CC BY
25
УДК 616-036.22
Л.М.Куклева, Г.Н.Одиноков, Н.Ю.Шавина, Г.А.Ерошенко, В.В.Кутырев
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПИТАТЕЛЬНЫХ ПОТРЕБНОСТЕЙ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS ОСНОВНОГО И НЕОСНОВНЫХ ПОДВИДОВ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРИЧИНЫ ИХ АУКСОТРОФНОСТИ
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов,
Российская Федерация
Проведено изучение потребностей в факторах роста у 185 штаммов возбудителя чумы основного и неосновных (алтайского, кавказского, гиссарского и улегейского) подвидов, выделенных в 38 природных очагах чумы России и сопредельных государств. Установлено, что все штаммы основного подвида Yersinia pestis проявляют одинаковую зависимость в росте от трех аминокислот - метионина, фенилаланина, треонина, а штаммы из некоторых природных очагов дополнительно нуждаются в цистеине, лейцине и аргинине. Штаммы неосновных подвидов отличаются по питательным потребностям от штаммов основного подвида и между собой. Штаммы кавказского подвида нуждаются в тиамине, а также в аминокислотах - фенилаланине, тирозине и аргинине, штаммы алтайского подвида - в фенилаланине, аргинине и лейцине, гиссарского - в фенилаланине, лейцине, аргинине и метионине, а улегейского - в фенилаланине. Определен ряд мутаций, являющихся причиной ауксотрофности штаммов Y. pestis разных подвидов.
Ключевые слова: возбудитель чумы, факторы роста, ауксотрофность.
L.M.Kukleva, G.N.Odinokov, N.Yu.Shavina, G.A.Eroshenko, V.V.Kutyrev
Comparative Analysis of the Nutrient Requirements among Yersinia pestis Strains of the Main and Non-Main Subspecies as well as Genetic Causes of Their Auxotrophy
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov, Russian Federation
Studied is the nutrient demand for growth factors among 185 Yersinia pestis strains of the main and non-main subspecies (al-taica, caucasica, hissarica, and ulegeica) isolated in 38 natural plague foci of Russia and neighboring states. Revealed is the fact that all the strains of Yersinia pestis main subspecies manifest equal dependence in growth on three amino-acids such as methionine, phenylalanine, and threonine, while strains isolated from certain natural foci have an additional demand for cysteine, leucine, and arginine. Strains of non-main subspecies differ in their nutrient requirements both from the strains of the main subspecies and among themselves. Strains of subspecies caucasica stand in need of thiamine and such amino-acids as phenylalanine, tyrosine and arginine; subspecies altaica - phenylalanine, arginine and leucine; subspecies hissarica - phenylalanine, leucine and methionine; ulegeica -
phenylalanine. Detected is a number of mutations that lead to Key words: plague agent, growth factors, auxotrophy.
Эволюционный процесс становления вида Yersinia pestis сопровождался целым комплексом генетических событий, в том числе приобретением нового генетического материала за счет горизонтального переноса, и утратой функций некоторых генов [11, 12]. Освоение богатых питательными ресурсами условий - организмов млекопитающего и насекомого, а также переход к облигатному паразитизму привели к потере у возбудителя чумы функций некоторых ферментных систем метаболического обмена, что определило потребность Y. pestis в дополнительных факторах роста. Возбудитель чумы не может развиваться при отсутствии в среде ряда органических соединений, в первую очередь аминокислот, являясь природным ауксотрофом.
Изучению питательных потребностей возбудителя чумы посвящено большое количество исследований [1, 9, 14]. Установлено, что штаммы из различных природных очагов чумы отличаются по зависимости от некоторых факторов роста [7, 10, 14]. Однако имеющиеся в литературе сведения о питательных потреб-
auxotrophy in Yersinia pestis strains of different subspecies.
ностях штаммов Y. pestis из различных природных очагов недостаточно полны и противоречивы.
Между тем потребности в факторах роста штаммов возбудителя чумы могут служить дополнительной характеристикой Y. pestis из отдельных природных очагов. Такие данные могут быть использованы для дифференциации штаммов по очаговой принадлежности, а выяснение генетических причин ауксо-трофности создаст предпосылки для установления тех этапов эволюции вида, на которых была приобретена та или иная мутация.
Целью настоящей работы был сравнительный анализ питательных потребностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов различного происхождения.
Материалы и методы
В работе использовано 185 штаммов Y pestis основного (133) и неосновных (52) (алтайского, кавказского, гиссарского и улегейского) подвидов, изоли-
зз
рованных в природных очагах чумы России и сопредельных государств (таблица). Штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий, где они хранились в лиофильно высушенном состоянии. Исследованные штаммы Y. pestis относились к античному и средневековому биоварам основного подвида. Определение питательных потребностей штаммов проводили по способу, предложенному R.Brubaker [13], с некоторыми модификациями [6]. Условия постановки ПЦР и секвенирования описаны ранее [5, 6].
Результаты и обсуждение
Питательные потребности штаммов основного подвида Y pestis. Питательные потребности в отдельных факторах роста были изучены у 133 штаммов Y pestis, представляющих 38 природных очагов чумы различного ландшафтно-географического типа России, других стран СНГ и Монголии.
При культивировании штаммов основного подвида Y. pestis на искусственных питательных средах с различным составом аминокислот были выявлены некоторые общие закономерности проявления потребностей в факторах роста у штаммов возбудителя чумы. Так, общим свойством для всех штаммов основного подвида возбудителя чумы, независимо от их биоварной и очаговой принадлежности, является зависимость по фенилаланину, метионину и треонину (таблица), что, по-видимому, свидетельствует о наличии повреждений структурно-функциональной
целостности генов, участвующих в биосинтезе этих аминокислот.
Анализ полученных данных позволил выявить особенности проявления зависимости от различных факторов роста у штаммов из отдельных очагов или их групп.
Штаммы античного биовара (27 штаммов), циркулирующие в высокогорных очагах Киргизии (Сарыджасский, Верхненарынский, Аксайский и Алайский), помимо потребности в фенилаланине, метионине и треонине, проявляют дополнительную зависимость роста от лейцина (Аксайский и Сарыджасский природные очаги) или цистеина (Верхненарынский и Алайский очаги).
Штаммы средневекового биовара, распространенные в большинстве очагов чумы на территории России и сопредельных государств, также зависят от наличия в среде фенилаланина, метионина и треонина. Однако, помимо этих общих потребностей, были выявлены потребности в других факторах роста.
Так, для всех изученных штаммов У. pestis из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы характерна общая для всего основного подвида ауксо-трофность по метионину, фенилаланину и треонину. Однако в левобережье р. Баксан в Верхне-Кубанском и Кубано-Малкинском районах выделяют штаммы с дополнительной зависимостью от пролина, как это описывали другие авторы [10]. Такой тип питательных потребностей не встречается у штаммов У. pestis из других природных очагов чумы.
Питательные потребности штаммов основного подвида возбудителя чумы из природных очагов с различной ландшафтно-географической принадлежностью
Тип очага Биовар циркулирующих штаммов Название очага (кол-во изученных штаммов) Питательные потребности (помимо фенилаланина, метионина и треонина)
Высокогорный Античный Сарыджасский (4) Лейцин, цистеин
Верхненарынский (3) Алайский (4) Цистеин
Аксайский (16) Лейцин
Средневековый Центрально-Кавказский (8) *
Горный Средневековый Тувинский (4) Цистеин
Равнинно-предгорный Средневековый Бозчельский (1) Кобыстанский (4) Мильско-Карабахский (1) Дагестанский (3) Цистеин, аргинин
Джейранчельский (3) Лейцин
Низкогорный Средневековый Приараксинский (3) Цистеин
Степной Средневековый Прикаспийский Северо-западный (4) Волго-Уральский (7) Зауральский (3) Лейцин, цистеин
Античный Забайкальский (3) Лейцин, цистеин
Песчаный Средневековый Прикаспийский (15) Волго-Уральский (6) Лейцин
Пустынный Средневековый Предустюртский (2) Мангышлакский (3) Лейцин, цистеин
Устюртский (3) Кызылкумский (5) Лейцин
Урало-Эмбенский (6) Северо-Приаральский (3) Муюнкумский (3) Таукумский (2) Прибалхашский (3) Цистеин
Приаральско-Каракумский (3) -
Каракумский (3) -
*В Верхне-Кубанском и Кубано-Малкинском районах очага циркулируют штаммы, зависимые от пролина.
З4
Штаммы из Приараксинского низкогорного (3) и Тувинского горного (4) очагов проявляют дополнительную зависимость роста от присутствия в среде цистеина. Для штаммов Y. pestis, циркулирующих в равнинно-предгорных (9 штаммов) (Бозчельский, Кобыстанский, Мильско-Карабахский, Дагестанский) очагах чумы, характерно наличие дополнительных потребностей в ци-стеине и аргинине. Кроме того, отдельные штаммы из Джейранчельского равнинно-предгорного очага не способны синтезировать лейцин.
Подавляющее большинство штаммов, циркулирующих в степных (Северо-Западный Прикаспийский, Волго-Уральский, Зауральский) и песчаных очагах чумы (Прикаспийский и ВолгоУральский) имеют общую для всего вида Y pestis зависимость от фенилаланина, метионина и треонина. Между тем в этих очагах были выявлены отдельные штаммы, ауксотрофные по лейцину и цистеину, либо по одной из этих аминокислот. Особый интерес представляют штаммы из Забайкальского степного очага чумы, где циркулируют штаммы античного биовара, несмотря на то, что в середине прошлого века там произошла смена основного носителя [1]. Штаммы из этого очага для роста на искусственных средах, помимо фенилаланина, метионина и треонина, нуждаются в цистеине. В изученной коллекции присутствуют отдельные штаммы, зависящие от лейцина.
Для всех штаммов из пустынных очагов Средней Азии - Предустюртский, Устюртский, Северо-При-аральский, Урало-Эмбенский, Мангышлакский, Приаральско-Каракумский, Каракумский, Кызылкумский, Муюнкумский, Таукумский, Прибалхашский -отмечена общая для всего основного подвида Y pestis зависимость от фенилаланина, метионина и треонина. Кроме того, штаммы из Северо-Приаральского, Муюнкумского, Таукумского, Урало-Эмбенского и Прибалхашского природных очагов чумы дополнительно нуждаются в цистеине. Отдельные штаммы
Y pestis из Устюртского и Кызылкумского природных очагов чумы ауксотрофны по лейцину. Изоляты из Мангышлакского и Предустюртского очагов не способны самостоятельно синтезировать цистеин и лейцин.
Штаммы из Приаральско-Каракумского и Каракумского пустынных очагов не имеют дополнительных потребностей, помимо фенилаланина, метионина и треонина.
Питательные потребности штаммов неосновных подвидов Y pestis. Далее нами были изучены потребности в факторах роста у 52 штаммов неосновных подвидов Y pestis.
Кавказский подвид. В результате изучения питательных потребностей у 21 штамма кавказского подвида возбудителя чумы, выделенного в горных очагах Закавказья, установлено, что их уникальной особенностью, отличающей от других подвидов, является потребность в тиамине. Кроме того, все штаммы кавказского подвида нуждаются в фенилаланине, тирозине и аргинине. В отличие от штаммов из Ленинаканского,
Присеванского и Зангезуро-Карабахского очагов чумы, зависимых только от этих четырех факторов роста, штаммы из Восточно-Кавказского высокогорного очага нуждаются в лейцине.
Гиссарский подвид. Потребности в дополнительных факторах роста были изучены у 11 штаммов
Y pestis ssp. hissarica, выделенных в Гиссарском высокогорном очаге чумы. Все изученные штаммы обладают одинаковыми питательными потребностями и неспособны самостоятельно синтезировать четыре аминокислоты - фенилаланин, лейцин, аргинин и метионин.
Алтайский подвид. Была изучена коллекция из 14 штаммов Y pestis ssp. altaica, изолированных в Алтайском горном очаге чумы и в Монголии. Установлено, что все изученные штаммы были неспособны самостоятельно синтезировать фенилаланин, аргинин и лейцин.
Улегейский подвид. При изучении питательных потребностей 6 штаммов улегейского подвида, изолированных на территории Южно-Гобийского и Убур-Хангайского аймаков Монголии, установлена их ауксотрофность по фенилаланину.
Далее нами были предприняты исследования по выяснению генетических причин зависимости штаммов Y pestis от некоторых факторов роста. В результате секвенирования вариабельного локуса гена metB установлено, что ауксотрофность по метионину у штаммов основного и гиссарского подвидов вызвана различными причинами. Зависимость от метионина у штаммов основного подвида обусловлена наличием делеции единичного нуклеотида (-G) в позиции 988 от начала гена metB, а у гиссарского подвида - ин-серцией единичного нуклеотида (+G) в позиции 989 этого же гена. Нами также определены генетические основы ауксотрофности штаммов кавказского подвида. Показано наличие у всех штаммов этого подвида идентичных мутаций в генах argA (инсерция IS100 после 196 нуклеотида), aroG (вставка 10 п.н. в позиции 820-829), aroF (вставка IS100 после 888 нуклеотида), thiH (вставка тимина в позиции 552) и thiG (делеция 13 п.н. в позиции 384-396). Выявленные мутации являются причиной отсутствия у штаммов кавказского подвида способности синтезировать аргинин, фенилаланин, тирозин и витамин В1 (тиамин).
Таким образом, проведенный анализ зависимости от факторов роста штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов позволил выявить некоторые общие закономерности в распределении питательных потребностей у этих штаммов. Незаменимыми аминокислотами для всех изученных штаммов основного подвида, независимо от принадлежности к биовару (античный или средневековый) и природному очагу, являются метионин, фенилаланин и треонин. Ауксотрофность по фенилаланину характерна для всех изученных штаммов Y pestis основного и неосновных подвидов, что позволяет предположить появление мутации, приведшей к зависимости от этой аминокислоты, на ранних этапах эволюции
Y pestis. У штаммов основного и гиссарского подви-
дов возбудителя чумы выявлена зависимость от метионина, вызванная двумя различными мутациями в гене metB оперона синтеза метионина. Отдельные штаммы основного подвида Y. pestis проявляют зависимость в цистеине и лейцине.
Полученные данные не противоречат имеющимся в литературе сведениям о необходимости для роста возбудителя чумы таких аминокислот как метионин, фенилаланин и треонин [2, 9, 10]. Наличие отдельных штаммов, неспособных самостоятельно синтезировать лейцин, описано для высокогорных очагов Средней Азии и песчаных очагов Прикаспия [3, 4, 14]. Уникальные питательные потребности штаммов неосновных подвидов отмечены в ряде исследований [1, 8, 9].
В то же время полученные результаты не во всем совпадают с литературными данными. Так, нами не выявлено универсальной зависимости штаммов Y pes-tis основного подвида от цистеина, который многими авторами рассматривается как необходимый фактор роста возбудителя чумы [1, 9]. Однако существует мнение, что потребность в цистеине при 28 °С проявляется не всегда [4]. Следует отметить, что возбудитель чумы при выращивании в условиях 28 °С нуждается в ограниченном количестве аминокислот - фенилаланине, метионине, треонине, цистеине, лейцине, аргинине. Уникальными факторами роста являются пролин (часть штаммов из Центрально-Кавказского очага) и тиамин (штаммы кавказского подвида).
Таким образом, полученные данные позволяют дополнить характеристику штаммов возбудителя чумы из отдельных природных очагов. Дальнейшие исследования в направлении выяснения генетических причин ауксотрофности штаммов возбудителя чумы позволят дополнить молекулярную характеристику штаммов из отдельных очагов, что может быть использовано в системе молекулярного типирования штаммов Y. pestis из природных очагов чумы России и зарубежных стран, а также учтено при культивировании штаммов на искусственных питательных средах.
Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований 12-04-31098.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы. Иркутск; 1989. 90 с.
2. Аракелян И.С., Мартиневский И.Л. О характере и частоте появления обратных мутаций у штаммов чумного микроба, выделенных в разных природных очагах. Профилакт. особо опасных инф. Алма-Ата; 1981. С. 12-8.
3. Майканов Н.С., Гражданов А.К. Биологические свойства популяции возбудителя чумы из Волго-Уральского песчаного очага. Карантинные и зоонозные инф. в Казахстане. Алматы, 2001; 4:210-12.
4. Мартиневский И.Л., Хакимов М.Н., Хайдаров Т.Б., Аракелян И.С., Атчабаров Б.Б., Белобородова С.В., Витрищак Т.П. О штаммах чумного микроба из Кызылкумов с пониженной потребностью в факторах роста. В кн.: Биохимия, патофизиология и микробиология особо опасных инфекций. Саратов; 1983. С. 15-8.
5. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Краснов Я.М., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Павлова А.И., Кутырев В.В. Генетические основы метионинзависимости штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов. Генетика. 2011; 47(3):332-8.
6. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Краснов Я.М., Кутырев В.В. Определение генетических
основ ауксотрофности штаммов Yersinia pestis кавказского подвида. Генетика. 2012; 48(4):457-64.
7. Пейсахис Л.А., Степанов В.М. Некоторые итоги изучения потребностей в факторах роста штаммов возбудителя чумы. Пробл. особо опасных инф. 1978; 5(63):13-6.
8. РозановаГ.Н., ГрамотинаЛ.И., СучковЮ.Г., Лалазарова И.Г., Шехикян М.Т., Матевосян Л.Ш., Джафаров Н.И., Абдурахманов Г.А., Земельман Б.М. Питательные потребности возбудителя чумы из очагов полевочьего типа. В кн.: Селекция и генетика возбудителей особо опасных инфекций. Саратов; 1982. С. 73-6.
9. Султанов Г.В., Козлов М.П. Чума: микробиология, патогенез, диагностика. Махачкала; 1995. 146 с.
10. Сучков Ю.Г., Розанова Г.Н., Елкин Ю.М., Грамотина Л.И. Естественная генетическая маркировка штаммов чумного микроба из природных очагов Кавказа. Пробл. природной очаговости чумы. Иркутск, 1980; 2:35-7.
11.AchtmanM. Insights from genomic comparisons ofgeneti-cally monomorphic bacterial pathogens. Philos. Trans. R. Soc. B. Biol. Sci. 2012; 367(1590):860-7.
12. Bearden S.W., Brubaker R.R. Recent findings regarding maintenance of enzootic variants of Yersinia pestis in sylvatic reservoirs and their significance in the evolution of epidemic plague. Vector Borne Zoonotic. Dis. 2010; 10(1):85-92.
13. BrubakerR. Interconversion of Purine Mononucleotides in Pasteurella pestis. Infect. Immun. 1970; 1(5):446-54.
14. Martinevskiy I.L., Atshabar B.B., Aikimbaev A.M. The results of vany years study of the requirement in growth factors of the different Yersinia pestis strains and their significance in the investigation of the natural plague foci. Chinese journal of control of endemic disease. 1999; 14:79-80.
References
1. Aparin G.P., Golubinsky E.P. [Microbiology of Plague]. Irkutsk; 1989. 90 p.
2. Arakelyan I.S., Martinevsky I.L. [Concerning the character and regularity of occurrence of reverse mutations among the strains of plague agent isolated in various natural foci]. Profilakt. Osobo Opasn. Infek. Alma-Ata; 1981. P. 12-8.
3. Maykanov N.S., Grazhdanov A.K. [Biological properties of plague agent population in the Volga-Ural sand foci]. Karant. Zoonoz. Infek. v Kazakhstane. Almaty, 2001; 4:210-12.
4. Martinevsky I.L., Khakimov M.N., Khaydarov T.B., Arakelyan I.S., Atchabarov B.B., Beloborodova S.V, Vitrishchak T.P. [Regarding the strains of plague agent isolated in Kyzylkum, possessing decreased demand for growth factors]. In: [Biochemistry, Pathophysiology, and Microbiology of Particularly Dangerous Infections]. Saratov; 1983. P. 15-8.
5. Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Krasnov Ya.M., Kukleva L.M., Shavina N.Yu., Pavlova A.I., Kutyrev V.V. [Genetic grounds of methionine-
dependence in Yersinia pestis strains of the main and non-main subspecies]. Genetika. 2011; 47, 3:332-8.
6. Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Kukleva L.M., Shavina N.Yu., Krasnov Ya.M., Kutyrev V.V. [Determination of the genetic grounds of auxotroph in Yersinia pestis ssp. caucasica strains]. Genetika. 2011; 48(4): 457-64.
7. Peysakhis L.A., Stepanov V.M. [Results of the investigations as regards demand for growth factors in plague agent strains]. Probl. Osobo. Opasn. Infek. 1978; (63):13-6.
8. Rozanova G.N., Gramotina L.I., Suchkov Yu.G., Lalazarova I.G., Shekhikyan M.T., Matevosyan L.Sh., Dzhafarov N.I., Abdurakhmanov G.A., Zemel’man B.M. [Nutrient requirement of the plague agent from the vole type foci]. In: [Selection and Genetics of Particularly Dangerous Infections]. Saratov; 1982. P. 73-6.
9. Sultanov G.V., Kozlov M.P. [Plague: Microbiology, Pathogenesis, Diagnostics]. Makhachkala; 1995. 146 p.
10. Suchkov Yu.G., Rozanova G.N., Elkin Yu.M., GramotinaL.I. [Natural genetic marking of the plague agent strains from natural foci in the territory of Caucasus]. Probl. Prirod. Ochagov. Chumy. Irkutsk, 1980; 2:35-7.
11. Achtman M. Insights from genomic comparisons of genetically monomorphic bacterial pathogens. Philos. Trans. R. Soc. B. Biol. Sci. 2012; 367(1590):860-7.
12. Bearden S.W., Brubaker R.R. Recent findings regarding maintenance of enzootic variants of Yersinia pestis in sylvatic reservoirs and their significance in the evolution of epidemic plague. Vector Borne Zoonotic. Dis. 2010; 10(1):85-92.
13. Brubaker R. Interconversion of Purine Mononucleotides in Pasteurella pestis. Infect. Immun. 1970; 1(5):446-54.
14. Martinevskiy I.L., Atshabar B.B., Aikimbaev A.M. The results of vany years study of the requirement in growth factors of the different Yersinia pestis strains and their significance in the investigation of the natural plague foci. Chinese journal of control of endemic disease. 1999; 14:79-80.
Authors:
Kukleva L.M., Odinokov G.N., Shavina N.Yu., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: [email protected]
Об авторах:
Куклева Л.М., Одиноков Г.Н., Шавина Н.Ю., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected]
Поступила 02.11.12.
