CC BY
22
УДК 616.918.453+616-002.71
Г.Н.Одиноков, Г.А.Ерошенко, В.В.Кутырев
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ГЕНА INV У ШТАММОВ ЧУМНОГО И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБОВ
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
У чумного микроба основного и неосновных подвидов и у псевдотуберкулезного проведен структурнофункциональный анализ гена inv, кодирующего один из важных факторов патогенности возбудителя псевдотуберкулеза. Показано, что структура гена inv у всех изученных штаммов неосновных подвидов так же, как и у основного подвида Yersinia pestis, нарушена внедрением инсерционной последовательности IS1541, что свидетельствует о потере функциональной активности этого гена на ранних стадиях эволюции возбудителя чумы.
Ключевые слова: возбудители чумы и псевдотуберкулеза, фактор инвазии и адгезии, ген, мутация.
Возбудитель чумы ведет свое происхождение от псевдотуберкулезного микроба, с которым имеет высокий процент идентичности нуклеотидной последовательности гомологичных генов (97-99 %) [5]. Однако ряд генов, присутствующих в геноме Yersinia pseudotuberculosis в интактной форме, у Y pestis существует в виде так называемых «молчащих», или псевдогенов, что является результатом адаптации чумного микроба к облигатному паразитизму [2].
От псевдотуберкулезного микроба возбудитель чумы получил ряд генетических детерминант факторов вирулентности, среди которых гены inv и yadA, играющие важную роль при энтеропатогенной инфекции, вызываемой Y. pseudotuberculosis [3, 4]. Кодируемый геном inv белок внешней мембраны ин-вазин (Inv) взаимодействует с у^-интегрином М-клеток пейеровых бляшек подвздошной кишки, обеспечивая колонизацию и инвазию возбудителем слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта [1, 6].
По данным проведенного нами сравнительного компьютерного анализа, ген inv у всех штаммов Y. pestis основного подвида, представленных в базе данных NCBI GenBank, инактивирован вставкой IS-элемента, что предполагает нарушение его функциональной активности. Однако остается не ясным, сохранилась ли структурная целостность гена inv у неосновных подвидов возбудителя чумы, занимающих эволюционно более близкое положение к возбудителю пседотуберкулеза. Данные по этому вопросу в литературе отсутствуют, как и данные о структуре этого гена у штаммов основного подвида, циркулирующих на территории РФ и сопредельных государств. В связи с этим целью нашего исследования было изучение особенностей структурной организации гена inv у штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов различного происхождения в сравнении со штаммами псевдотуберкулезного микроба.
Результаты и обсуждение
В начале исследований был проведен сравнительный компьютерный анализ нуклеотидной последовательности хромосомного локуса, содержащего
ген inv у штаммов Y pestis KIM (биовар medievalis), CO92 (биовар orientalis), Antiqua, Nepal516 (биовар antiqua), 91001 (биовар microtus), Pestoides F (кавказский подвид) и Y. pseudotuberculosis PB1/+, IP 32953, IP 31758, YPIII, представленных в базе данных NCBI GenBank. В результате было установлено, что размер гена inv у псевдотуберкулезного микроба составляет 2963 п.н. В отличие от него ген inv у штаммов Y. pestis имеет гораздо больший размер - 3669 п.н., что свидетельствует о внедрении инсерционной последовательности и его инактивации.
Обработка полученных результатов с использованием программного обеспечения NCBI BLAST показала, что инактивация гена inv у возбудителя чумы происходит за счет вставки инсерционной последовательности IS1541 (708 п.н.) после 906 п.н. (302 кодона). С помощью программы Primer Express нами была рассчитана пара праймеров: inv839 (TACCTGCACTCCCACAAC) - inv1007 (CCCATACGCTGATCTACC), фланкирующая область вставки IS1541 (рис. 1). Амплификацию фрагмента гена inv в ПЦР осуществляли по следующей схеме: 1 цикл 94 °С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 94 °С 45 с, 56 °С 1 мин, 72 °С 45 с и завершающий цикл 3 мин при 72 °С. Синтез олигонуклеотид-ных праймеров, проводили на автоматическом синтезаторе ДНК АСМ-800 (Биосет, Россия) в РосНИПЧИ «Микроб».
Для изучения структуры гена inv у основного и неосновных подвидов Y. pestis нами было использовано 18 штаммов, циркулирующих в природных очагах СНГ и Монголии. Основной подвид был представлен 5 штаммами из Устюртского, Тувинского, Сарыджазского, Забайкальского и Приараксинского очагов чумы (таблица). Неосновные подвиды включали 13 штаммов, в том числе 3 изо-лята кавказского (Присеванский, Ленинаканский, Приараксинский очаги Кавказа и Закавказья), 3 - алтайского (Алтайский горный очаг), 3 - гиссарского (Гиссарский высокогорный очаг), 2 - улэгейского (Монголия) подвидов чумного микроба и 2 штамма из Таласского (Киргизия) высокогорного очага чумы (таблица). Кроме того, было изучено 12 штаммов
Ypestis (711 п.н.)
is; 54J
906 п.н. invl007
--------------------
inv839
ш(2963 п.н.)
У.рзешк>ШЬегси1ож
Рис. 1. Структура гена inv и место вставки 151541 у чумного микроба. Стрелками указаны места посадки использованных праймеров шу839-шу1007
У pseudotuberculosis, представленных в коллекциях Таля и Молляре, а также выделенных на территории Дальнего Востока и Туркмении (таблица). Штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», где они хранились в лиофильно высушенном состоянии.
У всех использованных в работе штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов проведено изучение гена П с использованием рассчитанной нами пары праймеров шу839-шу1007. В ПЦР-анализе размер амплификата у всех штаммов У. pseudotuberculo-
Рис. 2. ПЦР-анализ гена П у штаммов возбудителя чумы и псевдотуберкулеза: 1-9,11 - Т. pseudotuberculosis: V, 68(48), VI, IV, 110 (VI), 417, 67/16, 312, 69(32), 70(25); 12-13 - основной подвид: А-161, И-1270; 14-15 - кавказский подвид: 376, 3551; 16-17 гиссарский подвид: А-1728, А-1633;
18 - алтайский подвид: 4857; 19 - улегейский подвид: И-3069; 20 - таласская группа: А-1807; 10 - маркер молекулярных масс ^епЯи!ег ТМ 50 Ьр)
sis (рис. 2, дорожки i-9, ii) составлял ^9 п.н., что соответствовало размеру фрагмента, образуемого у интактного гена. Фрагменты гена inv у штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов имели большую молекулярную массу (S77 п.н.), что свидетельствовало о наличии вставки IS1541 (рис. 2, дорожки i2-2G).
Штаммы Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, использованные в работе
Штаммы, серовары Время и место (очаг) выделения Источник выделения
У. рввив
Основной п/в
А-161 1962 г., Устюртский пустынный Блохи с большой песчанки
И-2638 1977 г., Тувинский горный Вши с даурского суслика
А-1836 1983 г., Сарыджазский высокогорный Серый сурок
И-1270 1966 г., Забайкальский степной Даурский суслик
805 1968 г., Приараксинский низкогорный Песчанки Виноградова
Кавказский п/в
376 Ленинаканский горный Общественная полевка
3551 1979 г., Присеванский горный Блохи обыкновенной полевки
818 1968 г., Приараксинский низкогорный Блохи обыкновенной полевки
Улэгейский п/в
И-3131 1984 г., Южно-Габийский аймак, МНР Монгольская пищуха
И-3069 1982 г., Убурхангай, МНР Полевка Брандта
Алтайский п/в
КМ1205 1993 г., Алтайский горный Монгольская пищуха
4857 1965 г., Алтайский горный Труп пищухи
И-2359 1973 г., Алтайский горный Блохи гнезда монгольской пищухи
Гиссарский п/в
А-1728 1972 г., Гиссарский высокогорный Арчовая полевка
А-1730 1970 г., Гиссарский высокогорный Блохи гнезда арчовой полевки
А-1633 1970 г., Гиссарский высокогорный Блохи арчовой полевки
Таласская гр.
А-1815 Таласский высокогорный Сега^ркуЫт сазртз
А-1807 Таласский высокогорный У pseudotuberculosis Сега^ркуЫт сазртз
312 1973 г., Дальний восток Человек
417 1976 г., холмогорье Бадхыз (Туркмения) Краснохвостая песчанка
б8(48), iiG(VI), б7Лб, б9(32), 7G(25) II, III, IV, V, VI
Коллекция Таля Коллекция Молляре
5i
Таким образом, с применением пары праймеров inv839-inv1007 в ПЦР-анализе нам удалось установить присутствие вставки IS1541 в гене inv у высоковирулентных штаммов основного, а также у неосновных подвидов Y pestis, циркулирующих в природных очагах на территории РФ и сопредельных государств. По-видимому, отсутствие необходимости колонизировать слизистую кишечника при новом механизме развития инфекционного процесса привело к инактивации гена inv у чумного микроба. Обнаружение гена inv в состоянии псевдогена уже у более древних неосновных подвидов, занимающих промежуточное положение между псевдотуберкулезным микробом и основным подвидом возбудителя чумы, свидетельствует о потере его функционального значения на ранних этапах эволюции вида Y. pestis.
Работа поддержана грантами РФФИ № 07-0400100, 08-04-00731 и 08-04-12082 офи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Каратаев Г.М., Марков А.Р., Синяшина Л.Н. и др. Сравнительное изучение роли yadA, invA и psaA-генов в патогенности Yersiniapseudotuberculosis. Мол. генет. 2008; 4:10- 8.
2. КуклеваЛ.М., Проценко О.А., КутыревВ.В. Современные представления о родстве возбудителей чумы и псевдотуберкулеза. Мол. генет. 2002; 1:3-7.
3. Хабаров А.В., Кутырев В.В. Характеристика инвазивных свойств возбудителей чумы и псевдотуберкулеза в отношении морских свинок и белых мышей. В кн.: Эпидемиол., микроби-ол. и иммунол. бактериальных и вирусных инфекций: Тез. докл. обл. науч. конф. молодых ученых; 17-20 октября 1989; Ростов-на-Дону. Ростов н/Д; 1989. С. 51-3.
4. HoiczykE., RoggenkampA.,ReichenbecherM. etal. Structure
and sequence analysis of Yersinia YadA and Moraxella UspAs reveal a novel class of adhesions. eMbO. 2000; 19:5989-99.
5. Parkhill J., Wren B.W., Thomson N.R. et al. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague. Nature. 2001; 413:523-7.
6. Simonet M., Riot B., Fortineau N. et al. Invasin production by Yersinia pestis is abolished by insertion of an IS200-like element within the inv gene. Infect. Immun. 1996; 64:375-9.
Об авторах:
Одинокое Г.Н., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В. Российской научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, Университетская, 46. Тел.: (845-2) 26-21-31. E-mail: [email protected]
G.N.Odinokov, G.A.Eroshenko, V.V.Kutyrev
Comparative Analysis of inv Gene Structure in Strains of Plague and Pseudotuberculosis Agents
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov
Gene inv encoding one of the important pathogenicity factors of pseudotuberculosis agent was analyzed as regards its structure and function in plague microbe of the main and non-main subspecies and pseudotuberculosis microbe. The structure of gene inv was shown to be affected by introduction of insertion sequence IS1541 in all studied Yersinia pestis strains of non-main and main subspecies. This evidences that the loss of functional activity of this gene took place at initial stage of plague agent evolution.
Key words: plague and pseudotuberculous agents, invasion and adhesion factor, gene, mutation.
Authors:
Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe”. 410005, Saratov, Universitetskaya St., 46. E-mail: [email protected]
nociynHHa 15.12.08.
