ҚУРУҚЛИК МОЛЛЮСКАЛАРИ ТЕРМАТОДА ЛИЧИНКАЛАРНИНГ МОЛЕКУЯР ИДЕНТИФИКАЦИЯСИ Текст научной статьи по специальности «Науки о Земле и смежные экологические науки»

Central Asian Research Journal For Interdisciplinary Studies (CARJIS)

ISSN (online): 2181-2454

Volume 2 | Issue 5 | May, 2022 | SJIF: 5,965 | UIF: 7,6 | ISRA: JIF 1.947 | Google Scholar |

www.carjis.org

DOI: 10.24412/2181-2454-2022-5-616-623

КУРУЦЛИК МОЛЛЮСКАЛАРИ ТЕРМАТОДА ЛИЧИНКАЛАРНИНГ МОЛЕКУЯР ИДЕНТИФИКАЦИЯСИ

Х. З. Муродова

Наманган Давлат Университети

Л. Рустамова

Наманган Давлат Университети

АННОТАТЦИЯ

Ушбу маколада куруклик моллюскаларидаги терматода ва бундан ташкари оралик хужайини булмиш, моллюскаларнинг хам молекуляр идентификация килинишдаги илмий тадкикот ишлари кенг ёритиб берилган. Шуни кушимча килиш керакки, маколада идентификациялашнинг тадкикот методлари ва усуллари тулик ва тушунарли килиб тасвирланган.

Калит сузлар ПЗР, ДНК экстратсияси, геном, секвенрлаш, 18S рДНК праймерлари, Dicrocoelium dendriticum, Brachylaima sp, Xeropicta candacharica.

ABSTRACT

This paper provides extensive coverage of research work on the molecular identification of termatodes in terrestrial mollusks, as well as mollusks that are intermediate hosts. It should be added that the article describes the research methods and methods of identification to make them complete and understandable.

Keywords. PCR, DNA extraction, genome, sequencing, 18S rDNA primers, Dicrocoelium dendriticum, Brachylaima sp, Xeropicta candacharica.

КИРИШ

Республикамизда чорвачилик, паррандачилик ва баликчилик тармокларини ривожлантириш ва ветеринария хизмати самарадорлигини оширишга алохида эътибор каратилмокда. Бу борада, жумладан, кишлок хужалиги хайвонларида учрайдиган гельминт касалликлари аникланди, республика турли худудларини гельминтозлар билан боглик эпизотик вазият бахоланди ва гельминтозларни олдини олиш хамда унга карши курашиш чоралари ишлаб чикилди. Узбекистон Республикасини янада ривожлантириш буйича Хдракатлар стратегиясида 1 «кишлок хужалиги ишлаб чикариш

Central Asian Research Journal For Interdisciplinary Studies (CARJIS)

ISSN (online): 2181-2454 Volume 2 | Issue 5 | May, 2022 | SJIF: 5,965 | UIF: 7,6 | ISRA: JIF 1.947 | Google Scholar |

www.carjis.org DOI: 10.24412/2181-2454-2022-5-616-623

сохасига интенсив усулларни жорий этиш» вазифалари белгилаб берилган. Ушбу вазифалардан келиб чиккан холда, жумладан, Фаргона водийсининг турли табиий-хужалик регионларида таркалган куруклик моллюскаларида ривожланувчи гельминт личинкалари тур таркибини аниклаш, молекуляр идентификациялаш ва кишлок хужалиги хайвонлари гельминтозларини олдини олиш буйича чора тадбирларни ишлаб чикиш мухим илмий-амалий ахамият касб этади.

АДАБИЁТЛАР ТА^ЛИЛИ

Куруклик моллюскалари гельминт личинкалари фаунаси ва таксономиясига оид материаллар бир катор хорижий олимлар A.W.Demiaszkiewicz & I.Przybysz (2003), P.S.Grewal et al. (2003), M.Panayotova-Pencheva, (2006), Kose et al. (2015), R.G.Forsyth et al. (2015), I.B.Igbinosa et al. (2016), M.Nakao et al., (2017), T.Waki (2017), G.C.Onyishi et al. (2018) ишларида баён килинган. Гельминтлар ва уларнинг оралик хужайинининг молекуляр идентификацияси, филогенияси ва генетик хилма-хиллиги борасидаги тадкикотлар R.A.Carreno & S.A.Nadler (2003), E.J.Jenkins et al. (2005), Huby-Chilton et al. (2006), S.Kutz et al. (2007), D.Jouet et al. (2010), Kose et al. (2015), C.Lesage et al. (2015) ва J.Hildebrand et al. (2016) ишларида келтирилган.

Узбекистон шароитида куруклик моллюскалар айрим гельминтларнинг оралик хужайини сифатида урганишга доир дастлабки ишларни К.С.Самадов (1963), Б.Салимов (1963), М.А.Султонов (1963), Д.А. Азимов ва бошк.(1963), Я.У.Убайдуллаев (1971), М.А.Султонов ва бошк. (1971, 1978), Д.Эрназаров (1972) ва Т.К.Кобилов ва бошк. (1978) урганадилар. Кейинчалик Э.Кулмаматов ва бошк. (1994), Б.Давронов, (1999), А.Э.Кучбоев ва бошк. (1998), Ф.Д.Акрамова (2003), Б.Х.Рузиев (2008), А.Э.Кучбоев (2009), Э.Б.Шакарбоев (2009) ва бошкалар уз тадкикот ишларида айрим худудлардаги гельминтларнинг оралик хужайин сифатида иштирок хакида маълумот берадилар.

МЕТОДОЛОГИЯ

ДНК ажратиш усуллари. Личинкалар ва куруклик моллюскаларнинг тукимасидан ДНК ажратишда Dneasy Tissue Kit (Dneasy Tissue Kit (QIAGEN GmbH, Germany) ва Diatom DNA Prep 200 реагентлар туплами ёрдамида ДНК ажратилди. Бу реагентлар тупламини афзаллиги жинсий вояга етган

Central Asian Research Journal For Interdisciplinary Studies (CARJIS)

ISSN (online): 2181-2454 Volume 2 | Issue 5 | May, 2022 | SJIF: 5,965 | UIF: 7,6 | ISRA: JIF 1.947 | Google Scholar |

www.carjis.org DOI: 10.24412/2181-2454-2022-5-616-623

нематодаларнинг 10 мг тукимасидан ташкари, жуда кичик улчамдаги нематодаларнинг личинкаси ёки тухумидан геном ДНКсини ажратиб олиш мумкин (1-расм).

Иш учун битта личинка ажратиб олинди ва 1,5 мл ли "Эпендорф" пробиркасига солинди, дистилланган сувда ювилди, уни 36°С хавода куритдик. ДНК экстракциясини Dneasy Tissue Kit (Германия) мини-туплами ёрдамида ишлаб чикарувчининг курсатмаси буйича бажардик.

Куруклик моллюскаларнинг ДНК экстракти ажратишда оёгининг кафти кисмидан наъмуналар олинди. Тозаланган тоза ДНК элюатнинг сакланиши: Элюат тоза геном ДНКсини тутади ва ДНКни киска муддатда (24-48 соатга) саклаш учун 2-8°С хароратда сакланди. Узок муддатга саклаш учун эса - 20°С ёки янада паст -80°С хароратдан фойдаландик. Намуналарни такроран музлатиш ва эритиш тавсия килинмайди, ДНК денатурацияга учраши мумкин.

1-расм. Геном ДНКсини ажратиш боскичлари.

ПЗР-амплификация ва секвенирлаш усули. Гельминт личинкаларини идентификация килишда D2-домен 28S сохаси (C2 (5Л-GAAAAGAACTTTGRARAGAGA^) ва D2 (5Л -TCCGTGTTTCAAGAC GGG-3Л)) [10, 21] праймерларидан фойдаландик.

Куруклик моллюскаларни идентификациялашда Steinke et al. [150; 724-734-б.] тавсифлаган ITS-1 ва 18S рДНК праймерларидан фойдаланиб секвенирлаш амалга оширилди. Полимераза занжирли реакцияни (iCycler iQ

Central Asian Research Journal For Interdisciplinary Studies (CARJIS)

ISSN (online): 2181-2454

Volume 2 | Issue 5 | May, 2022 | SJIF: 5,965 | UIF: 7,6 | ISRA: JIF 1.947 | Google Scholar |

www.carjis.org DOI: 10.24412/2181-2454-2022-5-616-623

Real Time PCR BIORAD, USA) 25 mkh (^l) xa^Mga 6ynn6, 1 mkh (^l) ^HK Ba 1 mkh (^l) xap 6up npaftMepnap, GoTaq Green Master Mix (Promega Corp., USA)ga yTKa3Hngn.

n3P Maxcynoraapu 1,5 % arapo3anu renga aHHKgaHgu Ba y PCR GenEluteTM (Sigma-Aldrich) TynnaMH 6unaH TO3anaHgu.

n3P Maxcynoraapu npafiMepnapu epgaMuga xap hkkh ftyHanumga 6eBocuTa ceKBeHupnaHgu, ynap ^HK aмппн$нкaцнaсн ynyH ^oftganaHungH (Euro fins Sequencing, Japan). Eu3 ypraHraH HyKneorag KeTMa-KerauKnapHH reH6aHKgaru (NCBI) rentMunraap Ba KypyKguK MonnrocKanap KeTMa-KeraHKnapu (goMeHnapu) 6unaH KuecnaHgu.

HyK^eoTHg^apHH TeKHC^am Ba ^H^oreHeTHK ycy^H. HyKneoTugnapHHHr TeKHcnarnga ClustalW gacTypugaH $oftganaHH6, MEGA gacTypuHHHr 8.1 Bepcuacu opKann aManra omupguK. OunoreHeTHK gapaxT MaKCHMan xaKHKarra yxmamnuK (Maximum Likelihood, ML) Ba akhh KymHunap (Neighbor Joining, NJ) ycny6napu opKanu MEGA 6.1 [37] gacTypugaH $oftganaHH6 Ty3Hngu. MaKCHMan xaKHKarra yxmamnuK Ba akhh KymHunap 6apna Taxgunnapu HyKneoragnap anMamTupumHHHr энг MaK6yn Mogennapu 6unaH aHHKgaHgu, MatnyMoraap Kama umnaHgu, hhkh TyryHnapHH Ky^^a6-KyBBaTnam 500 gaH KynpoK pennuKaraapHH WKnam nynu 6unaH 6axpnaHgH.

MYXOKAMA BA HATH^A^AP

X,o3Hpru KyHga MoneKynap-reHeTHK ycynnap epgaMuga SuoxunMa-xunnuKHH ypraHum, TypnapHH a^param Ba ynapHHHr TapKanumuHH ypraHum MyxuM ax,aMHAT Kac6 этмoкцa. ffly MyHOca6aT 6unaH Y36eKHCTOHga napa3HT Typnap, ^yMnagaH, TpeMaToga nuHHHKanapu TypnapuHH aHHKgam ^yga MyxuM Macanagup. OgaTga, TpeMarognap ^pKapuftnapuHH aHHKgam ynyH KnaccuK Mop^onoruK ycynnapgaH ^onganaHHm khhhh um 6ynH6, MyTaxaccucgaH WKopu ManaKa Tana6 этagн. napa3HTHHHr nunuHKanHK 6ockhhhhh aBnoggaH Kynu TaKCOHnapga Mop^onoruK ycynnap epgaMuga Kyn xonnapga aHHKgamHMKoHHATH ftyK.

fflyHHHr ynyH MaKonaga, OaproHa BoguftcHHHHr Ta6uHH Ba CHHampon 6uo^Ho3napHga KypyKguK MonnrocKanapga TpeMaroga nunuHKanapuHH MoneKynap aHHKgamHH ypraHumgaH u6opar (2-pacM).

TpeMaToganapHHHr Dicrocoelium dendriticum Looss, 1899 (Digenea: Dicrocoeliidae) Typu yTxyp x,afiBoHnap gyHecu, aftHHKca, ftupuK Ba Manga moxnu xanBoHnap ypTacuga KeHr TapKanu6, renbMHHTO3napgaH 6upH 6ynraH

Central Asian Research Journal For Interdisciplinary Studies (CARJIS)

ISSN (online): 2181-2454 Volume 2 | Issue 5 | May, 2022 | SJIF: 5,965 | UIF: 7,6 | ISRA: JIF 1.947 | Google Scholar |

www.carjis.org DOI: 10.24412/2181-2454-2022-5-616-623

дикроцелиозга сабаб булади. Баъзан одамларда хам бу касаллик учрайди. Дикроцелиоз кузгатувчисининг ривожланишида иккита оралик хужайин иштирок этади. Паразитнинг биринчи хужайини куруклик моллюскалари (кориноёкли моллюскалар), иккинчи оралик хужайини эса чумолилар хисобланади . Кавш кайтарувчи хайвонлар дикроцелид личинкалари билан зарарланган чумолини ут билан бирга ейиши хисобига уни организмига юктиради. Х,ар кайси ёввойи ёки уй хайвонларига хам худди шу тарзда юкиши мумкин .

Бир неча авлод ва турлардан ташкил топган Brachylaimidae Joyeux & Foley, 1930 оиласи хам кенг таркалган дигенетик трематода булиб, хамма жойда учрайди. Brachylaima Dujardin, 1843 авлоди хам ушбу оилага кириб, иссикконли умурткали хайвонлар, жумладан, кушлар, сутэмизувчилар ва одамларнинг асосий эндопаразитиди. Брахилайма турларининг хаётий даврида биринчи ва иккинчи оралик хужайин сифатида куруклик шиллиги ва шилликкуртлари иштирок этади. Биринчи оралик хужайинда споросиста ва церкарий, иккинчи оралик хужайинда Brachylaima метацеркарийси булади. Биз топган метацеркарий маритасининг кейинги ривожланиши номаълум булгани учун, унинг тур идентификацияси масаласини якуний хоссаларни экспериментам равишда юктирмасдан урганиш мумкин эмас. Метацеркарий билан зарарланган моллюскалар дефинитив хужайин томонидан ютилганда паразитни юктириш содир булади.

2-расм. Оралик хужайин - куруклик моллюскалари (чиганоклар) ва трематодаларнинг личинкалик боскичлари: А) Xeropicta candacharica. Б) Angiomphalia regeliana. В) Dicrocoelium dendriticum. Г) Pseudonapaeus sogdianus церкарийси. Д) Brachylaima sp. церкарийси.

Central Asian Research Journal For Interdisciplinary Studies (CARJIS)

ISSN (online): 2181-2454

Volume 2 | Issue 5 | May, 2022 | SJIF: 5,965 | UIF: 7,6 | ISRA: JIF 1.947 | Google Scholar |

www.carjis.org DOI: 10.24412/2181-2454-2022-5-616-623

Тадкикот иши натижасида, Наманган вилояти Чуст ва Косонсой туманларида таркалган уч тур куруклик моллюскаларидан иккита трематода тури личинкалари Dicrocoelium sp. ва Brachylaima sp. ларнинг мавжудлиги ва таркалишини аникланди. Бу ишда куруклик моллюскаларнинг жами 439 та намунаси йигилди. Намуналар Косонсой сув омбори якинидаги яйловларда бокиладиган куй, эчки ва корамоллар таркалган жойлардан Xceropicta candacharica туридан 262 та, «Бахористон» кдшлогидан Angiomphalia regeliana -82 та ва Говасой кдшлогидан Pseudonapaeus sogdianus - 95 та моллюскалар йигилди.

Brachylaima sp. туриниг аниклаш, унинг кейинги ривожланишини экспериментам тажрибалар оркали урганиш ва дефинитив хужайинларни зарарлаш ёки молекуляр тахлил килиш йули билан хал килиниши мумкин. Биз ушбу тадкикотда ПЗР утказиш учун жуда усулини кулладик. Бу усулда ёрдамида паразитларнинг ДНК нуклеотидлари кетма-кетликларини битта метацеркарийда ёки спороцисталарнинг кичик кисмида хам аниклай олса булади.

Тадкикот ишимизда 5 та намунадаги трематода личинкаларини рибосома ДНКси 28S генининг кисман кетма-кетлигини буйича амплификация килинди.(З-расм)

3-расмДуруклик моллюскаларидаги трематода личинкаларининг молекуляр идентификацияси.

X. Сandacharicaдан олинган биринчи намуналар солиштирилганда D. dendriticum трематодасига 99-100% ухшашлик булган, P. sogdianus моллюскасидан олинган личинка намуналари Brachylaima sp. турига 98%

Central Asian Research Journal For Interdisciplinary Studies (CARJIS)

ISSN (online): 2181-2454

Volume 2 | Issue 5 | May, 2022 | SJIF: 5,965 | UIF: 7,6 | ISRA: JIF 1.947 | Google Scholar |

www.carjis.org DOI: 10.24412/2181-2454-2022-5-616-623

ухшаш булди. Ушбу турнинг тур статусини аниклаш учун келажакда экспериментал тадкикотлар утказиш йули билан турни таъснифлаш талаб этилади.

Бизнинг рДНК 28S гени кетма-кетликлари буйича олинган натижалар ва Генбанкдаги маълумотлар асосида Dicrocoeliidae ва Brachylaimidae таксонлари ёрдамида курилган филогенетик дарахт Dicrocoelium авлоди турлари кетма-кетлиги битта шохга бирлашди, умумий ишончли фаркни курсатувчи нодал статистик куллаб-кувватлаш билан учта тармок хосил килди. Бизнинг Brachylaima sp. церкарийлари ва Генбанк дан олинган B. virginicum ва Brachylaima sp. таксонлари хам турларни аник фарклаш билан битта ягона кладга бирлашди.

Трематодаларнинг Dicrocoeliidae ва Brachylaimidae оилалари алохида катта оилаларига мансуб булган гурухдир. Шунинг учун, биз ташки гурух сифатида биринчи шох учун Encyclometra colubrimurorum трематодаси, иккинчи шох (клад) учун Leucochloridium perturbatum трематодасидан фойдаландик (рДНК 28S гени асосида).

Уларнинг икки шохга булиниши жуда эхтимолли эди. Ана шу кетма-кетликлар учун "максимал тежаш" усули ёрдамида курилган филогенетик дарахтда хам бир хил кладлар хосил килганлиги яккол кузга ташланди.

Трематода ДНКсининг турли кисмларини бирламчи тузилмасини кодланган маълумотлари гельминтологиянинг долзарб масалаларини ечишда, шу жумладан паразитлар систематикаси ва эволюцияси яхширок тушуниш имконини беради.

Биз фойдаланган рибосомал молекуляр маркер дикроцелий ва брахиламид турларни аниклаш учун ишлатилади ва морфологик хусусиятларнинг хакикийлигини тасдиклайди хамда трематодалар филогенезида авлодларнинг систематик жойлашувини аник белгилайди. ДНК-штрих кодлаш ва морфологик ёндашувлар интеграцияси ноаник трематода турларини аниклаш ва уларнинг таксономиясини кайта ташкил этиш учун мухимдир.

ХУЛОСА

Ушбу маколада Dicrocoelium sp. ва Brachylaima sp. личинкалари рибосомал ДНК 28S сохаси генининг кисман нуклеотид кетма-кетликлари натижасига кура, X. candacharica ва A. regeliana моллюскасидаги личинкалар D.

Central Asian Research Journal For Interdisciplinary Studies (CARJIS)

ISSN (online): 2181-2454 Volume 2 | Issue 5 | May, 2022 | SJIF: 5,965 | UIF: 7,6 | ISRA: JIF 1.947 | Google Scholar |

www.carjis.org DOI: 10.24412/2181-2454-2022-5-616-623

dendriticum трематодасига 100% ухшаш, P. sogdiana моллюскасидаги личинка Brachylaima sp. трематодасига 98% ухшаш хисобланди.

REFERENCES

1.Узбекистон Республикаси Президентининг 2017 йил 7 февралдаги ПФ-4947-сон "Узбекистон Республикасини янада ривожлантириш буйича Харакатлар стратегияси тугрисида"ги Фармони.

2. Ивашкин В.М., Орипов А.О., Сонин М.Д. Определитель гельминтов мелкого рогатого скота. - М.: Наука, 1989. -255 с.

3. Каримова Р.Р., Эгамбердиев М.Х., Амиров О.О., Кучбоев А.Э. Namangan viloyati tog' oldi mintaqasi quruqlik mollyuskalarining gel'mint lichinkalari // "Genetika, genomika va bioinformatikaning dolzarb muammolari va istiqbollari" Respublika ilmiy-amaliy konferentsiya materiallari. Toshkent. 2017. -B 114-116 28.

4. Кучбоев A.E., Krucken J., Ruziev B.H., von Samson-Himmelstjerna G. Molecular phylogeny and diagnosis of species of the family Protostrongylidae from caprine hosts in Uzbekistan// Parasitology Research. 2015, 114 (4). - P 1355-1364

5. Нуруллаев А. А. Био - экологическая и эпизоотологическая характеристика патогенных трематод и их промежуточных хозяев в Зарафшанской долине.: Автореф. Дис. ...канд. Биол. Наук. - Ташкент: ИЗиП АН УзССР. 1991.-24 с.