CC BY
18
УДК 576.8:538.56
Г.А.Ерошенко, Г.Н.Одиноков, Я.М.Краснов,
Н.П.Гусева, В.В.Кутырев
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГЕНОВ ASPA У ШТАММОВ YERSINIA PESTIS ОСНОВНОГО И НЕОСНОВНЫХ подвидов
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Показана вариабельность нуклеотидной последовательности гена aspA у штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов, выделенных в Российской Федерации и ближнем зарубежье. У штаммов алтайского и гиссарского подвидов, также как и у штаммов Yersinia pseudotuberculosis, в позиции 363 белка AspA находится аминокислота валин. У штаммов кавказского и улегейского подвидов в этой позиции присутствует серин, а у штаммов основного подвида - лейцин. Вариабельность гена aspA может быть использована для генотипирования штаммов возбудителя чумы.
Ключевые слова: возбудитель чумы, вариабельность нуклеотидных последовательностей генов, аспартаза, ге-нотипирование штаммов.
В настоящее время для создания эффективной системы молекулярного типирования возбудителя чумы, использование которой позволит с высокой достоверностью определять происхождение штамма и его принадлежность к одному из пяти подвидов Y. pestis (отличающихся по вирулентности), проводится поиск вариабельных ДНК-локусов в геноме этого возбудителя. Ранее нами была показана перспективность применения для этих целей хромосомных генов rhaS и araC, контролирующих ферментацию моносахаридов рамнозы и арабинозы [1, 2]. Недавно зарубежными исследователями у ряда штаммов Y. pestis выявлена вариабельность нуклеотидной последовательности гена aspA, кодирующего биосинтез аспартат-аммониумлиазы (синоним аспартаза) - AspA [3, 6]. Белок AspA катализирует дезаминирование L-аспартата с образованием фума-рата - компонента цикла трикарбоновых кислот [3].
Целью этой работы было изучение вариабельности нуклеотидной последовательности гена aspA у штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов, выделенных в Российской Федерации, других странах СНГ и Монголии, для установления возможности использования aspA в системе муль-тилокусного секвенирования штаммов возбудителя чумы разного происхождения. Всего исследовано 19 штаммов Y. pestis основного (3 штамма), алтайского (4), кавказского (4), улэгейского (4) и гиссарско-го (4) подвидов, изолированных в природных очагах России и ближнего зарубежья (таблица). Штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб». Кроме того, с помощью алгоритма BLAST проведен компьютерный анализ 7 штаммов Y. pestis: KIM (биовар medievalis), CO92 (биовар orientalis), Antiqua (биовар antiqua), Angola, Nepal516, 91001 (биовар microtus), Pestoides F (кавказский подвид) и 4 штаммов Y. pseudotuberculosis: PB1/+ (1 серовара), IP32953 (1 серовара), IP 31758 (1 серовара), YPIII (3 серовара), полные нуклеотидные последовательности геномов которых представлены
в базе данных NCBI GenBank. На основе сравнения последовательностей генов aspA у штаммов Y. pestis (GenBank) определен вариабельный локус гена aspA (в позиции 1087-1089 от начала гена) и рассчитаны олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие этот участок гена. Они имеют следующий состав: Asp 400S GAAGCGACCTCTGATTGC и Asp400As aAgTGACGATGCCTATGG. Амплификацию фрагмента гена aspA в ПЦР осуществляли по следующей схеме: 1 цикл 94 °С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 94 °С 45 с, 55 °С 1 мин, 72 °С 45 с и завершающий цикл 3 мин при 72 °С. Определение нуклеотидной последовательности полученных фрагментов aspA проводили по методу F.Sanger et al. с использованием прямых и обратных праймеров [5]. Выравнивание и сравнение нуклеотидных последовательностей осуществляли с использованием программ MEGA4. Полученные экспериментальные данные, а также результаты проведенного компьютерного анализа суммированы в таблице.
В результате сравнения полученных последовательностей фрагментов гена aspA установлено, что у штаммов алтайского (Y. pestis 4857, И-2998, И-3085, КМ1203) и гиссарского (Y. pestis А-1633, А-1730, А-1249, А-1728) подвидов в позиции 1087-1089 от начала гена aspA находится тот же триплет GTG, что и у штаммов Y. pseudotuberculosis, представленных в базе GenBank (таблица), который кодирует аминокислоту валин, расположенную в положении 363 в белке AspA. Таким образом, у штаммов алтайского и гиссарского подвидов в геноме присутствуют гены aspA «дикого» типа. В отличие от них у штаммов двух других подвидов - кавказского (Y pestis 3551, 376, 1470, 818) и улегейского (Y pestis И-3069, И-3131, И-2422, И-3071) в этой позиции гена aspA находится другой триплет - TCG, который кодирует аминокислоту серин. По данным S.W.Bearden et al. [3] замена аминокислотного остатка валина на серин не оказывает влияния на активность белка AspA. Еще у двух штаммов Y. pestis Angola и Nepal516 (GenBank) в позиции
Вариабельность нуклеотидной последовательности гена aspA у штаммов Y. pestis
Штамм Источник выделения Триплет в позиции 1087-1089 Аминокислотный остаток в позиции 363
Y. pestis основной п/в
А-1836 Серый сурок TTG Leu
А-161 Блохи большой песчанки « «
2638 Полуденная песчанка « «
Кавказский п/в
3551 Блохи гнезда обыкновенной полевки TCG Ser
376 Обыкновенная полевка « «
1470 Обыкновенная полевка « «
818 Блохи гнезда обыкновенной полевки « «
Улегейский п/в
И-3069 Полевка Брандта TCG Ser
И-3131 Монгольская пищуха « «
И-2422 Блохи монгольской пищухи « «
И-3071 Монгольская пищуха « «
Алтайский п/в
4857 Труп монгольской пищухи GTG Val
И-2998 Монгольская пищуха « «
И-3085 Полевка Брандта « «
КМ1203 Блохи монгольской пищухи « «
Гиссарский п/в
А-1633 Блохи арчевой полевки GTG Val
А-1730 Блохи гнезда арчевой полевки « «
А-1249 Арчевая полевка « «
А-1728 Арчевая полевка « «
Y. pestis, данные GenBank
KIM б/в medievalis TTG Leu
CO92 б/в orientalis TTG Leu
Antiqua б/в antiqua TTG Leu
Angola TTT Phe
Nepal516 TTT Phe
91001 б/в microtus GTG Val
Pestoides F кавказский п/в TCG Ser
Y. pseudotuberculosis, данные GenBank
PB1/+ GTG Val
IP 32953 GTG Val
IP 31758 GTG Val
YPIII GTG Val
363 находится аминокислота фенилаланин, наличие зе R.R.Brnbaker et al. [4], отсутствие активности фер-
которой в этом локусе приводит к снижению (но не мента аспартазы приводит к развитию острой фор-
потере) активности фермента аспартазы [3]. мы заболевания, вызываемой основным подвидом
У трех изученных нами штаммов основного Y pestis. Штаммы пестоидов (неосновных подвидов)
подвида (Ypestis А-1836, А-161 и 2638), а также у обладают сниженной вирулентностью из-за наличия
штаммов основного подвида, представленных в активного фермента - аспартазы [3, 4, 6].
GenBank в позиции 1087-1089 гена aspA находится Таким образом, нами показана вариабельность
триплет TTG, который кодирует аминокислоту лей- гена aspAу штаммов Y pestis основного и неосновных
цин (таблица). R.E.Viola et al. [6] показали, что нали- подвидов, выделенных на территории Российской
чие аминокислоты лейцина в позиции 363 аспарта- Федерации и ближнего зарубежья. Изменчивость позы является причиной отсутствия активности этого следовательности гена aspA в сочетании с вариабель-
фермента у штаммов основного подвида. По гипоте- ностью других генов, может быть использована для
проведения внутривидовой дифференциации возбудителя чумы, а наличие специфического триплета в позиции 1087-1089 гена aspA может служить генетической меткой штаммов Y. pestis разных подвидов.
Работа поддержана грантами РФФИ № 07-0400100, 08-04-00731 и 08-04-12082 ОФИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Одинокое Г.Н. и др.. Структурно-функциональный анализ гена araC у штаммов различного происхождения. Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 2009; (2):(в печати).
2. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Куклев В.Е. и др. Исследование вариабельности нуклеотидной последовательности генов rha локуса у штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов. Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 2008; 2:23-7.
3. Bearden S.W., Sexton C., Pare J. et al. Attenuated enzootic (pestiodes) isolates of Yersinia pestis express active aspartase. Microbiology. 2009; 155:198-209.
4. BrubakerR.R. Intermediary metabolism Na+, the low calcium response and acute disease. In: Perry R.D., editor. The genus Yersinia: from genomics to function. New York: Springer; 2007. P. 116-29
5. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977; 74:5463-7.
6. Viola R.E., Yerman L., Fowler J.M. et al. A missense mutation causes aspartase deficiency in Yersinia pestis. Microbiology. 2008; 154:1271-80.
Об авторах:
Ерошенко Г.А., Одинокое Г.Н., Краснов Я.М., ГусеваН.П., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. Тел. (845-2) 26-2131. E-mail: [email protected]
G.A.Eroshenko, G.N.Odinokov, Ya.M.Krasnov, N.P.Gooseva, V.V.Kutyrev
Variability of the aspA Genes in Yersinia pestis Strains of the Main and Non-Main Subspecies
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov
Demonstrated was variability of the aspA gene nucleotide sequence in Yersinia pestis strains of the main and non-main subspecies isolated in the Russian Federation and neighboring countries. Strains of altaica and hissarica subspecies, just as Yersinia pseudotuberculosis, possess valine in position 363 of the AspA protein. Strains of caucasica and ulegeica subspecies carry serine in this position, while strains of the main subspecies carry leucine. The aspA gene variability is thought to be applicable for genotyping of plague agent strains.
Key words: plague agent, gene nucleotide sequence variability, aspartase, genotyping of the strains.
Authors:
Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Krasnov Ya.M., Gooseva N.P., Kutyrev V.V. Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe”. 410005, Saratov, Universitetskaya St., 46. E-mail: [email protected]
nociynHHa 20.02.09.
