунов, а переносчиками - блохи, паразитирующие на этих грызунах. Природные очаги чумы расположены во многих странах на территории большинства континентов, в том числе 45 из них - в Российской Федерации и странах ближнего зарубежья [6]. Y pes-tis - относительно молодой и генетически однородный бактериальный вид, ведущий свое происхождение от возбудителя псевдотуберкулеза Yersinia pseudotuberculosis [2, 10]. Однако существование отдельных популяций возбудителя чумы в различных ландшафтно-климатических условиях - в степных, пустынных, горных и высокогорных регионах - привело к накоплению в ходе адаптивной эволюции генетических и фенотипических отличий между штаммами Y. pestis, которые могут быть использованы для проведения филогенетического анализа и дифференциации штаммов по географическому региону и очагу происхождения [1, 5, 11, 17].
общепризнанной внутривидовой классифи-
кации Y. pestis не существует. В России и странах ближнего зарубежья широко используется подвидо-вая классификация, в соответствии с которой штаммы делятся на пять подвидов: основной (ssp. pestis) и четыре неосновных - кавказский (ssp. caucasica), алтайский (ssp. altaica), гиссарский (ssp. hissarica) и улегейский (ssp. ulegeica). Отечественная подвидовая классификация принята в 1985 г. и основана на отличиях штаммов Y pestis в ряде биохимических свойств - способности ферментировать некоторые сахара - рамнозу, арабинозу, редуцировать нитраты [4, 8]. Штаммы основного подвида отличаются высокой вирулентностью, имеют высокую эпидемическую значимость и вызывают вспышки, эпидемии и даже пандемии чумы. Они широко распространены в природных очагах чумы по всему миру. Штаммы неосновных подвидов вирулентны, в основном для мышевидных грызунов, редко вызывают заболевания у людей. Неосновные подвиды являются древними формами чумного микроба и занимают промежуточное положение между предшественником Y pseudotuberculosis и основным подвидом Y pestis
[2, 14]. Они не имеют глобального распространения и циркулируют в отдельных географических регионах или природных очагах России, Армении, Грузии, Таджикистана, Киргизии и Узбекистана, а также Монголии и Китая, то есть на территории Евразийского континента. Так, штаммы кавказского подвида распространены в очагах Кавказа и Закавказья, алтайского - в Горно-Алтайском высокогорном очаге России, гиссарского - в Гиссарском высокогорном очаге чумы Таджикистана, улегейского -в Монголии. Известен лишь один штамм - Angola, относящийся к неосновным подвидам, который выделен в Африке [13]. Для некоторых штаммов Y pes-tis, принадлежащих к неосновным подвидам, штаммов из Таласского высокогорного очага Киргизии и Узбекистане, штаммов microtus из двух природных очагов Китая, а также для штамма Angola не определена их подвидовая принадлежность [6, 20 ].
используемая за рубежом классификация предложена еще в 1951 г. Она также основана на отличиях штаммов в биохимической активности - способности редуцировать нитраты и ферментировать глицерин [12]. В соответствии с ней штаммы Y pestis делятся на три биовара - античный, средневековый и восточный, каждый из которых послужил причиной одной из трех прошедших в истории пандемий чумы. все три биовара соответствуют основному подвиду возбудителя чумы по отечественной классификации. Неосновным подвидам зарубежными исследователями не уделяется должного внимания, они обозначаются как «пестоиды». Их долгое время считали редуцированными формами основного подвида.
Анализ популяционной генетики возбудителя чумы стал возможен с проведением полногеномного секвенирования большого числа штаммов Y pestis. Установлено, что штаммы античного биовара принадлежат к нескольким линиям эволюции: 0.ANT, 3.ANT, 4.ANT (Центральная Азия), 1.ANT (Африка), 2.ANT (Юго-Восточная и Центральная Азия). Штаммы средневекового биовара относятся к линии 2.MED и циркулируют в очагах Кавказа, Прикаспия, Центральной Азии. Штаммы восточного биовара распространены в Юго-Восточной и Центральной Азии, Африке, Америке и принадлежат к филогенетической линии 1.ORI. Неосновные подвиды относятся к нескольким филогенетическим линиям: штамм Angola - к 0.PE3, кавказский подвид - к 0.PE2, алтайский подвид и штаммы nicrotus - к 0.PE4, а древние штаммы с Тибетского плато в Китае - к 0.PE7 [10, 11, 17].
Выдвинут ряд предложений по изменению классификации возбудителя чумы. В частности, предлагается выделить четвертый биовар - microtus с включением в него всех неосновных подвидов, а также новых подвидов qinghaiensis, xilingolensis [7, 16, 20]. Однако эти предложения носят формальный характер, поскольку не учитывают данных популя-ционной генетики возбудителя чумы, а также свойства штаммов Y pestis из очагов чумы России и сопредельных стран. В международных базах данных можно найти небольшое количество полногеномных
последовательностей штаммов Y. pestis из стран СНГ, некоторые из них с неустановленным происхождением. Положение этих штаммов в глобальном генетическом разнообразии возбудителя чумы остается неясным.
Цель работы - совершенствование подвидовой классификации возбудителя чумы на основе полногеномного секвенирования штаммов из природных очагов России и сопредельных стран.
Материалы и методы
Штаммы Y pestis, использованные в работе, представлены в таблице. Все штаммы получены из государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». Культивирование штаммов Y pestis проводили на LB агаре и LB бульоне (pH 7,2) при 28 °С в течение 24-48 ч. ДНК штаммов для полногеномного секвенирования выделяли с помощью набора AxyPrep производства AXYGEN Biosciences (Китай). Секвенирование геномов штаммов проводили в системе Ion PGM (Life Technologies, США) в соответствии с инструкцией производителя. Для обработки данных секвенирования применяли пакет программ Ion Torrent Suite software 4.2. и Newbler gsAssembler 2.6. В анализ брали нуклеотидные последовательности штаммов c не менее чем 30-кратной средней глубиной прочтения. Полногеномный SNP-анализ штаммов Y pestis выполняли с помощью программы Wombac 2.0. Построение дендрограмм штаммов проводили с использованием пакета программ Bionumerics 7.5 и алгоритма Maximum Parsimony.
Результаты и обсуждение
Для определения современной внутривидовой структуры Y pestis с учетом штаммов из Российской Федерации и сопредельных стран нами проведено полногеномное секвенирование 20 штаммов, включая 13 штаммов из всех одиннадцати очагов России, 2 штаммов из двух очагов в Киргизии и Узбекистане, 2 штаммов из двух очагов в Армении, 1 штамма из Таджикистана, 2 штаммов из двух регионов Монголии, и установлена их филогенетическая принадлежность (таблица). Полногеномные последовательности штаммов из этих очагов чумы практически не представлены в международных базах данных.
В работе также использованы нуклеотидные последовательности 16 штаммов Y pestis различного происхождения из базы данных NCBI GenBank, принадлежащих к основным ветвям эволюции Y pestis (таблица). Анализ популяционной структуры Y pestis проводили на основе выявления коровых SNPs в полногеномных последовательностях отечественных и зарубежных штаммов с помощью программы Wombac 2.0. Всего выявлено 1918 коровых (общих для всех штаммов) полиморфных нуклеотидов, с использованием которых в программе Bionumerics 7.5. с помощью алгоритма Maximum Parsimony построена дендрограмма штаммов Y pestis (рис. 1).
Штаммы Y pestis на дендрограмме разделились
Штаммы Y. pestis, полногеномные последовательности которых использованы в работе
Штамм Происхождение Внутривидовая принадлежность
Филогенетическая линия Используемые классификации Новая классификация
С-627 Центрально-Кавказский высокогорный очаг, Россия, 1986 г. 2.MED Основной п/в, средневековый б/в Основной п/в, средневековый б/в
М-978 Прикаспийский Северо-Западный степной очаг, Россия, 1990 г. « « «
М-1773 Волго-Уральский песчаный очаг, Россия, 2002 г. « « «
М-1484 Волго-Уральский степной очаг, 1992 г. « « «
М-1864 Прикаспийский песчаный очаг, Россия, 2009 г. « « «
С-791 Дагестанский равнинно-предгорный очаг, Россия, 2003 г. « « «
1116Д Терско-Сунженский низкогорный очаг, Россия, 1970 г. « « «
И-1996 Забайкальский степной очаг, Россия, 1970 г. 2.ANT Основной п/в, античный б/в Основной п/в, античный б/в
КМ932 Тувинский горный очаг, 1987 г. 4.ANT « «
231(708) Аксайский высокогорный очаг, Киргизия, 1947 г. 0.ANT « «
С-741 Восточно-Кавказский высокогорный очаг, Россия, 1998 г. 0.PE2 Кавказский п/в Кавказский п/в
М-986 Зангезуро-Карабахский горный очаг, Армения, 1975 г. « « «
3544 Арм. Ленинаканский горный очаг, Армения, 1979 г. « « «
И-2998 Горно-Алтайский высокогорный, Россия, 1982 г. 0.РЕ4а Алтайский п/в Центральноазиатский п/в
И-2751-55 Горно-Алтайский высокогорный, Россия, 2012 г. « « «
В-1313 Горно-Алтайский высокогорный, Россия, 2014 г. « « «
А-1249 Гиссарский высокогорный очаг, Таджикистан, 1970 г. 0.PE4h Гиссарский п/в «
А-1815 Таласский высокогорный очаг, Киргизия, 1980 г. 0.PE4t Таласский штамм «
И-3086 Монголия, 1983 г. 0.PE4m Штамм тюгой^ «
И-2422 Монголия, 1974 г. 0.PE5 Улегейский п/в Улегейский п/в
Nepal516, Antiqua GenBank 2.ANT 1.ANT Основной п/в, античный б/в Основной п/в, античный б/в
KIM10 « 2.MED Основной п/в, средневековый б/в Основной п/в, средневековый б/в
CO92 « 1.ORI Основной п/в, восточный б/в Основной п/в, восточный б/в
Pestoides F « 0.PE2 Кавказский п/в Кавказский п/в
620024, СМСС05009 « 0.PE7 Кавказский п/в
Pestoides A, Pestoides B « 0.PE4a Алтайский п/в Центральноазиатский п/в
91001, CMCC91090, CMCC93014, CMCC18019, CMCC10025, M0000002 « 0.PE4m Штаммы тюгой^ «
Angola « 0.PE1 « Ангольский п/в
Примечание: п/в - подвид, б/в - биовар.
на пять четко обособленных кластеров. Отдельный большой кластер составили штаммы основного подвида, выделенные в России, странах ближнего и дальнего зарубежья. В этот кластер вошли все 10 секвенированных штаммов основного подвида из России и сопредельных стран: три штамма античного биовара (И-1996 из Забайкальского степного, КМ932 из Тувинского горного и 231(708) из Аксайского высокогорного очагов), семь штаммов средневекового биовара из очагов Прикаспия (М-978. М-1773, М-1484, М-1864) и Кавказа (С-627, С-791, 1116Д). В этот же кластер вошли все использованные штаммы основного подвида из NCBI GenBank: два штамма античного биовара из Непала и Африки (Nepal516, Antiqua), 1 штамм средневеко-
вого биовара из Ирана (К1М10) и один штамм восточного биовара из США (С092).
По данным проведенного анализа, все 14 штаммов основного подвида имеют 38 общих нуклеотид-ных замен, отсутствующих у других штаммов. Из этого следует, что они представляют отдельную внутривидовую систематическую единицу возбудителя чумы. Кластер тесно сгруппирован, что подтверждает близкое родство штаммов основного подвида. количество взятых в анализ штаммов основного подвида может быть значительно увеличено за счет большого числа штаммов этого подвида, содержащихся в международных генетических базах данных, а также за счет секвенированных нами штаммов средневекового биовара из природных очагов
Рис. 1. Кластерная структура Y. pestis, по данным анализа коровых SNPs, в полногеномных последовательностях штаммов из России, стран ближнего и дальнего зарубежья (программа Bionumerics 7.5, алгоритм Maximum Parsimony):
А - неукорененное дерево, Б - укорененное дерево
Казахстана. Однако это не приведет к изменению кластерной структуры возбудителя чумы, представленной на рис. 1.
В кластер основного подвида на дендрограмме включены основные филогенетические линии античного биовара O.ANT (штамм 231(708) из Аксайского высокогорного очага), 1.ANT (штамм Antiqua из Африки), 2.ANT (штамм И-1996 из Забайкальского степного очага и Nepal516 из Юго-Восточной Азии), 4.ANT (штамм КМ932 из Тувинского горного очага), линия 2.MED средневекового биовара (штаммы из очагов Кавказа, Прикаспия, Ирана), линия 1.ORI восточного биовара (штамм CO92 из США). Принадлежность штаммов основного подвида (античный, средневековый и восточный биовары) к одной внутривидовой систематической группе не вызывает сомнения ни у отечественных, ни у зарубежных ученых [7, 11, 14, 17].
Отдельный кластер представлен штаммом уле-гейского подвида И-2422 из Монголии. Он имеет 62 уникальные замены единичных нуклеотидов, которые отделяют его от остальных кластеров дендро-граммы. Нуклеотидная последовательность штаммов улегейского подвида отсутствует в международных базах данных, вследствие чего эта внутривидовая систематическая единица не учитывается при анализе генетического разнообразия Y pestis. Популяция улегейских штаммов обозначена нами как 0.РЕ5. Несмотря на то, что в анализе использована последовательность только одного улегейско-го штамма, тем не менее, она может представлять все улегейские штаммы, поскольку эти штаммы из Монголии генетически однородны [3]. Улегейский подвид является наиболее молодым из всех неосновных подвидов, так как занимает наиболее близкое расположение к штаммам основного подвида и
имеет 5 общих с ними замен нуклеотидов, отсутствующих у других штаммов Т pestis.
Отдельный кластер представлен штаммами, относящимися к алтайскому и гиссарскому подвидам, а также штаммами тюго^ и таласским штаммом. В этот кластер вошли три штамма алтайского подвида из Горно-Алтайского высокогорного очага (И-2998, И-2751-55, В1313) России, один штамм из гиссарского высокогорного очага (и-1249) Таджикистана, один штамм из Таласского высокогорного очага (А-1815) Киргизии и Узбекистана и один штамм (И-3086) из Монголии. В этот же кластер вошли два штамма из NCBI GenBank (Pestoides А, 91001 тюго^). Весь кластер имеет 36 отличительных единичных нуклеотидных замен, не встречающихся у штаммов из других кластеров. Это означает, что входящие в него штаммы составляют отдельную линию эволюции и отдельную внутривидовую систематическую единицу возбудителя чумы. Все штаммы, входящие в этот кластер, имеют одинаковую характеристику по дифференциальным биохимическим признакам. Они не редуцируют нитраты и не ферментируют арабинозу.
В пределах этого большого кластера четко выделяются три подкластера. Тесно сгруппированный подкластер составлен штаммами из горноАлтайского высокогорного очага, а также штаммом Pestoides А ^СВ1 GenBank), из чего следует, что последний также относится к алтайскому подвиду. Алтайские штаммы имеют 18 общих маркерных единичных нуклеотидных замен. Отличия между штаммами в пределах этого подкластера невелики и составляют от 2 до 5 замен нуклеотидов, что свидетельствует о высокой генетической однородности алтайских штаммов. Штамм И-3086, который ранее считался штаммом алтайского подвида из Монголии, не вошел в подкластер алтайских штаммов, а образовал отдельный подкластер вместе со штаммом 91001 тю10ш из Китая (КСВ1 GenBank). Оба штамма имеют 15 общих маркерных мутаций, из чего следует, что штамм И-3086 из Монголии родственен штаммам тю10ш, и штаммы тюго1и циркулируют не только в Китае, но и в Монголии. Возможно также, что штаммы алтайского подвида существуют только в горно-Алтайском высокогорном очаге, о чем свидетельствует их высокая генетическая однородность. Об этом мы уже сообщали ранее [3].
Из структуры этого кластера становится ясным филогенетическое положение штаммов из Таласского высокогорного очага, расположенного в Киргизии и Узбекистане. Неоднократно выдвигались предложения о необходимости выделения таласских штаммов в отдельный подвид или биовар Т pestis [7]. Данные полногеномного секвенирования таласского штамма А-1815 не поддерживают эти предложения. Штамм А-1815 образовал общий подкластер вместе со штаммом гиссарского подвида А-1249 из Гиссарского высокогорного очага Таджикистана. Оба штамма имеют 6 общих мутаций нуклеотидов, не встречающихся у других штаммов, что подтверждает их эволюционное родство. В то же время штам-
мы А-1815 и А-1249 не так близки между собой, как штаммы алтайского подкластера, и имеют соответственно 21 и 36 уникальных замен нуклеотидов. Это не удивительно, так как штаммы гиссарского подвида и таласские штаммы циркулируют в изолированных высокогорных очагах Киргизии, Узбекистана и Таджикистана. Нуклеотидные последовательности геномов гиссарских и таласских штаммов получены впервые и отсутствуют в генетических базах данных. Филогенетические линии этих штаммов для удобства обозначены нами как 0.PE4h и 0.PE4t, а алтайских штаммов и штаммов microtus как 0.PE4a и 0.PE4m.
Весь этот большой кластер штаммов, включающий штаммы алтайского и гиссарского подвидов, таласские штаммы и штаммы microtus, на основании их эволюционного родства и обособленности от других штаммов Y pestis, мы предлагаем выделить в новый отдельный подвид с присвоением ему названия центральноазиатский подвид (ssp. central asiatica). выбор такого названия подвида обусловлен тем, что составляющие его штаммы циркулируют на территории Центрально-Азиатской зоны природной очаговости чумы. В пределах этого подвида можно выделить три биовара, соответствующие трем подкласте-рам. Это алтайский биовар (bv. altaica), гиссарский биовар (bv. hissarica) c включением в него таласских штаммов, а также биовар microtus (штаммы из китая и Монголии). Единство кластера сохраняется и при включении в него других штаммов из базы данных NCBI GenBank: Pestoides В (алтайский штамм) и штаммов microtus - CMCC91090, CMCC93014, CMCC18019, CMCC10025 и M0000002, CMCC91090, CMCC93014, CMCC18019, CMCC10025 и M0000002 из Китая (рис. 2).
некоторые исследователи кроме трех используемых в классификациях биоваров - античного, средневекового и восточного - предлагают выделить новый биовар - microtus с включением в него всех неосновных подвидов, а также новых подвидов - qinghaiensis, xilingolensis - для штаммов из некоторых очагов Китая [7, 16, 19]. На дендрограмме (рис. 1) видно, что штамм M0000002 предлагаемого подвида qinghaiensis входит в подкластер microtus кластера центральноазиатского подвида и не может быть отнесен к отдельному подвиду Y. pestis. то же, по-видимому, касается и близкородственных штаммов xilingolensis. Из кластерной структуры Y. pestis (рис. 1) также следует, что предлагаемое объединение всех неосновных подвидов в подвид или биовар microtus не соответствует популяционной структуре возбудителя чумы. Штаммы microtus представляют лишь отдельный подкластер в составе центральноа-зиатского подвида. Поскольку в одну внутривидовую систематическую единицу не следует включать штаммы, не имеющие близкого родства и не относящиеся к одной филогенетической линии, то выделение биовара или подвида microtus с включением в него неродственных неосновных подвидов является формальным, лишенным генетической основы.
Еще один кластер на дендрограмме Y. pestis (рис. 1) представлен единственным штаммом не-
91001
Рис. 2. Кластерная структура центральноазиатского подвида Y. pestis по данным анализа коровых SNPs в полногеномных последовательностях алтайских (Pestoides A, Pestoides B, И-2998, B-1313, И-2751-55), гиссарского (А-1249), таласского (А-1815) штаммов и штаммов microtus (91001, CMCC91090, CMCC93014, CMCC18019, CMCC10025, M0000002). Программа Bionumerics 7.5, алгоритм Maximum Parsimony с логарифмической обработкой длины ветвей
основного подвида из Африки - штаммом Angola, относящимся к ветви 0.PE3 [13]. Этот штамм имеет более 200 отличительных мутаций, отсутствующих у других штаммов Y. pestis. Штамм Angola представляет независимую ветвь эволюции Y. pestis и, следовательно, должен быть выделен в отдельный ангольский (ssp.angola) подвид. Несмотря на то, что он имеет наиболее длинную ветвь на дендрограмме, он не является самым древним штаммом Y. pestis [4, 7]. Скорость эволюции отдельных ветвей Y. pestis характеризуется значительной вариабельностью, связанной с различным селективным давлением в процессе адаптивной эволюции. Штамм Angola является ярким примером ускоренной эволюции при освоении новой экологической ниши [9, 13, 18].
По общепризнанному мнению и из данных представленной дендрограммы наиболее древними штаммами Y. pestis являются штаммы кавказского подвида и штаммы линии 0.PE7 из Китая [11, 14, 15]. Эти древние штаммы составили на дендрограмме один общий кластер и представляют одну ветвь эволюции. Они имеют 28 общих замен нуклеотидов, не встречающихся у других штаммов Y. pestis, что доказывает их эволюционное родство и принадлежность к одной внутривидовой группе Y. pestis. Однако в пределах кластера эти штаммы образовали два удаленных друг от друга подкластера. Один из них представлен штаммами кавказского подвида С-741, М-986, 3544 Арм. из очагов Кавказа (Россия, Армения) и штам-
мом Pestoides F (NCBI GenBank). Подкластер имеет 61 общую мутацию единичных нуклеотидов. При этом штамм С-741 из Восточно-Кавказского высокогорного очага существенно отличается от других штаммов кавказского подвида.
Отдельный подкластер образовали штаммы 620024 и СМСС05009 линии 0.PE7 c Тибетского плато в Китае, в геноме которых присутствует 109 уникальных замен нуклеотидов. сведения о свойствах этих штаммов достаточно скудны, хотя известно, что они, как и штаммы кавказского подвида, способны вызывать чуму у людей [11]. Мы предлагаем объединить штаммы этого подкластера и подкластера кавказских штаммов в один кавказский подвид на основе их общего эволюционного происхождения. В то же время с учетом различий, существующих между этими штаммами, в дальнейшем при получении более полной информации о штаммах линии 0.PE7 возможно выделение их в отдельный подвид.
Из структуры этого кластера не следует, что наиболее древними штаммами Y. pestis являются штаммы линии 0.PE7, как это утверждается в работе Y.Cui et al. [11]. На дендрограмме (рис.1) видно, что они представляют одну эволюционную ветвь с кавказскими штаммами, разделившуюся на линии 0.PE2 и 0.OPE7. По количеству отличающихся у них SNPs нельзя судить о большей древности одной из этих ветвей, поскольку скорость эволюции у отдельных популяций Y. pestis может значительно отличаться в зависимости от условий существования.
таким образом, в результате проведенного нами анализа полногеномных последовательностей штаммов Y pestis из всех 11 природных очагов Российской Федерации и 7 очагов сопредельных государств, а также зарубежных штаммов различных филогенетических ветвей выявлено наличие пяти обособленных внутривидовых кластеров возбудителя чумы, которые соответствуют пяти подвидам. Это основной (ssp. pestis), кавказский (ssp. caucasica), централь-ноазиатский (ssp. central asiatica), улегейский (ssp. ulegeica и ангольский (ssp. angola) подвиды. Эта классификация во многом совпадает с разработанной ранее отечественной подвидовой классификацией штаммов Y pestis. Нами на основании данных филогенетического анализа с применением технологии полногеномного секевенирования подведена генетическая основа под используемую подвидовую классификацию и проведено ее усовершенствование. При этом учтены генетические особенности штаммов Y. pestis из всех очагов россии и части очагов сопредельных стран, которые ранее не использовались при анализе глобального разнообразия возбудителя чумы. Предлагаемая подвидовая классификации может быть пополнена новыми подвидами в случае открытия популяций Y. pestis c отличающимися свойствами. Новая подвидовая классификация является объективной, поскольку построена на анализе большого числа полиморфных нуклеотидов в геномах штаммов возбудителя чумы различных филогенетических линий. Она отражает структуру вида Y pestis, сформировавшуюся в процессе образования совре-
менных границ распространения возбудителя чумы.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Павлова А.И., Краснов Я.М., Шавина Н.Ю., Гусева Н.П., Виноградова Н.А., Кутырев В.В. Стандартный алгоритм молекулярного типи-рования штаммов Yersiniapestis. Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2012; 3:25-35.
2. Куклева Л.М., Проценко O.A., Кутырев В.В. Современные представления о родстве возбудителей чумы и псевдотуберкулеза. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2002; 1:3-7.
3. Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Одиноков Г.Н., Оглодин Е.Г., Носов Н.Ю., Виноградова H.A., Гусева Н.П., Ерошенко Г. А., Кутырев В.В. Анализ разнообразия и определение геновариан-тов штаммов возбудителя чумы из Монголии. Генетика. 2015; 51(3):298-305.
4. Кутырев В.В., Проценко O.A. Классификация и молекулярно-генетические исследования Yersinia pestis. Пробл. особо опасных инф. 1998; 1(78):11-22.
5. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Краснов Я.М., Куклева Л.М., Черкасов А.В., Шавина Н.Ю., Кутырев В.В. Анализ полногеномной последовательности штаммов Yersinia pestis на основе ступенчатого 680-SNP алгоритма. Пробл. особо опасных инф. 2013; 3:49-54.
6. Онищенко Г.Г., Кутырева В.В., редакторы. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М.: Медицина; 2004. 192 с.
7. Платонов М.Е., Евсеева В.В., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Молекулярное типирование Yersinia pestis. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2013; 2:3-12.
8. Тимофеева Л.А. О таксономии чумного микроба. Пробл. особо опасных инф. 1972; 1(23):15-20.
9. Achtmann M. Insights from genomic comparison of genetically monomorphic bacterial pathogen. Phil. Trams. R. Soc. B. 2012; 367(1590):860-7.
10. Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U SA. 1999; 96(24):14043-8.
11. Cui Y., Yu C., Yan Y., Li D., Li Y., Jombart T., Weinert L.A., Wang Z., Guo G., Xu L., Zhang Y., Zheng H., Qin N., Xiao X., Wu M., Wang X., Zhou D., Qi Z., Du Z., Wu H., Yang X., Cao H., Wang H., Wang J., Yao S., Rakin A., Li Y., Falush D., Balloux F., Achtman M., Song Y., Wang J., Yang R. Historical variation in mutational rate in an epidemic pathogen Yersinia pestis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2013; 110(2):577-82.
12. Devignat R. Variétés de l'espèce Pasteurella pestis. Bull. WHO. 1951; 4(2):247-63.
13. Eppinger M., Worsham P.L., Nikolich M.P., Riley D.R., Sebastian Y., Mou S., Achtman M., Lindler L.E., Ravel J. Genome sequence of the deep-rooted Yersinia pestis strain Angola reveals new insights into the evolution and pangenome of the plague bacterium. J. Bacteriol. 2010; 192(6):1685-99.
14. Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. Biochemical and genetic peculiarities and the phylogenetic relationship of the non-main subspecies in the general scheme of the plague agent evolution. Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 954(1):45-51.
15. Garcia E., Worsham P., Bearden S., Malfatti S., Lang D., Larimer F., Lindler L., Chain P. Pestoides F, an atypical Yersinia pes-tis strain from the former Soviet Union. Adv. Exp. Med. Res. 2007; 603:17-22.
16. Li Y., Cui Y., Hauck Y., Platonov M.E., Dai E., Song Y., Guo Z., Pourcel C., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P., Yang R., Vergnaud G. Genotyping and phylogenetic analysis of Yersinia pestis by MLVA: insights into the worldwide expansion of Central Asia plague foci. PLoS ONE. 2009; 4(6):e6000.
17. Morelli G., Song Y., Mazzoni C.J., Eppinger M., Roumagnac P., Wagner D.M., Feldkamp M., Kusecek B., Vogler A.J., Li Y., Cui Y., Thomson N.R Jombart T., Leblois R., Lichtner P., Rahalison L Petersen J.M., Balloux F., Keim P., Wirth T., Ravel J., Yang R., Carniel E., Achtman M. Yersinia pestis genome sequencing identifies patterns of global phylogenetic diversity. Nat. Genet. 2010; 42(12):1140-3.
18. Wagner D.M., Klunk J., Harbeck M., Devault A., Waglechner N., Sahl J.W., Enk J., Birdsell D.N., Kuch M., Lumibao C., Poinar D., Pearson T., Fourment M., Golding B., Rheim J.M., Earn D.J., Dewitte S., Rouillard J.M., Grupe G., Wiechmann I., Bliska J.B Keim P.S., Scholz H.C., Holmes E.C., Poinar H. Yersinia pestis and the Plague of Justinian 541-543 AD: a genomic analysis. Lancet Infect. Dis. 2014; 14(4):319-26.
19. Zhou D., Tons Z., Song Y., Han Y., Pei D., Pang X., Zhai J., Li M., Cui B., Qi Z., Jin L., Dai R Du Z., Wang J., Guo Z., Wang J., Huang P., Yanget E. Genetics of metabolic variations between Yersinia pestis biovars and proposal of a new biovar, microtus. J. Bacteriol. 2004; 186(15):5147-62.
References
1. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Pavlova A.I., Krasnov Ya.M., Shavina N.Yu., Guseva N.P., Vinogradova N.A., Kutyrev V.V. [Standard algorithm for molecular typing of Yersinia pestis strains]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2012; 3:25-35.
2. Kukleva L.M., Protsenko O.A., Kutyrev V.V. [Modern views on the kinship of plague and pseudotuberculosis agents]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2002; 1:3-7.
3. Kukleva L.M., Shavina N.Yu., Odinokov G.N., Oglodin E.G., Nosov N.Yu., Vinogradova N.A., Guseva N.P., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. [Analysis of diversity and identification of the genovariants of plague agent strains from Mongolia]. Genetika. 2015; 51(3):298-305.
4. Kutyrev V.V., Protsenko O.A. [Classification and molecular-genetic investigations of Yersinia pestis]. Probl. Osobo Opasn.
5. Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Krasnov Ya.M., Kukleva L.M., Cherkasov A.V., Shavina N.Yu., Kutyrev V.V. [Analysis of the genome-wide sequence of Yersinia pestis strains based on the consecutive 680-SNP algorithm]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2013; 3:49-54.
6. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Natural Plague Foci of Caucasus, Caspian Sea Region, Central Asia, and Siberia]. M.: "Meditsina", 2004. 192 p.
7. Platonov M.E., Evseeva V.V., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P. [Molecular typing of Yersinia pestis]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2013; 2:3-12.
8. Timofeeva L.A. [Regarding taxonomy of plague microbe]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 1972; 1(23):15-20.
9. Achtmann M. Insights from genomic comparison of genetically mon-omorphic bacterial pathogen. Phil. Trams. R. Soc. B. 2012; 367(1590):860-7.
10. Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel
E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1999; 96(24):14043-8.
11. Cui Y., Yu C., Yan Y., Li D., Li Y., Jombart T., Weinert L.A., Wang Z., Guo G., Xu L., Zhang Y., Zheng H., Qin N., Xiao X., Wu M., Wang X., Zhou D., Qi Z., Du Z., Wu H., Yang X., Cao H., Wang H., Wang J., Yao S., Rakin A., Li Y., Falush D., Balloux F, Achtman M., Song Y., Wang J., Yang R. Historical variation in mutational rate in an epidemic pathogen Yersinia pestis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2013; 110(2):577-82.
12. Devignat R. Variétés de l'espece Pasteurella pestis. Bull. WHO. 1951; 4(2):247-63.
13. Eppinger M., Worsham P.L., Nikolich M.P., Riley D.R., Sebastian Y., Mou S., Achtman M., Lindler L.E., Ravel J. Genome sequence of the deep-rooted Yersinia pestis strain Angola reveals new insights into the evolution and pangenome of the plague bacterium. J. Bacteriol. 2010; 192(6):1685-99.
14. Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. Biochemical and genetic peculiarities and the phylogenetic relationship of the non-main subspecies in the general scheme of the plague agent evolution. Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 954(1):45-51.
15. Garcia E., Worsham P., Bearden S., Malfatti S., Lang D., Larimer
F., Lindler L., Chain P. Pestoides F, an atypical Yersinia pestis strain from the former Soviet Union. Adv. Exp. Med. Res. 2007; 603:17-22.
16. Li Y., Cui Y., Hauck Y., Platonov M.E., Dai E., Song Y., Guo Z., Pourcel C., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P., Yang R., Vergnaud G. Genotyping and phylogenetic analysis of Yersinia pestis by MLVA: insights into the worldwide expansion of Central Asia plague foci. PLoS ONE. 2009; 4(6):e6000.
17. Morelli G., Song Y., Mazzoni C.J., Eppinger M., Roumagnac P., Wagner D.M., Feldkamp M., Kusecek B., Vogler A.J., Li Y., Cui Y., Thomson N.R., Jombart T., Leblois R., Lichtner P., Rahalison L., Petersen J.M., Balloux F., Keim P., Wirth T., Ravel J., Yang R., Carniel E., Achtman M. Yersinia pestis
eenome sequencing identifies patterns of global phylogenetic diversity. Nat. renet. 2010; 42(12):1140-3.
18. Wagner D.M., Klunk J., Harbeck M., Devault A., Waglechner N., Sahl J.W., Enk J., Birdsell D.N., Kuch M., Lumibao C., Poinar D., Pearson T., Fourment M., Golding B., Rheim J.M., Earn D.J., Dewitte S., Rouillard J.M., Grupe G., Wiechmann I., Bliska J.B., Keim P.S., Scholz H.C., Holmes E.C., Poinar H. Yersinia pestis and the Plague of Justinian 541-543 AD: a genomic analysis. Lancet Infect. Dis. 2014; 14(4):319-26.
19. Zhou D., Tong Z., Song Y., Han Y., Pei D., Pang X., Zhai J., Li M., Cui B., Qi Z., Jin L., Dai R., Du Z., Wang J., Guo Z., Wang J., Huang P., Yanget E. Genetics of metabolic variations between Yersinia pestis biovars and proposal of a new biovar, microtus. J. Bacteriol. 2004; 186(15):5147-62.
Authors:
Eroshenko G.A., Krasnov Ya.M., Nosov N.Yu., Kukleva L.M., Nikiforov K.A., Oglodin E.G., Kutyrev V.V. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru
об авторах:
Ерошенко Г.А., Краснов Я.М., Носов Н.Ю., Куклева Л.М., Никифоров К.А., Оглодин Е.Г., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Поступила 30.11.15.
