CC BY
13УДК 57.012.4:582.282.123.4
УЛЬТРАСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК ВЕГЕТАТИВНОГО МИЦЕЛИЯ ASPERGILLUS CANDIDUS LINK, ВЫРАЩЕННЫХ IN VITRO
1 Степанова А.А. (зав. лаб.)*, 1 Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой), 2 Чжан ф. (директор института, зав. кафедрой), 2 Тонг Д. (доцент кафедры)
1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Санкт-Петербург, Россия; 2 Харбинский Медицинский Университет, Харбин, Китай
© Коллектив авторов, 2016
В работе приведены данные по ультраструктуре клеток вегетативного мицелия у штамма Aspergillus candidus, выращенного на среде Чапека. Выявлены различия в тонком строении зрелых клеток гиф. Выделено 6 основных типов зрелых клеток гиф мицелия по: 1) размерам и форме интерфазных ядер; 2) характеру вакуолизации; 3) числу и строению митохондрий; 4) степени развития и строении эндоплазматического ретикулума; 5) наличию, отсутствию, количеству и качеству аккумулируемых запасных веществ и другим признакам. Клетки гиф мицелия изученного штамма A. candidus отделены друг от друга однослойными клиновидными светлыми септами. Компонентами порового аппарата септ были тельца Воронина и пробки. Тельца Воронина имели сферическую форму, их число на медианном срезе септы варьировало от одного до девяти.
Ключевые слова: Aspergillus candidus, вегетативный мицелий, in vitro, компоненты клеток, ультраструктура, электронная микроскопия
ULTRASTRUCTURAL INVESTIGATIONS OF GROWING IN VITRO CELLS OF VEGETATIVE MYCELIUM OF ASPERGILLUS CANDIDUS LINK
iStepanova А.А. (head of the laboratory), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the chair), 2Zhang F. (director of the institute, head of the chair), 2Tong D. (associate professor)
i Kashkin Research Institute of Medical Mycology, I.I. Mechnikov North-Western State Medical University, Saint Petersburg, Russia; 2 Harbin Medical University, Harbin, China
© Collective of authors, 2016
Ultrastructural data according the growing on Chapek's medium cells of vegetative mycelium the strain of A. candidus was presented in work. Differences in the thin structure of mature cells of hypha were revealed. Six main types of mature types of hyphal cells of mycelium was revealed according of the: 1) sizes and form of interphase nucleus; 2) character of a vacuolization; 3) number and structure of mitochondria; 4) level the development and structure of the endoplasmic reticulum (ER); 5) presence, absence, quantity and quality of the accumulated spare substances and other signs. The cells of investigated strain of A. candidus were separated from each other by single-layer wedge-shaped light septa. Woronin bodies and plugs were components of the septal pore apparatus. Woronin bodies had a spherical form; their number on a median section of the septa varied from 1 to 9.
Key words: Aspergillus candidus, cell components, electron microscopy, in vitro, ultrastructure, vegetative mycelium
* Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, тел.: (812) 303-51-40
ВВЕДЕНИЕ
Aspergillus candidus Link - широко распространенный мицелиальный гриб-космополит, обитающий в почве, на растительных остатках, зерне, семенах, мучных и различных промышленных изделиях [1; Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Киев, 1988].
Данный вид гриба может вызывать у человека поверхностные и инвазивные микозы: онихомикоз [Zaror L., Moreno M.L. // Revta Argent Micol. - 1980. -Vol. 3; Сергеев А.Ю. и др. // Тез. докл. 1 Съезда микологов России. - M.: 2002], отомикоз [Falser N. // Laryngol. Rhinol. Otol. - 1983. - Vol. 62], инвазивный аспергиллез [2], аспергиллему [Avanzini F., et al.// Acta Otorhinol. Ital. - 1991], легочной аспергиллез [Iwasaki K., et al.// Kyobu Geka . - 1991] и гранулему головного мозга [Linares G., et al.// Neurology. - 1971. - Vol. 21, №2]. Известны случаи выделения A. candidus из спинномозговой жидкости больных менингитом [3]. В научной литературе приводят фрагментарные данные о тонком строении зрелых конидий A. candidus [Krysinska-Traczyk E., Dutkiewicz J. // Ann. Agric. Environ. Med. - 2000. - Vol. 7]. Ультраструктурные особенности строения клеток вегетативного мицелия ранее не были изучены. В связи с этим, представляет интерес детальное изучение особенностей их морфогенеза и сравнение полученных данных по имеющимся в литературе другим видам рода Aspergillus [4-11; Mason P.J., Crosse R.// Trans. Brit. Mycol. Soc. - 1975. - Vol. 65, №1; Momany M., Hamer J.E.// Cell Motility and the Cytoskeleton. - 1997. - Vol. 38, №4; Momany M., et al.// Mycologia. - 2002. - Vol. 94, №2].
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использовали штамм (РКПГБ-123/ВКМБ-19) A. candidus (Российская коллекция патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Каш-кина). Культуру гриба выращивали на среде Чапека в термостате при 27 °С. Кусочки агаризованной среды с воздушным и погруженным мицелием из периферической, средней и центральной частей колонии гриба фиксировали через 2, 3, 5 и 10 суток после посева глу-таральдегидом-параформальдегидом-осмием. В качестве буфера использовали какодилат натрия (рН 7,2). Материал заливали в смесь эпоксидных смол эпон-аралдит. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-V (Швеция) с помощью стеклянных ножей, окрашивали раствором уранилацетата и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе просвечивающего типа JEM 100 CX-2 (Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Интактные клетки гиф воздушного и субстратного мицелиев имели варьирующий диаметр (от 1,5-2,5 мкм). Они содержали многочисленные ядра округлой (1,2 мкм) или эллипсоидной формы (1,0 х 1,5 мкм). Ядра одиночные или попарно сближены, расположены в толще цитозоля или вблизи клеточной стенки (Рис. 1 а). Ядрышко одно, небольших размеров (0,4 мкм), эксцентричное, слабоконтрастное. Нуклеоплазма по электронной плотности не отличается от цитозоля, содержит хроматин диффузного типа.
В молодых растущих клетках вакуоли наблюдали редко; они равномерно распределены по площади среза клетки, мелкие, одиночные, светлые. Митохондрии в небольшом числе, мелкие (от 0,3 до 0,5 мкм), с плот-
ным матриксом и частыми кристами. Другие органел-лы не выявляли из-за высокой электронной плотности цитозоля. Редко отмечали короткие слегка извилистые цистерны агранулярного эндоплазматического рети-кулума. Запасные вещества отсутствовали. Плазма-лемма ровная, плотно прилегала к клеточной стенке. Латеральная клеточная стенка тонкая (0,1 мкм), однослойная, светлая, тонко-гранулярной структуры.
В изученных колониях гриба A. Candidus выявили шесть основных типов зрелых гиф, клетки которых различались по размерам и форме ядер, уровню развития и строению вакуома, хондриома, а также по наличию, отсутствию и типу запасных веществ. Общими признаками дифференциации клеток всех типов гиф субстратного мицелия были: пролиферация хондриома (иногда с формированием митохондриального ре-тикулума), наличие одиночных или попарно сближенных интерфазных ядер хромоцентрического типа. В ядрах присутствовало довольно крупное эксцентричное ядрышко эллипсоидной (0,6 мкм) формы, состоящее из фибриллярного и гранулярного компонентов, причем последний доминировал.
В зрелых клетках гиф первого типа интерфазные ядра сферической формы (1,8 мкм, рис. 1 а, б) попарно сближены. Вакуоли мелкие и средних размеров, причем первые доминировали. Они округлой или слегка неправильной формы, содержали редкие обрывки мембран и небольшие по объему скопления тонкофибриллярного материала. Профили митохондрий довольно протяженные (1,0 х 2,0 мкм), сильно извилистые, ветвистые, локализовались вблизи ядра (Рис. 1 б) и клеточной стенки. Матрикс митохондрий плотный, содержит многочисленные параллельно ориентированные относительно друг друга кристы со светлым содержимым. При просмотре серийных срезов выявили наличие в клетках такого типа одной гигантской митохондрии. Эндоплазматический ретикулум в виде редких, одиночных, агранулярных прямых или слегка извилистых периферических цистерн. Другие компоненты эндомембранной системы не обнаружили. Запасные вещества одного типа - это варьирующего диаметра (0,3-0,7 мкм) умеренной электронной плотности липидные включения, локализованные по периметру клетки вблизи клеточной стенки (Рис. 1 а). Умеренной электронной плотности цитозоль содержал многочисленные свободные рибосомы. Плазмалемма трехслойная, плотно прилегала к клеточной стенке. Клеточная стенка тонкая (0,15 мкм), однослойная, фибриллярная. Клетки гиф субстратного мицелия снаружи несли слой варьирующей толщины (0,2-0,5 мкм), состоящий из темного тонко-фибриллярного материала и плотных сгустков различной конфигурации (Рис. 1 в), так называемого «внеклеточного матрикса». Забегая вперед, отметим, что приведенное описание клеточных стенок и внеклеточного матрикса характерно и для всех остальных ниже описанных типов зрелых гиф вегетативного мицелия A. Candidus.
Клетки гиф второго типа имели одиночные ядра эллипсоидной формы (1,0 х 1,7 мкм), для которых был характерен слегка волнистый контур оболочки. Вакуоли мелкие, светлые встречались как исключение. Митохондрии мелкие (0,3-0,5 мкм), разнообразной морфологии, одиночные, с матриксом умеренной электронной плотности и небольшим числом хаотич-
но расположенных светлых крист. Другие органеллы и компоненты эндомембранной системы не обнаружили. Запасные вещества двух типов - в виде липидных включений и розеток гликогена (Рис. 1 г, д). Липидные включения мелкие (0,2-0,3 мкм), одиночные или в небольших группах, умеренной электронной плотности, приуроченных к клеточной стенке. Со временем в зрелых клетках описываемого типа скопления гликогена преобладают. Специфической чертой строения клеточных стенок зрелых гиф данного типа было наличие выростов (протуберанцев) клеточных стенок варьирующей морфологии (Рис. 1 г, стрелка).
Для клеток гиф третьего типа были характерны одиночные интерфазные ядра сферической (1,2 мкм) формы. Вакуоли средних размеров, светлые, равномерно распределены по площади среза клетки (Рис. 1 е), содержали небольшое число фибриллярных и мембранных включений. Митохондрии имели структуру, типичную для зрелых клеток гиф второго типа. Выявлены запасные вещества трех типов: липидные включения, розетки гликогена и фиброзиновые тельца. Розетки гликогена доминировали, формировали довольно обширные скопления. Второе место по частоте встречаемости занимали липидные включения. Они мелкие (0,3-0,4 мкм), одиночные, умеренной электронной плотности, локализованы по периферии клетки. Фиброзиновые тельца в числе 2-4 на срез клетки, неправильной формы (Рис. 1 ж), умеренной электронной плотности, ориентированы вблизи клеточной стенки. Цитозоль высокой электронной плотности, насыщен свободными рибосомами. Основные особенности тонкого строения плазмалеммы и клеточной стенки такие же, как и у клеток гиф второго типа.
Клетки гиф четвертого типа содержали ядра (1,6 х 2,1 мкм) с волнистым контуром. Вакуоли крупные, светлые (Рис. 1 з), с разнообразными включениями. Митохондрии мелкие (0,2-0,3 мкм), одиночные, с ма-триксом умеренной электронной плотности и редкими хаотично расположенными кристами. Запасные вещества представлены редкими, умеренной электронной плотности липидными включениями, обширными скоплениями гранул 6-гликогена и игловидной формы мелких фиброзиновых телец (Рис.1 з). Другим типом запасных веществ были умеренные скопления мелких темных и со светлым центром полифосфатных гранул в вакуолях (Рис. 1 з, и). Цитозоль, плазмалемма и клеточная стенка имели ультраструктуру, характерную для клеток гиф первого типа.
Ядра зрелых клеток гиф пятого типа эллипсоидной (1,2 х 1,8 мкм) формы (Рис. 1 л). Контур ядерной оболочки ровный. Вакуом был хорошо развит и состоял из крупных светлых вакуолей с разнообразным содержимым. В крупных вакуолях некоторых клеток гиф такого типа наблюдали многочисленные хаотично ориентированные палочковидные вирусоподобные частицы (Рис. 1 д, м) длиной 1,40 (1,38-1,42) мкм и толщиной 0,07 (0,05-0,09) мкм. Оболочка их двухслойная, толщиной 0,03 (0,01-0,04) мкм. Вирусоподобные частицы локализовались одиночно или в группах по 2-7. Ранее вирусоподобные частицы аналогичного строения были выявлены в клетках вегетативного мицелия А. /1а,ут [6].
Митохондрии значительной протяженности (2,03,5 мкм) локализовались вблизи клеточной стенки,
Рис. 1. Особенности тонкого строения клеток гиф A. candidus, выращенного на среде Чапека. Условные обозначения (здесь и на рис. 2): БГ - В -гликоген; В - вакуоль; ВМ - внеклеточный матрикс; ВЧ - вирусоподобные частицы; Г - гликоген; КС - клеточная стенка; ЛВ - липидное включение; М - митохондрия(и); Пб - пробка; ПО - протуберанцы оболочки; ПФГ -полифосфатные гранулы; С - септа; ТВ - тельце Воронина; ФТ - фиброзиновые тельца; Яд - ядро. Масштабные линейки: а,
б, г. к - 1 мкм, в - 0,2 мкм, д, з, е, и, м, н - 0,3 мкм, ж - 0,5 мкм
Рис. 2. Фрагменты зрелых (а, в-д) и стареющей (б) клеток мицелия A. Candidus, выращенного на среде Чапека. Масштабные
линейки: а, г, д - 0, 15 мкм, б - 0,5 мкм, в - 0,2 мкм
формировали одну органеллу. Другие компоненты клеток отсутствовали. Запасные вещества в виде многочисленных липидных капель в цитозоле (Рис. 1 л, м) и мелких темных или со светлым центром гранул полифосфатов (Рис. 1 м). Необычной морфологической особенностью строения липидных включений зрелых клеток этого типа было формирование в них электронно-плотной центральной части (Рис. 1 л, м). Со временем электронная плотность липидных включений становилась намного более электронно-плотной (Рис. 1 н), за исключением лишь небольшой по толщине периферической их части. Они часто сливались между собой, но при этом сохраняли присущую форму.
Для зрелых клеток гиф шестого типа были характерны ядра, сходные по морфологии с таковыми пятого типа. Вакуоли практически отсутствовали. Митохондрии по частоте встречаемости и строению были сходны с аналогичными, описанными для клеток второго, третьего и четвертого типов. Особенностью ультраструктурной организации клеток этого типа было присутствие большого числа розеток гликогена, а также фиброзиновых телец игловидной, сферической и неправильной форм (1 п, р). Это второе сообщение в литературе о присутствии фиброзиновых телец в клетках мицелия аспергиллов. Ранее они были описаны для клеток вегетативного мицелия A. versicolor [7].
Заключительные стадии морфогенеза клеток гиф мицелия A. candidus протекали сходно. При этом существенно сокращались размеры ядер и ядрышек, отмечали формирование крупной центральной вакуоли (Рис. 1 ж). Заметно возрастала электронная плотность цитозоля, а также снижалась численность органелл и запасных веществ (Рис. 2 б).
Отдельно следует остановиться на строении септ и порового аппарата зрелых клеток вегетативного мицелия A. candidus. Гифы мицелия разделены на клетки посредством однослойных светлых клиновидных септ (Рис. 1 с, т). Толщина септ вблизи латеральной клеточной стенки, в среднем, была равна 0,20 (0,19-0,22) мкм, а в средней части - 0,12 (0,10-0,14) мкм. В центре септ присутствовала сквозная пора диаметром 0,12 (0,10-0,14) мкм. Вблизи септальных пор расположены тельца Воронина в числе от 1 до 9, которые локализовались на некотором расстоянии от септальной поры. Форма телец Воронина сферическая (в среднем, 0,15 мкм), содержимое - гомогенное умеренной или высокой электронной плотности. Они окружены темной трехслойной ограничивающей мембраной. Тельца Воронина были обязательным компонентом порово-го аппарата септ клеток вегетативного мицелия анализируемого штамма A. candidus. В просвете зрелых и, особенно, стареющих клеток гиф, как правило, присутствовали крупные электронно-плотные пробки разнообразной формы (неправильной, округлой формы или в виде шкива) (Рис. 1 у). Отметим, что по строению септ и составу их порового аппарата клетки
гиф A. candidus сходны с таковыми культуральных [49; Mason P. J., Crosse R. // Trans. Brit. Mycol. Soc. - 1975. - Vol. 65, №1; Momany M., Hamer J.E.// Cell Motility and the Cytoskeleton. - 1997. - Vol. 38, №4] и тканевых форм [10, 11] других видов рода Aspergillus.
Итак, для зрелых клеток гиф вегетативного мицелия изученного штамма A. candidus характерно наличие большого числа ядер, размеры и форма которых зависели от типа гиф. Вегетативный мицелий анализируемого штамма A. candidus, как и у ранее других изученных видов аспергиллов [4-9], имел гетерогенный состав. Он включал в себя шесть основных типов зрелых гиф, различающихся по размерам и форме ядер, характеру вакуолизации, строению митохондрий, уровню развития эндоплазматического ретикулума, отсутствию, наличию и типу запасных веществ.
Данными настоящей и ранее проведенных работ [49] подтверждена предложенная ранее модель биологии развития патогенных штаммов аспергиллов, согласно которой полиморфизм ультраструктуры зрелых клеток гиф мицелия или, иными словами, разная направленность метаболизма, обнаруженная для клеток гиф, выращенных в идентичных условиях, является причиной его большой вирулентности и способности колонизировать разные типы субстрата, приложимо и для изученного в настоящей работе A. candidus.
Характерной особенностью ультраструктуры клеток гиф субстратного мицелия A. candidus, отличающих их от таковых воздушного мицелия, было то, что они имели хорошо развитый наружный внеклеточный матрикс, представляющий собой, синтезируемые и выделяемые грибом в питательную среду метаболиты. Этот слой характерен для клеток гиф субстратного мицелия других видов аспергиллов, выращенных в культуре на аналогичной среде [14-9], а также для тканевых форм аспергиллов [10, 11].
выводы
1. Зрелые клетки гиф вегетативного мицелия изученного штамма A. candidus имели многочисленные интерфазные ядра с низким содержанием конденсированного хроматина.
2. Морфогенез клеток гиф мицелия у штамма A. candidus протекал по шести основным типам, различающимся по характеру вакуолизации, строению хон-дриома, степени развития и строении эндоплазмати-ческого ретикулума, наличию, количеству и качеству аккумулируемых запасных веществ и другим признакам.
4. Клетки гиф мицелия изученного штамма A. candidus отделены друг от друга однослойными светлыми клиновидными септами. Компонентами поро-вого аппарата септ были тельца Воронина и пробки. Тельца Воронина имели округлую форму, их число на медианном срезе септы варьировало от одного до девяти.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Andreoni S., Farina C., Lombardi G., et al. Medical mycology atlas. - 2004. - 239 p.
2. Ribeiro S.C.C., Santana A.N.C., Arriagada G.H., et al. A novel cause of invasive pulmonary infection in an immunocompetent patient Aspergillus Candidus// J. Infect. - 2005. - Vol. 51. - P. 195-197.
3. Elias M.L., Soliman A.K., Mahoney F.J., et al. Isolation of Cryptococcus, Candida, Aspergillus, Rhodotorula and Nocardia from meningitis patients in Egypt// J. Egypt. Public Health Assoc. - 2009. - Vol. 84, №1-2. - Р. 169-181.
4. Степанова А.А., Синицкая И.А. Ультраструктура клеток Aspergillus niger. Вегетативный мицелий// Проблемы мед. микологии. - 2003. - Т. 5, №4. - C. 32-39.
5. Степанова А.А., Синицкая И.А., Авдеенко Ю.Л. Субмикроскопическое изучение клеток вегетативного мицелия Aspergillus fumigatus Fres.// Проблемы мед. микологии. - 2004. - Т. 6, № 3. - С. 34-40.
6. Степанова А.А., Синицкая И.А. Ультраструктура клеток вегетативного мицелия Aspergillus flavus Link, выращенного in vitro// Проблемы мед. микологии. - 2006. - Т. 8, №1. - С. 40-45.
7. Степанова А.А., Синицкая И.А. Цитология клеток выращенного in vitro вегетативного мицелия Aspergillus versicolor (Vuill.) Tiraboshi// Пробл. мед. микологии. - 2006. - Т. 8, №3. - С. 22-28.
8. Степанова А.А., Синицкая И.А. Электронно-микроскопическое изучение клеток вегетативного мицелия Aspergillus terreus Thom// Проблемы мед. микологии. - 2007. - Т. 9, №3. - С. 26-33.
9. Степанова А.А., Синицкая И.А. Ультраструктура клеток вегетативного мицелия Aspergillus flavus Link, выращенного in vitro// Проблемы мед. микологии. - 2006. - Т. 8, №1. - С. 40-45.
10. Степанова А.А., Босак И.А., Синицкая И.А. Цитологическое исследование Aspergillus fumigatus Fres. в легких мышей// Проблемы мед. микологии. - 2013. - Т. 15, №1. - С. 52-58.
11. Stepanova А.А., Vasilyeva N.V., Zhang F., et al. Electronmicroscopic investigations of invasive aspergillosis, caused with Aspergillus fumigatus// Проблемы мед. микологии. - 2015. - Т. 17, №3 - P. 38-41.
Поступила в редакцию журнала 21.03.2016
Рецензент: С.М. Игнатьева
