CC BY
46DOI:10.24412/1999-6780-2019-4-3-7
УДК 582.28:57.012.4:57.086.3
ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ МУКОРМИКОЗА LICHTHEIMIA CORYMBIFERA IN VIVO
Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой), Степанова А.А. (зав. лаб.)*, Богомолова Т.С. (зав. лаб.), Босак И.А. (с.н.с.), Авдеенко Ю.Л. (с.н.с.), Чилина Г.А. (зав. лаб.), Выборнова И.В. (н.с.), Аак О.В. (в.н.с.), Соловьева Г.И. (в.н.с.), Рябинин И.А. (м.н.с.), Павлова И.Э. (н.с.), Спиридонова В.А. (н.с.) НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СевероЗападного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
Изученные клетки гиф тканевых форм Lich-theimia corymbifera в легких мышей были сходны по числу и строению ядер, митохондрий, по типу и количеству аккумулируемых запасных веществ. Для зрелых клеток тканевых форм L. corymbifera характерно большое разнообразие ультраструктуры клеточных стенок. Отмечено утолщение клеточных стенок мицелия гриба in vivo в сравнении с культуральной формой.
Ключевые слова: in vivo, Lichtheimia corymbifera, легкие мышей, световая микроскопия, трансмиссионная электронная микроскопия, ультраструктура, морфология
CYTOLOGICAL STUDY OF THE CAUSATIVE AGENT OF MUCORMYCOSIS LICHTHEIMIA CORYMBIFERA IN VIVO
Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department), Stepanova А.А. (head of the laboratory), Bogomolova T.S. (head of the laboratory), Bosak I.A. (senior scientific collaborator), Avdeenko Y.L. (senior scientific collaborator), Chilina G.A. (head of the laboratory), Vybornova I.V. (scientific collaborator), Aak
0.V. (leading scientific collaborator), Solovieva G.I. (leading scientific collaborator), Ryabinin
1.A. (junior scientific collaborator), Pavlova I.E. (scientific collaborator), Spiridonova V.A. (scientific collaborator)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, NorthWestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint Petersburg, Russia
The studied hyphal cells of the Lichtheimia corymbifera tissular forms were similar in number and the structure of nuclei, mitochondria, in type and quantity of the accumulated storage substances. For the mature cells of L. corymbifera big variability in the cell walls ultrastructure was typical what can be considered as the protective mechanism in response to influence of the cells of immune system of murine lungs.
Key words: in vivo, Lichtheimia corymbifera, light and transmission electron microscopy, murine lung, ultrastructure
Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, e-mail: amaliya.stepanova@szgmu.ru
ВВЕДЕНИЕ
Наиболее частыми этиологическими агентами му-кормикоза являются: Rhizopus arrhizus (прежнее название - R. oryzae), Rhizopus microsporus, Rhizomucor pusillus, Lichtheimia corymbifera (прежнее название - Absidia corymbifera). Представители различных родов мукоромицетов отличаются по морфологическим признакам, выявляемым при световой микроскопии: ветвление спорангиеносцев, форма спорангиев и ко-лумелл, наличие и размеры апофиз, расположение и разветвленность ризоидов. Наиболее выраженные отличия наблюдаются у Lichtheimia spp.: интенсивное ветвление мицелия, грушевидная форма спорангиев, коническая форма и верхушечные выросты колумелл, крупные апофизы [1]. Ранее виды мукоромицетов, известные в настоящее время как Lichtheimia spp., относились к термотолерантным видам рода Absidia, семейству Mucoraceae [1], но в 2009 г. были переведены в семейство Lichtheimiaceae, род Lichtheimia [2] на основании филогенетических, физиологических и морфологических характеристик.
Сведения о различиях между родами и видами мукоромицетов на уровне ультраструктуры ограничены [2]. Обнаруженные особенности ультраструктуры клеток L. corymbifera в условиях культуры [3, 4] явились предпосылкой для проведения настоящего исследования, цель которого - изучить ультраструктуру тканевых форм гриба на модели экспериментального мукор-микоза легких [5].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для заражения мышей использовали штамм L. corymbifera (Cohn) Vuill. (PKnTF-1601/1966) из коллекции НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, выделенный от больного с риноцеребральным мукор-микозом. Культуру гриба выращивали на агаризиро-ванной среде Сабуро в термостате при 28 °С.
В качестве экспериментальных животных были взяты самцы беспородных белых мышей с массой тела 18-20 г. Для моделирования иммунодефицитного состояния (нейтропения) животным внутрибрюшинно вводили циклофосфан в дозе 150 мг/кг четырёхкратно (-3, 0, 4 и 8 дни). Заражение мышей выполняли путем интраназального введения 50 ц1 взвеси спор гриба в концентрации 1-107 КОЕ/мл. Оценку наличия муко-ромицета в ткани легких мышей осуществляли путем посева части легких погибших животных на среду агар Сабуро. Кусочки легких мышей, погибших через 8 суток от начала эксперимента, фиксировали для световой микроскопии по стандартной методике, описанной ранее [4]. Окраску срезов проводили по методу Гомори-Грокотт и гематоксилин-эозином (Г-Э). Съемку препаратов выполняли на световом микроскопе AxioLab.A1 (фирма Zeiss, Германия).
Для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) из парафиновых срезов вырезали участки с наибольшей концентрацией гиф гриба, которые депа-рафинировали в ксилоле и фиксировали для ТЭМ по методике, отработанной и описанной нами ранее [5]. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме Ultratome 2088 (LKB, Bromma, Sweden), окрашивали уранилаце-татом и цитратом свинца, а затем изучали в ТЭМ Jem 100 SX (Jeol, Tokyo, Japan).
ï--
з
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Гистологические данные. При гистологическом исследовании легких погибших мышей (Г-Э, Гомори-Грокотт) гифы гриба обнаружены в ткани легкого (Рис. 1 а), сосудах (1 б) и просвете бронхов. В кровеносных сосудах отмечали скопления широких (7-8 мкм) гиф, которые заполняли весь их просвет и располагались плотно и хаотично относительно друг друга. В просвете бронхов наблюдали лишь редкие сильно деформированные и короткие отрезки гиф. В ткани легкого имели место обширные участки некроза с многочисленными (параллельно и беспорядочно ориентированными относительно друг друга) скоплениями протяженных прямых широких (8-10 мкм) гиф, ветвящихся под прямым углом (Рис. 1 а, стрелка). Воспалительная реакция слабая, встречались немногочисленные макрофаги и лейкоциты. В ткани легкого преобладали альтеративные изменения. Элементы спороношения на срезах легких отсутствовали.
Ультраструктура L. corymbifera in vivo. На срезах легких мышей выявлены гифы несептированного мицелия диаметром 7-10 мкм, формирующие многочисленные скопления. Гифы мицелия различались между собой по характеру содержимого. Они находились на разных стадиях развития: роста, созревания, зрелости и старения. Довольно часто наблюдали полностью отмершие, часто сильно искривленные гифы мицелия без цитозоля, с обрывками мембран, без плазмалеммы, заполненные тонко-фибриллярным содержимым (Рис. 1 в). Клеточные стенки отмерших и отмирающих гиф могли быть равномерно утолщены (0,3 мкм), плотные, умеренной электронной плотности либо с локальными (Рис. 1 г, д) электронно-плотными утолщениями, иногда причудливой конфигурации на продольном срезе (Рис. 1 д).
Ядра одиночные (Рис. 1 е, ж) либо в небольших группах (обычно приурочены к клеточной стенке), округлой (2,3 мкм) или эллипсоидной (2,0 x 2,5 мкм) формы. В нуклеоплазме преобладал диффузный хроматин. Ядрышко одно, эксцентричное, крупное (0,5 мкм), довольно плотное, с неровным контуром и преобладанием гранулярного компонента (Рис. 1 е). Оболочка ядра ровная либо слегка волнистая, несет редкие рибосомы.
Митохондрии многочисленные, располагались в группах от 5 до 35 и находились в тесном контакте друг с другом (Рис. 1 е). Они округлой (1,2-1,5 мкм) либо эллипсоидной (0,4-0,5 мкм) формы. Матрикс органелл по электронной плотности сходен с цитозолем. Кристы многочисленные, расположены плотно, с более светлым содержимым. Митохондриальный ретикулум не обнаружен.
Вакуоли многочисленные (Рис. 1 з), равномерно распределены по площади среза, мелкие, светлые, неправильной формы, с контрастным тонопластом. Чаще всего встречались профили гиф с небольшим числом светлых вакуолей средних размеров разнообразной формы (Рис. 1 и) либо с одной или несколькими крупными с аналогичным содержимым (Рис. 1 ж). Часто наблюдали вакуоли с картинами локального автолиза органелл или мелких липидных включений (1 и, стрелки).
Из запасных веществ в цитозоле интактных гиф обнаружили только липидные включения умеренной
плотности, округлой или неправильной формы (Рис. 1 е, и). Для просветов молодых гиф с большим числом мелких вакуолей и митохондрий характерно наличие довольно мелких (0,2-0,3 мкм) липидных включений. В профилях гиф с вакуолями средних размеров, помимо описанных липидных включений, имели место более крупные (3,0-4,0 мкм). В зрелых гифах формировались крупные липидные включения (Рис. 1 к), заполняющие весь их просвет.
В цитозоле клеток отмечали редкие мелкие светлые пузырьки и короткие цистерны агранулярного эндо-плазматического ретикулума. Одиночные цистерны Гольджи отсутствовали. Цитозоль отличался умеренной электронной плотностью, насыщен свободными рибосомами в виде моно- и полисом. Плазмалемма трехслойная, асимметричная, плотно прилегала к клеточной стенке.
Отличительной чертой ультраструктуры зрелых гиф тканевой формы гиф мицелия L. corymbifera было то, что они сильно различались между собой по строению (толщина, форма, электронная плотность) клеточных стенок. У объекта настоящего исследования обнаружено три основных типа строения клеточных стенок зрелых гиф: 1) тонкие - в среднем 0,3 мкм (Рис. 1 в, е, и, к), однослойные, темные, гомогенные; 2) равномерно утолщенные - в среднем 2,5 мкм (Рис. 1 з), однослойные, темные, гомогенные; 3) неравномерно утолщенные (1,5-3,0 мкм), темные, разнообразной, часто причудливой (на поперечном срезе гифы) формы (Рис. 1 г, д, ж). Чаще выявляли клетки гиф с клеточными стенками третьего типа (70% от общего числа изученных), реже (5%) - первого. Гифы с клеточными стенками второго типа составляли 15% от общего числа исследованных. Аналогичное разнообразие в строении латеральных клеточных стенок было выявлено для тканевых форм Lichtheimia spp. [4]. Эти данные свидетельствуют о большой пластичности латеральных стенок клеток мицелия объекта настоящей работы, что резко отличает его от тканевых форм Aspergillus fumigatus [6-10].
В гифах мицелия тканевых форм L. corymbifera септы (трехслойные сплошные, без пор), характерные для спорангиеносцев этого штамма в условиях культуры [3], не обнаружены.
При переходе гиф к старению цитозоль просветлялся и впоследствии полностью исчезал, существенно уменьшалась численность органелл и запасных веществ. Ядра теряли групповое расположение, размеры ядрышка уменьшались, нуклеоплазма просветлялась. Конденсированный хроматин формировал крупные глыбки (Рис. 2 а), равномерно распределенные по площади среза ядра. Контур ядерной оболочки становился извилистым. Матрикс митохондрий просветлялся, резко сокращалось число крист, их форма становилась неправильной. Тонопласт вакуолей и плазмалемма распадались на фрагменты, что приводило к формированию везикулярных элементов. Клеточные стенки утоньшались, теряли слоистость, электронную плотность и присущую им форму. В них появлялись локальные разрывы (Рис. 2 а, стрелка), что было нами ранее выявлено и для культуральных форм этого вида гриба [3].
Редко можно было наблюдать ранние стадии контакта макрофагов с участком гифы (Рис. 2 г). Чаще
Рис. 1. а - фрагмент ткани легкого мыши после 8 суток от начала инфекции (стрелкой показано латеральное ветвление); б - скопление гиф гриба в сосуде ткани легкого мыши; в - к - особенности ультраструктуры гиф, инфицирующих ткань легкого мыши. а, б - окраска по Гомори-Грокотт. Условные обозначения здесь и на рисунке 2: В - вакуоль; Гф - гифа; КС -клеточная стенка; ЛВ - липидное включений; М - митохондрия; Мф - макрофаг; Я - ядро; Яд - ядрышко.
Рис. 2. Особенности строения клеток гиф L. corymbifera (a) и макрофагов (б-ж) в ТЭМ.
всего выявляли макрофаги, содержащие отрезки отмерших гиф. В таких случаях содержимое макрофагов было интактным (Рис. 2 е, ж, макрофаг слева внизу). Иногда встречали макрофаги, содержащие интактные отрезки гиф (Рис. 2 б). Наиболее часто обнаруживали интактные клетки макрофаги (Рис. 2 д) без гиф гриба и признаков активности (Рис. 2 д). «Противостояние» гиф гриба макрофагам ткани легкого сопровождалось значительным утолщением латеральных клеточных стенок первых вплоть до полного сужения их просвета (Рис. 2 б, в).
ВЫВОДЫ
Гистологические и ТЕМ исследования показали наличие в просвете бронхов, сосудах и тканях легких мышей через 8 суток после заражения присутствие многочисленных гиф Ь. сотутЫ/вта. Наличие в легких
элементов гриба вызывало выраженные альтератив-ные изменения и слабовыраженную воспалительную реакцию.
При сравнении ультраструктуры клеток вегетативного мицелия тканевых и культуральных форм Ь. сотутЫ/вта выявили, что они сходны по числу и строению ядер, митохондрий и по типу аккумулируемых запасных веществ, но различались по строению клеточных стенок. Тканевые формы гриба, по сравнению с культуральными, аккумулировали больше липидных включений.
Данная работа выполнена в рамках Государственного задания «Изучение морфо-биологических особенностей патогенных мукоромицетов - возбудителей микозов у пациентов с иммунодефицитом» (2019-2021 гг.).
ЛИТЕРАТУРА
1. de Hoog G.S., Guarro F, Gene J., et al. Atlas of clinical fungi. 2019. clinicalfungi.org/BioloMicsInfo.aspx
2. Hawksworth D.L., Crous P.W., Dianese J.C., et al. Proposals 016-020 to amend the International Code of Botanical Nomenclature. Mycotaxon. 2009; 108:1-4. doi.org/10.5248/108.1
3. Васильева Н.А., Степанова А.А., Богомолова Т.С. и др. Цитологическое изучение Lichtheimia corymbifera. Проблемы медицинской микологии. 2019; 21 (3): 3-8. [Vasil'eva N.A., Stepanova A.A., Bogomolova T.S. i dr. Citologicheskoe izuchenie Lichtheimia corymbifera. Problemy medicinskoj mikologii. 2019; 21 (3): 3-8. (In Russ)]. mycology. szgmu.ru/files/№3_2019.pdf
4. Stepanova A.A., Vasilyeva N.V., Yamaguchi M., et al. Electron microscopy of autopsy material from the human brain cryptococcosis and AIDS. Problems in medical mycology. 2015; 17 (1): 35-40. mycology.szgmu.ru/files/№1_2015.pdf
5. 5. Васильева Н.В., Босак И.А., Богомолова Т.С. и др. Экспериментальная модель мукормикоза легких, обусловленного Lichtheimia ornate. Проблемы медицинской микологии. 2019; 21 (1): 3-6. [Vasil'eva N.V., Bosak I.A., Bogomolova T.S. i dr. Eksperimental'naya model' mukormikoza legkih, obuslovlennogo Lichtheimia ornate. Problemy medicinskoj mikologii. 2019; 21 (1): 3-6 (In Russ)]. mycology.szgmu.ru/images/1_2019.pdf.pdf
6. 5. Степанова А.А., Хостелиди С.Н., Аравийский Р.А. и др. Электронно-микроскопическое исследование Lichtheimia spp. in vivo и in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2012; 14 (4): 55-61. [Stepanova A.A., Hostelidi S.N., Aravijskij R.A. i dr. Elektronno-mikroskopicheskoe issledovanie Lichtheimia spp. in vivo i in vitro. Problemy medicinskoj mikologii. 2012; 14 (4): 55-61 (In Russ)]. mycology.szgmu.ru/files/MAPO_4_2012.pdf
7. 6. Loussert С., Schmitt С., Prevost M.-C., et al. In vivo biofilm composition of Aspergillus fumigatus. Cellular Microbiology. 2010; 12 (3): 405-410. doi:10.1111/j.1462-5822.2009.01409.x
8. 7. Степанова А.А., Босак И.А., Синицкая И.А. Цитологическое исследование Aspergillus fumigatus Fres. в легких мышей. Проблемы медицинской микологии. 2013; 15 (1): 52-58. [Stepanova A.A., Bosak I.A., Sinickaya I.A. Citologicheskoe issledovanie Aspergillus fumigatus Fres. v legkih myshej. Problemy medicinskoj mikologii. 2013; 15 (1): 52-58 (In Russ)]. mycology.szgmu.ru/files/MAPO_1_2013.pdf
9. 8. Степанова А.А., Васильева Н.В., Борзова Ю.В. и др. Электронно-микроскопическое изучение аспергиллеза легких человека на примере архивного материала. Проблемы медицинской микологии. 2014; 16 (3): 70-79. [Stepanova A.A., Vasil'eva N.V., Borzova Y.V. i dr. Elektronno-mikroskopicheskoe izuchenie aspergilleza legkih cheloveka na primere arhivnogo materiala. Problemy medicinskoj mikologii. 2014; 16 (3): 70-79 (In Russ)]. mycology.szgmu.ru/files/MAPO_3_2014.pdf
10. 9. Stepanova А.А., Vasilyeva N.V., Zhang F., et al. Electron microscopic investigations of invasive aspergillosis, caused with Aspergillus fumigatus. Problems in medical mycology. 2015; 17 (3): 38-41. mycology.szgmu.ru/files/№3_2015.pdf
11. 10. Степанова А.А., Васильева Н.В., Босак И.А. и др. Особенности строения Aspergillus fumigatus при экспериментальном аспергиллезе у мышей. Проблемы медицинской микологии. 2016; 18 (4): 40-52. [Stepanova A.A., Vasil'eva N.V., Bosak I.A. i dr. Osobennosti stroeniya Aspergillus fumigatus pri eksperimental'nom aspergilleze u myshej. Problemy medicinskoj mikologii. 2016; 18 (4): 40-52 (in Russ)]. mycology.szgmu.ru/files/MAPO_№4_2016.pdf
12. 13. Schwartze V.U., Winter S., Shelest E., et al. Gene expansion shapes genome architecture in the human pathogen Lichtheimia corymbifera: an evolutionary genomics analysis in the ancient terrestrial mucorales (Mucoromycotina). PLoS Genet. 2014; 10 (8): e1004496. doi.org/10.1371/journal.pgen.1004496
Поступила в редакцию журнала 02.07.2019
Рецензент: О.В. Яковлева
