CC BY
56УДК 57.086.3: 582.282.123.4
СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ASPERGILLUS FUMIGATUS FRES.
Степанова А.А. (зав. лаб.)*, Чилина Г.А. (зав. лаб.), Баракаева Ф.Р. (студентка)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2018
Изучены особенности строения клеток воздушного вегетативного мицелия и конидиогенного аппарата у Aspergillus fumigatus Fres. (штамм РКП^-1248) с помощью сканирующей электронной микроскопии. Клеточные стенки зрелых клеток гиф мицелия имели складчатую мелкозернистую текстуру, что обусловлено наличием на их поверхности внеклеточного матрикса. Конидиеносцы и головки конидиогенных аппаратов на всех стадиях развития снабжены гладкими клеточными стенками. Показано, что стеригмы (фиалиды) конидиогенных аппаратов у A. fumigatus закладываются и формируются синхронно, тогда как конидии - асинхронно. Зрелые конидии имели на своей поверхности густо расположенные шипики.
Ключевые слова: Aspergillus fumigatus, клетки гиф, конидиоген-ный аппарат, сканирующая электронная микроскопия, ультраструктура
SCANNING ELECTRON MICROSCOPY OF ASPERGILLUS FUMIGATUS FRES.
Stepanova A.A. (head of the laboratory), Chilina G.A. (head of the laboratory), Barakaeva F.R. (student)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of NorthWestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2018
Peculiarities of the structure of aerial hyphal cells and conidiogenous apparatus of the strain of Aspergillus fumigatus Fres. (РКП^-1228) with using of scanning electron microscopy were studied. Cell walls of mature hyphal cells of mycelium had folded fine-granular texture that was caused by presence on their surface extracellular mаtrix. Stipes and the heads of conidiogenous apparatus in all stages of development posses with smooth cell walls. It was shown that sterigmes of the conidiogenous apparatus of A. fumigatus were initiated and developed synchronously whereas conidia -asynchronously. Mature mnidia had on the surfaces densely located spikes.
Key words: Aspergillus niger, conidiogenous apparatus, hyphal cells, scanning electron microscopy, ultrastructure
Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, e-mail: [email protected]
ВВЕДЕНИЕ
Внедрение молекулярно-генетических методов в диагностику микозов, безусловно, способствовало выявлению новых видов, повышению эффективности диагностических исследований, особенно в случаях микотических инфекций, обусловленных редкими и «криптическими» видами. Однако морфологические исследования нитчатых патогенных грибов по-прежнему имеют важное значение в диагностике инвазивного аспергиллеза (возбудитель - Aspergillus fumigatus).
В связи с этим метод сканирующей электронной микроскопии имеет неоспоримое значение для изучения биологического разнообразия грибов, особенностей их микроморфологии, выявления признаков тонкого строения, необходимых для их систематики.
Ранее [1] с помощью сканирующего электронного микроскопа мы исследовали строение клеток колоний A. fumigatus штамма PKnrF-1172, выделенного из промывных вод больного аспергиллезом. За последнее время был достигнут значительный прогресс в методах подготовки образцов и заметное совершенствование сканирующих микроскопов. Отметим, что несмотря на это, вопрос об особенностях штаммных различий в микроморфологии A. fumigatus на электронно-микроскопическом уровне остается малоизученным, что и стало целью настоящего исследования.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследовали культуру A. fumigatus Fres. (штамм PKnrF-1248) из коллекции НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, выделенную из мокроты пациента с инвазивным аспергиллезом (Л., 53 года). Данный вид гриба был идентифицирован методом тар-гетного ДНК-секвенирования по Ф. Сэндржеру [CISI MM-18A] по локусу b-tubulin. Культуру гриба выращивали на среде Чапека в термостате при 27 °С. Через 5, 10 и 20 дней после посева кусочки агаризированной среды с разными участками колонии гриба фиксировали для целей сканирующей электронной микроскопии в 3% растворе глутаральдегида на какодилатном буфере (рН 7,2), затем пост-фиксировали в 1% растворе осмиевой кислоты, проводили через серию спиртов возрастающей концентрации (30, 50 и 70°), высушивали при критической точке на приборе НСР-2 и напыляли золотом на IB-3. Образцы изучали в сканирующем электронном микроскопе JSM 35.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Вегетативный мицелий. Гифы воздушного мицелия по самому краю колонии расположены по поверхности питательной среды рыхло и хаотично (Рис. 1 а). Они извилистые, одиночные либо в группах по 2-3, часто контактировали между собой. Диаметр гиф варьировал от 1,5 до 3 мкм. В этой части мицелия встречались апикально растущие концевые клетки мицелия (Рис. 1 а, стрелки). Картины контакта апикальных сегментов гиф, ранее выявленные нами для колонии A. niger [2], для A. fumigatus не характерны. Структура поверхности клеточных стенок молодых гиф гладкая либо слегка складчатая. Только в этой части колонии ввиду рыхлого расположения гиф воздушного мицелия можно было наблюдать поверхность питательной
Í--
среды и контуры гиф субстратного мицелия (Рис. 1 а, головки стрелок), локализующиеся в толще твердой питательной среды.
По мере продвижения к центру колонии плотность расположения гиф мицелия заметно возрастала (Рис. 1 г, д), их диаметр был равен в среднем 4 мкм. Со временем довольно гладкая поверхность гиф воздушного мицелия (1 б) становилась сильно «складчатой», с характерной мелкозернистой текстурой (Рис. 1 в). Так выглядит характерный для зрелых клеток воздушного мицелия [1] и тканевых форм этого вида [3-6] хорошо развитый внеклеточный матрикс, который имеет специфичную структуру и представляет собой интегральную часть клеточной стенки [7]. Интересно, что зрелые клетки гиф А. niger в сканирующем микроскопе [2] также имели «складчатую» мелкозернистую текстуру, что также обусловлено присутствием внеклеточного матрикса. В той части колонии гриба, где начинали встречаться редкие конидиогенные аппараты (Рис. 1 г, д), гифы разного диаметра располагались хаотично, постепенно «заслоняя» собой поверхность питательной среды.
В средней спороносящей части колонии гриба (Рис. 1 и) с многочисленными формирующимися ко-нидиеносцами и разновозрастными конидиогенными аппаратами характер пространственной ориентации гиф оставался без изменений. Появлялись скопления сильно деформированных, стареющих или отмерших клеток гиф. Центральная часть колонии состояла из сильно смятых отмерших гиф (Рис. 1 н), на поверхности которых складчатая мелкозернистая текстура уже не выявлялась. Это обусловлено разрушением внеклеточного матрикса в ходе старения, что было показано и методами трансмиссионной электронной микроскопии [8].
Конидиогенный аппарат. Формирующиеся кони-диеносцы локализовались довольно скученно. Они, как и закончившие рост конидиеносцы, имели гладкие клеточные стенки (Рис. 1 г, ж), что было характерно и для ранее изученного штамма А. fumigatus [1]. Высота закончивших рост конидиеносцев варьировала от 300 до 500 мкм, а ширина - от 5 до 8 мкм. По завершении роста конидиеносца его апекс пузыревидно вздувался, формируя зачаток головки конидиогенного аппарата (Рис. 1 а). Изодиаметрический рост последней приводил к формированию головки обратно-грушевидной формы. Вскоре в апикальной части закончившей рост головки на 2/3 ее поверхности начинали синхронно и в шахматном порядке формироваться зачатки стеригм (фиалид, рис. 1 е). Закладка стеригм и у конидиеносцев другого ранее изученного штамма А. fumigatus [1], а также А. niger [2, 8], происходила синхронно и в шахматном порядке.
В расширенном апексе зачатки стеригм растут синхронно апикальным ростом, по его завершении они имели цилиндрическую форму и размеры, соответственно, 6-8 х 2-3 мкм. Стеригмы по завершении роста располагались довольно плотно относительно друг друга (Рис. 1 ж, з, и), структура поверхности их клеточных стенок была мелкозернистой. В нижней трети стеригм выявляли умеренные скопления гомогенной слизи (Рис. 1 ж, з, стрелки).
В апексе стеригм закладка первых зачатков конидий происходила синхронно (Рис. 1 ж), тогда как по-
следующих - асинхронно (Рис. 1 з, и). Формирование конидии начиналось с образования небольшого вздутия (инициаль конидии) в верхней части стеригмы (Рис. 1 ж), изодиаметрический рост которой приводил к формированию сферической формы (Рис. 1 з) зрелой конидии (от 2,5 до 3 мкм). На ее поверхности отмечали элементы слоя орнаментации в виде густо расположенных невысоких шипиков (Рис. 1 з). Сходное строение характерно для зрелых конидий других штаммов А. fumigatus [1, 9 и др.]. На самом деле, созревание конидий аспергиллов продолжалось после того, как они покидали головку конидиогенного аппарата. Много-численные скопления одиночных либо в группах зрелых или созревающих конидий можно было наблюдать на поверхности питательной среды (Рис. 1 к). При созревании конидий происходило их обезвоживание, при этом их размеры становились меньше, а элементы скульптуры - более выраженными.
Конидиальные головки в период формирования конидий имели диаметр от 50 до 400 мкм. Они колонко-видные, несут на своей поверхности многочисленные зрелые конидии, не образующие цепочки (Рис. 1 з). Последние не характерны и для конидий другого штамма А. fumigatus [1]. При изучении на малом увеличении сканирующего электронного микроскопа продольного среза центральной части колонии гриба наблюдали высокую плотность расположения конидиогенных аппаратов (Рис. 1 м, 1). Глубина проникновения гиф субстратного мицелия в плотную питательную среду небольшая, составляла в среднем 50 мкм (Рис. 1 м, 2). Клеточная стенка конидиеносцев на завершающих стадиях конидиогенеза подвергалась старению. При этом она сильно деформировалась, и на ее поверхности появлялись довольно глубокие регулярно расположенные продольные складки (Рис. 1 л, стрелки).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выявленная нами складчатая тонко-грану-лярная текстура поверхности зрелых клеток гиф воздушного мицелия А. fumigatus, в отличие от ранее изученного другого штамма этого вида [7], обусловлена наличием внеклеточного матрикса, отсутствующего на поверхности конидиеносцев и головок конидиогенных аппаратов данного вида, а также субстратного мицелия. Возможно, это обусловлено усовершенствованием методов подготовки образцов для сканирующей электронной микроскопии, а также межштаммовыми различиями. Для конидиогенных аппаратов изученного штамма А. fumigatus характерно синхронное формирование стеригм (фиалид) и асинхронное - конидий, что типично и для ранее изученного нами штамма этого вида гриба [1]. Зрелые конидии А. fumigatus имели характерную шиповатую скульптурированную поверхность.
Рис. 1. Ультраструктура клеток вегетативного мицелия и конидиеносцев А. /ит/даШ5 (РКПГР- 1248) в сканирующем электронном микроскопе. Условные обозначения: Гф - гифа(ы), ЗГ - зрелая головка, ЗК - зачатки конидий, ЗСт - зачатки стеригм, К - конидии, КА - конидиальные аппараты, Кн - конидиеносец(ы), Ст - стеригма(ы).
ЛИТЕРАТУРА
1. Степанова А.А., Синицкая И.А. Цитологическое изучение морфогенеза конидиогенного аппарата Aspergillusfumigatus. Проблемы медицинской микологии. 2005; 7 (3): 41-49. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A. Citologicheskoe izuchenie morfogeneza konidiogennogo apparata Aspergillus fumigatus. Problemy medicinskoj mikologii. 2005; 7 (3): 41-49 (In Russ)].
2. Степанова А.А., Васильева Н.В., Чилина Г.А. Сканирующая электронная микроскопия Aspergillus niger. Проблемы медицинской микологии. 2018; 20 (2): 40-44. [Stepanova A.A., Vasil'eva N.V., Chilina G.A. Skaniruyushchaya ehlektronnaya mikroskopiya Aspergillus niger. Problemy medicinskoj mikologii. 2018; 20 (2): 40-44 (In Russ)].
3. Степанова А.А., Босак И.А., Синицкая И.А. Цитологическое исследование Aspergillus fumigatus Fres. в легких мышей. Проблемы медицинской микологии. 2013; 15 (1): 52-58. [Stepanova A.A., Bosak I.A., Sinickaya I.A. Citologicheskoe issledovanie Aspergillus fumigatus Fres. v legkih myshej. Problemy medicinskoj mikologii. 2013; 15 (1): 52-58 (In Russ)].
4. Степанова А.А., Васильева Н.В., Борзова Ю.В. и др. Электронно-микроскопическое изучение аспергиллеза легких человека на примере архивного материала. Проблемы медицинской микологии. 2014; 16 (3): 70-79. [Stepanova A.A., Vasil'eva N.V, Borzova Y. V. i dr. Elektronno-mikroskopicheskoe izuchenie aspergilleza legkih cheloveka na primere arhivnogo materiala. Problemy medicinskoj mikologii. 2014; 16 (3): 70-79 (In Russ)].
5. Stepanova А.А., Vasilyeva N.V., Zhang F., et al. Electron-microscopic investigations of invasive aspergillosis, caused with Aspergillus fumigatus. Problems in medical mycoclogy. 2015; 17 (3): 38-41.
6. Степанова A.A., Васильева Н.В., Чжан Ф. и др. Ультраструктурная организация Aspergillus spp. в тканях легких пациентки. Проблемы медицинской микологии. 2018; 20 (2): 29-39. [Stepanova A.A., Vasil'eva N.V., Chzhan F. i dr. Ul'trastrukturnaya organizaciya Aspergillus spp. v tkanyah legkih pacientki. Problemy medicinskoj mikologii. 2018; 20 (2): 29-39 (In Russ)].
7. Степанова А.А., Синицкая И.А., Авдеенко Ю.Л. Субмикроскопическое изучение клеток вегетативного мицелия Aspergillus fumigatus Fres. Проблемы медицинской микологии. 2004; 6 (3): 34-40. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A., Avdeenko Y.L. Submikroskopicheskoe izuchenie kletok vegetativnogo miceliya Aspergillus fumigatus Fres. Problemy medicinskoj mikologii. 2004; 6 (3): 34-40 (In Russ)].
8. Степанова А.А., Синицкая И.А. Ультраструктурные аспекты старения клеток некоторых видов рода Aspergillus. Проблемы медицинской микологии. 2009; 11 (4): 24-29. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A. Ul'trastrukturnye aspekty stareniya kletok nekotoryh vidov roda Aspergillus. Problemy medicinskoj mikologii. 2009; 11 (4): 24-29 (In Russ)].
9. Pihet M., Vandeputte P., Tronchin G., et al. Melanin is an essential component for the integry of the cell wall Aspergillus fumigatus conidia. BMC Microbiology. 2009; 9: 177.
10. Степанова А.А., Синицкая И.А. Морфогенез конидиогенного аппарата Aspergillus niger по данным электронной микроскопии. Проблемы медицинской микологии. 2004; 6 (2): 37-48. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A. Morfogenez konidiogennogo apparata Aspergillus niger po dannym ehlektronnoj mikroskopii. Problemy medicinskoj mikologii. 2004; 6 (2): 37-48 (In Russ)].
Поступила в редакцию журнала:19.11.2018
Рецензент: В.С. Митрофанов
