CC BY
60УДК 57.086.3:582.282.123.4
СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ASPERGILLUS NIGER
Степанова А.А. (зав. лаб.)*, Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой), Чилина Г.А. (зав. лаб.)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2018
С помощью метода сканирующей электронной микроскопии исследованы особенности морфогенеза клеток гиф вегетативного мицелия и конидиогенного аппарата у Aspergillus niger (штамм РКПГ¥-1224). Выявлены различия в структуре поверхности латеральных клеточных стенок зрелых гиф воздушного мицелия и формируемых ими конидиеносцев. Показано, что метулы конидиогенных аппаратов A. niger формируются синхронно, тогда как фиалиды и конидии - асинхронно.
Ключевые слова: Aspergillus niger, клетки гиф, конидиогенный аппарат, морфогенез, сканирующая электронная микроскопия, ультраструктура
SCANNING ELECTRONIC MICROSCOPY OF ASPERGILLUS NIGER
Stepanova A.A. (head of the laboratory), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department), Chilina G.A. (head of the laboratory)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of NorthWestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2018
By using the method of the scanning electronic microscopy the peculiarity of the morphogenesis of hyphal cells of vegetative mycelium and conidiogenous apparatus of the strain РКПГ¥-1224) of Aspergillus niger were studied. Differences in the surface structure of the lateral cell walls of the mature hyphal cells of aerial mycelium and the conidiophore stipes were revealed. It is shown that metules of the conidiogenous apparatus of A. niger were developed synchronously whereas phialides and conidia -asynchronously.
Key words: Aspergillus niger, conidiogenous apparatus, hyphal cells, morphogenesis, scanning electron microscopy, ultrastructure
Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, e-mail: [email protected]
ВВЕДЕНИЕ
Aspergillus niger Tiegh. - широко распространенный вид мицелиального гриба [1], продуцирующий большое количество асексуальных конидий. Данный вид гриба может вызывать диссеминированный аспергил-лез, отомикоз, эндофтальмит, артрит, перитонит, эн-дофтальмит, онихомикоз и др. [2]
Ранее [1] мы проанализировали особенности строения разных типов клеток Aspergillus niger на примере штамма РКП^-1224.
Цель исследования - на примере другого штамма этого вида гриба изучить особенности морфогенеза разных типов клеток гиф вегетативного мицелия и конидиогенного аппарата под углом зрения выполняемых ими функций.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Изучали культуру A. niger (штамм PKÜTF- 1249/8802) из коллекции НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, выделенную из мокроты больного аспергиллезом (Л.В.Б., 21.09.2005 г.). Вид гриба был идентифицирован методом ДНК-секвенирования по локусу b-tubulin. Культуру гриба выращивали на среде Чапека в термостате при 27 °С. Через 10 дней после посева кусочки агаризированной среды с разными участками колонии гриба фиксировали для целей сканирующей электронной микроскопии в 3% растворе глутаральдегида на какодилатном буфере (рН 7,2), затем проводили через серию спиртов возрастающей концентрации (30, 50 и 70 °), высушивали при критической точке на приборе НСР-2 и напыляли золотом на IB-3. Материал изучали в сканирующем электронном микроскопе JSM 35.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Вегетативный мицелий. Гифы воздушного мицелия по самому краю колонии расположены в тонком слое по поверхности питательной среды, рыхло и хаотично (Рис. 1 а). Они извилистые, одиночные либо контактируют между собой (Рис. 1 а), со средним диаметром 3 мкм. Именно в этой зоне мицелия наиболее часто встречались апикально растущие концевые клетки мицелия (Рис. 1 б, в, стрелки). Концевые участки гиф могут ориентироваться без видимого порядка (Рис. 1 б, стрелки) либо в тесной группе в виде веерообразного расходящихся апексов (Рис. 1 в, стрелки). Последняя пространственная композиция и плотный контакт апикальных сегментов гиф вегетативного мицелия способствуют сопряженному их росту. Изучение материала на больших увеличениях позволяет выявить, что поверхность латеральных клеточных стенок молодых гиф не гладкая, а с характерным мелкозернистым рисунком (Рис. 1 б). Непосредственно в апексе гиф элементы скульптуры отсутствовали.
По мере продвижения к центру колонии плотность расположения гиф мицелия заметно возрастала (Рис. 1 г, д), диаметр их несколько увеличивался (в среднем до 4 мкм). В самом поверхностном слое воздушного мицелия ориентация гиф часто хаотично-ячеистая (Рис. 1 г, д). В просвете ячеек легко выявлялись нижележащие гифы воздушного мицелия (Рис. 1 д, стрелки). В средней части колонии структура поверхности гиф мицелия становилась более разнообразной. По-прежнему встречались гифы с мелкозернистой структурой по-
Рис. 1. Ультраструктура клеток вегетативного мицелия (а-л) и формирующихся конидиеносцев (к, л) А. П1дег (РКП^- 1249/880-2) в сканирующем электронном микроскопе.
Условные обозначения здесь и на рис. 2: Г - головка, Гф - гифы, К - конидии, Кн - конидиеносец, Ме - метулы; С - септа, Фи - фиалиды.
Рис. 2. Особенности структуры A. niger (РКПГР- 1249/880-2) в сканирующем электронном микроскопе: а - конидиеносцы (стрелки) на фоне гиф воздушного мицелия; б, г, д - фрагменты разновозрастных головок, в, е, ж - разновозрастные головки; з - скопления зрелых конидий на поверхности головки.
верхности (Рис. 1 е, стрелка). Также наблюдали гифы с довольно многочисленными, равномерно расположенными мелкими каплевидными выделениями, очевидно, слизи, на их поверхности (Рис. 1 ж, стрелки), с продольными неглубокими складками (Рис. 1 ж, головки стрелок), с невысокими частыми коническими выростами (Рис. 1 е, 1) и просто гладкие (Рис. 1 е, 2). В гифах средней (Рис. 1 е) и центральной зрелых частей колонии гриба четко выделялся контур септ. В средней спороносящей части колонии гриба (Рис. 1 и) с многочисленными формирующимися конидиеносцами и разновозрастными конидиогенными аппаратами характер пространственной ориентации гиф оставался без изменений. Появлялись скопления сильнодефор-мированных, стареющих или отмерших клеток гиф (Рис. 1 з, стрелки). Центральная часть колонии состояла из сильно смятых, отмерших гиф. Продольный срез изучаемого в сканирующем электронном микроскопе кусочка аспергилла демонстрирует высокую плотность расположения гиф субстратного мицелия (Рис.1 и, стрелка).
Конидиеносец. Формирующиеся конидиеносцы различались между собой по структуре поверхности. Последняя могла быть мелкозернистой (Рис. 1 к), морщинистой (Рис. 1 л) или гладкой (Рис. 2 а, стрелка). Закончившие рост конидиеносцы (Рис. 2 ж) имели высоту 1,6-3 мм, а ширину - 14-20 мкм. Со временем апекс конидиеносца пузыревидно вздувался, формируя зачаток головки конидиогенного аппарата. Изодиаме-трический рост последнего приводит к формированию шаровидной (5-7 мкм) формы головки, на поверхности которой будут формироваться стеригмы.
Конидиогенный аппарат. На поверхности зрелых головок конидиогенных аппаратов изучаемого штамма А. niger происходило формирование двух рядов стеригм (метул и фиалид). Заложение метул (стеригм первого ряда) начиналось с появления на поверхности головки многочисленных небольших вздутий клеточной стенки, расположенных в шахматном порядке, что было описано и для другого штамма А. niger [3]. Зачатки метул росли синхронно апикальным ростом, по его завершении они имели цилиндрическую форму и размеры, соответственно, 8-10 х 60-70 мкм. Закончившие рост метулы (Рис. 2 б, в) располагались довольно плотно относительно друг друга, структура поверхности их клеточных стенок - мелкозернистая. Между ними довольно часто выявлялась слизь, имеющая пластинчатую форму (Рис. 2 г).
Апексы закончивших рост метул претерпевали последующий апикальный асинхронный рост (Рис. 2 г), что приводило к формированию фиалид (стеригм второго ряда). Закончившие рост фиалиды имели цилиндрическую форму, однако по размерам (8-9 х 20-60 мкм) они были несколько меньше метул. В до-
вольно протяженной апикальной части фиалид также асинхронно происходили закладка и последующее формирование конидий (Рис. 2 г, стрелки). Формирование первой конидии начиналось с образования небольшого апикально растущего вздутия (инициаль конидии) в верхней части фиалиды (Рис. 2 д, стрелки). Позже апикальный рост инициали конидии сменялся на изодиаметрический, в ходе которого на ее поверхности формировались элементы скульптуры (Рис. 2 з). По завершении роста конидии приобретали сферическую (Рис. 2 з), реже - слабодисковидную форму, максимальные размеры их варьировали от 4 до 5 мкм. Элементы слоя орнаментации имели форму густо расположенных шипиков либо радиально ориентирующихся довольно протяженных ребер. Аналогичное строение структуры поверхности характерно для зрелых конидии других штаммов А. niger [2-4 и др.]
Зрелые в период конидиогенеза конидиальные головки имели диаметр от 700 до 800 мкм и четко очерченную сферическую форму (Рис. 2 е, ж). Они покрыты большим числом зрелых конидий, иногда расположенных в коротких цепочках.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Данные настоящего исследования показывают качественные различия в структуре поверхности латеральных клеточных стенок зрелых гиф мицелия изученного штамма А. niger, которые обусловлены различиями в их метаболизме, возможности синтезировать и секретировать разные типы внеклеточных метаболитов. Это наблюдение коррелирует с данными о наличии глубоких различий на ультраструктурном уровне внутреннего строения зрелых клеток разных гиф в пределах одной колонии как А. niger [5], так и других патогенных видов аспергиллов [6-10]. Выявленные различия в строении клеточных стенок растущих ко-нидиеносцев можно объяснить различиями в структуре латеральных клеточных стенок зрелых клеток гиф, которые стали основой для их закладки и последующего формирования. Иными словами, ультраструктурная гетерогенность в строении клеточных стенок зрелых клеток гиф воздушного мицелия объекта настоящего исследования обусловливает и различия в строении таковой конидиеносцев.
Для конидиогенных аппаратов изученного штамма А. nigerхарактерно синхронное формирование метул и асинхронное - фиалид. Это присуще для ранее изученного нами штамма А. niger [3]. Синхронное развитие метул было свойственно и для других видов аспергил-лов [А. giganteus : 11, А. т<Шат: 12, А. сЫу&ж: 13 и др.]. Асинхронное формирование конидий, выявленное для конидиогенных аппаратов объекта настоящего исследования, мы объясняем различиями в возрасте фи-алид, обусловленным не одновременным их ростом и развитием.
ЛИТЕРАТУРА
1. Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Киев: Наук. Думка. 1988: 204 с. [Bilaj V.I., Koval' EH.Z. Aspergilly. Kiev: Nauk. Dumka. 1988: 204 s. (In Russ)].
2. Hoog G.S. de, et al. Atlas of clinical fungi (a recent electronic version 3.1, 2011).
3. Степанова А.А., Синицкая И.А. Морфогенез конидиогенного аппарата Aspergillus niger по данным электронной микроскопии. Проблемы медицинской микологии. 2004; 6 (2): 37-48. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A. Morfogenez konidiogennogo apparata Aspergillus niger po dannym ehlektronnoj mikroskopii. Problemy medicinskoj mikologii. 2004; 6 (2): 37-48 (In Russ)].
4. Tiedt L.K. Electron microscopic study of conidiogenesis and wall formation of conidia of Aspergillus niger. Mycol. Res. 1993; 97 (12): 1459-1462.
5. Степанова А.А., Синицкая И.А. Ультраструктура клеток Aspergillus niger. Вегетативный мицелий. Проблемы медицинской микологии. 2003; 5 (4): 32-39. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A. Ul'trastruktura kletok Aspergillus niger. Vegetativnyj micelij. Problemy medicinskoj mikologii. 2003; 5 (4): 32-39 (In Russ)].
6. Степанова А.А., Синицкая И.А., Авдеенко Ю.Л. Субмикроскопическое изучение клеток вегетативного мицелия Aspergillus fumigatus. Проблемы медицинской микологии. 2004; 6 (3): 34-40. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A., Avdeenko YU.L. Submikroskopicheskoe izuchenie kletok vegetativnogo miceliya Aspergillus fumigatus. Problemy medicinskoj mikologii. 2004; 6 (3): 34-40 (In Russ)].
7. Степанова А.А., Синицкая И.А. Ультраструктура клеток вегетативного мицелия Aspergillus flavus, выращенного in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2006; 8 (1): 40-45. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A. Ul'trastruktura kletok vegetativnogo miceliya Aspergillus flavus, vyrashchennogo in vitro. Problemy medicinskoj mikologii. 2006; 8 (1): 40-45 (In Russ)].
8. Степанова А.А., Синицкая И.А. Цитология клеток выращенного in vitro вегетативного мицелия Aspergillus versicolor. Проблемы медицинской микологии. 2006; 8 (3): 22-28. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A. Citologiya kletok vyrashchennogo in vitro vegetativnogo miceliya Aspergillus versicolor. Problemy medicinskoj mikologii. 2006; 8 (3): 22-28 (in Russ)].
9. Степанова А.А., Синицкая И.А. Электронно-микроскопическое изучение клеток вегетативного мицелия Aspergillus terreus. Проблемы медицинской микологии. 2007; 9 (3): 26-33. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A. Elektronno-mikroskopicheskoe izuchenie kletok vegetativnogo miceliya Aspergillus terreus. Problemy medicinskoj mikologii. 2007; 9 (3): 26-33 (In Russ)].
10. Степанова А.А., Васильева Н.В., Чжан Ф., Тонг Д. Ультраструктурное исследование клеток вегетативного мицелия Aspergillus candidus, выращенных in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2016; 18 (2): 23-27. [Stepanova A.A., Vasil'eva N.V, CHzhan F., Tong D. Ul'trastrukturnoe issledovanie kletok vegetativnogo miceliya Aspergillus candidus, vyrashchennyh in vitro. Problemy medicinskoj mikologii. 2016; 18 (2): 23-27 (In Russ)].
11. Trinci A.P.J., Peat A., Banbury G.H. Fine structure of phialidу and conidiophore development in Aspergillus giganteus. Ann. Bot. 1968; 32 (2): 241-249.
12. Hanlin R.T. Phialide and conidium development in Aspergillus clavatus. Amer. J. Bot. 1976; 63: 144-155.
13. Mims C.W., Richardson E.A., Timberlake W.E. Ultrastuctural analysis of conidiophore development in the fungus Aspergillus nidulans using freeze-substitution. Protoplasma. 1988; 144: 132-141.
Поступила в редакцию журнала: 02.03.2018
Рецензент: Л.Е. Сергеева
