CC BY
12УДК 582.28:57.012.4:57.086.3
ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ LICHTHEIMIA CORYMBIFERA IN VITRO
Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой), Степанова А.А. (зав. лаб.)*, Богомолова Т.С. (зав. лаб.), Авдеенко Ю.Л. (с.н.с.), Босак И.А. (с.н.с.), Чилина Г.А. (зав. лаб.), Выборнова И.В. (н.с.), Аак О.В. (в.н.с.), Соловьева Г.И. (в.н.с.), Рябинин И.А. (м.н.с.), Павлова И.Э. (н.с.)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СевероЗападного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
При изучении ультраструктуры клеток гриба культуральных форм Lichtheimia corymbifera установлено, что они сходны по числу и строению ядер, митохондрий, по типу аккумулируемых запасных веществ и другим признакам. Для зрелых клеток L. corymbifera характерно наличие тонких латеральных клеточных стенок.
Ключевые слова: in vitro, Lichtheimia corymbifera, световая и трансмиссионная электронная микроскопия, ультраструктура
CYTOLOGICAL INVESTIGATION OF LICHTHEIMIA CORYMBIFERA IN VITRO
Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department), Stepanova А.А. (head of the laboratory), Bogomolova T.S. (head of the laboratory), Avdeenko Y.L. (senior scientific collaborator), Bosak I.A. (senior scientific collaborator), Chilina G.A. (head of the laboratory), Vybornova I.V. (scientific researcher), Aak O.V. (leading scientific collaborator), Solovieva G.I. (leading scientific collaborator), Ryabinin I.A. (junior scientific collaborator), Pavlova I.E. (scientific researcher)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, NorthWestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint Petersburg, Russia
Investigation of the hyphal cells ultrastructure of the cultural form of Lichtheimia corymbifera showed that they were similar in number and the structure of nuclei, mitochondria, accumulated storage substances and other signs. For mature hyphal cells of L. corymbifera l the presence thin cell walls was typical.
Key words: in vitro, Lichtheimia corymbifera, light and transmission electron microscopy, ultrastructure
Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, e-mail: amaliya.stepanova@szgmu.ru
ВВЕДЕНИЕ
Lichtheimia corymbifera (Cohn) Vuill. -распространенный представитель мукоромицетов, которые вызывают мукороз (прежнее название - зигомикоз), поражая преимущественно легкие, придаточные пазухи носа, кожу и подкожную клетчатку, центральную нервную систему, желудочно-кишечный тракт у пациентов с иммунодефицитными состояниями различной природы. Генерализованная форма инвазивного микоза, обусловленная L. corymbifera, характеризуется высокой летальностью. Природный резервуар обитания этого вида - почва, гниющие растительные отходы и пищевые продукты. В научной литературе сведения по особенностям ультраструктурной организации данного вида гриба отсутствуют.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В настоящей работе исследовали штамм L. corymbifera (PKnrF-1601/1966) из коллекции НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, выделенный от пациента с риноцеребральным мукоромикозом. Культуру гриба выращивали на среде Сабуро в модификации Эммонса при 28 °С и изучали через 3 и 7 суток. Съемку колоний проводили в световом микроскопе Olympus BX 51. Препараты для световой микроскопии готовили в монтирующей жидкости этанол-глицерин (1:1). Микроскопию и микрофотосъемку осуществляли на световом микроскопе Leica DM LB2 со встроенной камерой DFC320 (Leica, Германия). Часть препаратов культур гриба исследовали в флуоресцентном микроскопе AxioImager.Z1 (Carl Zeiss, Германия) с применением оптики Номарского.
Для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) кусочки питательной среды с разных участков колоний гриба фиксировали 3 часа в 3% глутаральде-гиде и пост-фиксировали 10 часов в 1% осмиевой кислоте. Затем образцы обезвоживали в спирте, ацетоне и заключали в эпоксидную смолу эпон-аралдит.
С целью выбора участка эпоксидного блока для последующего исследования в ТЭМ готовили полутонкие эпоксидные срезы толщиной 3-4 мкм с помощью стеклянных ножей на пирамитоме LKB 11800. Срезы помещали в каплю 50% ацетона на предметном стекле, затем высушивали над пламенем спиртовки до полного испарения ацетона и окрашивали 10 минут в растворе толуидинового синего, излишки которого удаляли и промывали в дистиллированной воде и спирте, а затем срезы высушивали и заключали в Biomount. Полутонкие срезы изучали и фотографировали в световом микроскопе AxioLab.A1 (фирма Zeiss, Германия). Ультратонкие срезы готовили на ультратоме Ultratome 2088 (LKB, Bromma, Sweden), окрашивали уранилаце-татом и цитратом свинца, а затем изучали в ТЭМ Jem 100 SX (Jeol, Tokyo, Japan).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Морфология колоний и составляющих их клеток.
Колонии L. corymbifera отличались большой скоростью роста. Через 3 дня роста на среде Сабуро при 28 °С - колония пушистая (Рис. 1 а), вначале белая, затем с оттенками светло-серого цвета, полностью заполняла чашку Петри.
В результате исследования в световом микроскопе культур L. corymbifera установили, что вегетатив-
Í--
ные гифы гриба варьировали по толщине (8-10 мкм) и наличию внутриклеточных включений, скорее всего, представляющих запасные липиды. Выявили, что различные гифы при просмотре препарата культуры преломляли свет в разной степени, что можно объяснить наличием клеточных стенок разной толщины. Гифы с включениями сравнительно крупные, их внутреннее содержимое имеет неравномерно зернистое строение. Септы встречались редко, дугообразной формы. Их наблюдали в вегетативных гифах (Рис. 1 е) на всем их протяжении и вблизи латеральных ответвлений, в основании спорангиеносцев, а также в спорангиеносцах. Для L. corymbifera характерно наличие спороношения в форме спорангиофоров, формирующихся среди гиф воздушного мицелия. Спорангиеносцы одиночные (Рис. 1 б, стрелка) либо в мутовках (Рис. 1 б, г, д). Мутовки состояли из варьирующегося числа (2-3-6) спо-рангиеносцев, обычно различающихся по высоте. В зрелых спорангиеносцах, особенно после высвобождения спорангиоспор, клеточные стенки на протяжении дистальной трети (в области перехода в апофизу, в самой апофизе и обнаженной от спор колумелле) отличались высоким контрастом (Рис. 1 б, головка стрелки). Формирование спорангифоров (в том числе спороно-шение спорангиев) в мутовках асинхронное (Рис. 1 б, д). Наблюдали: (1) зрелые спорангии, несущие многочисленные спорангиоспоры, заключенные в оболочку (Рис. 1 б, 1, в, г); (2) спорангии после разрыва оболочки, на обнаженных колумеллах которых располагалось некоторое количество спорангиоспор (Рис. 1 б, 2); и (3) спорангии с обнаженной колумеллой, лишенные спо-рангиоспор (Рис. 1 б, 3). Апофизы типичные, конические. Колумелла и апофиза после раскрытия спорангия имели колбовидный (Рис. 1 б, г) или копьевидный контур (Рис. 1 д). На вершинах отдельных колумелл виден небольшой вырост.
В световом микроскопе с применением оптики Но-марского отмечали широкие гифы (Рис. 1 е) с редкими септами, бесцветные, с трудно различимыми ризоидами. Особенностью гиф мицелия было наличие латеральных ответвлений, часто располагающихся под прямым углом к несущей ее гифе. Спорангиофоры длиной до 250 мкм. Спорангии обратно-грушевидной формы (Рис. 1 ж, з), размером 40-60 мкм, с конической апофизой (50-100 мкм, Рис. 1 з). Спорангиоспоры круглые (3-4 мкм) или эллипсоидные (2,5 х 5,0 мкм, рис. 1 и), бесцветные, гладкие или слегка шероховатые.
При изучении продольных полутонких эпоксидных срезов с разных участков колоний гриба обнаружено, что гифы вегетативного мицелия расположены главным образом на поверхности питательной среды (Рис. 1 к, 1). Они ориентированы без видимого порядка, хорошо различимы благодаря наличию большого числа довольно крупных темных липидных включений. В питательной среде редко встречались тонкие, беспорядочно ориентированные гифы без темных включений (Рис. 1 к, 2). Редко наблюдали слабоконтрастные, плохо развитые ризоиды, которые выполняют, с одной стороны, механическую функцию, «закрепляя» гифы воздушного мицелия на поверхности твердой питательной среды, а с другой - разрушают субстрат и поставляют питательные вещества гифам воздушного мицелия. Иными словами, для объекта настоящего исследования характерна четко выражен-
ная функциональная специализация гиф воздушного и субстратного мицелия.
Ультраструктура L. corymbifera. Клетки воздушного вегетативного мицелия проходили стадии роста, созревания, зрелости и старения. В старых частях колоний часто отмечали и полностью отмершие профили гиф с тонкими, сильно деформированными клеточными стенками (Рис. 2 г). В зрелых клетках мицелия присутствовали многочисленные интерфазные ядра и митохондрии (Рис. 1л, м, 2 а), которые по числу, топографии, размерам, форме и особенностям тонкого строения были сходны.
Ядра одиночные (Рис. 1 л) либо в группах по 2-4, округлой (2,0-2,5 мкм) или эллипсоидной (2-3 мкм) формы, умеренно хроматизированные, располагались вблизи клеточной стенки (Рис. 1 м). Оболочка ядра слегка извилистая, несет редкие рибосомы. Ядрышко одно, сферическое (0,3 мкм), эксцентричное, содержит гранулярный и фибриллярный компоненты, представленные в равной мере.
Митохондрии одиночные или в небольших группах (Рис. 1 л, 2 а), полиморфные, округлой (0,2 мкм) или эллипсоидной (0,2-0,4 мкм) формы. Умеренной электронной плотности матрикс митохондрий содержит многочисленные светлые кристы. Митохондриальный ретикулум, характерный для клеток вегетативных гиф культуральных форм других видов мицелиальных патогенных грибов (Aspergillus candidus [1], Scedosporium apiospermum [2], Pseudallesheria boydii, P. ellipsoidea и P. angusta [3]), у L. corymbifera не был выявлен.
Профили гиф мицелия различались между собой по степени вакуолизации (Рис. 1 л-о, 2 а), что свидетельствовало о том, что они находились на разных стадиях развития. Так, в одних из них вакуоли многочисленные, мелкие (Рис. 1 м), в других - многочисленные, средних размеров (Рис. 1 л, н, 2 а), а в третьих имела место одна или несколько крупных, занимающих основную часть на площади среза гифы (Рис. 1 о). Мелкие и средних размеров вакуоли светлые, со слабоизвилистым высококонтрастным тонопластом содержали многочисленные мелкие, варьирующегося диаметра (0,2-0,4 мкм), темные гранулы полифосфатов (Рис. 1 л, 2 а, стрелка), которые равномерно располагались по площади их среза. По мере созревания клеток гиф в цитозоле происходил синтез умеренного количества липидных включений округлой формы (0,2-0,3 мкм, Рис. 1 л, м, н, 2 а). В содержимом крупных вакуолей стареющих клеток отмечали скопления обрывков мембран разной конфигурации и темных сгустков тонко-фибриллярного материала (Рис. 1 о, 2 г). Часто наблюдали картины локального автолиза небольших по объему участков цитозоля с разрушающимися ор-ганеллами и запасными липидами.
Усиление уровня вакуолизации в стареющих гифах (Рис. 1 о) сопровождалось снижением числа митохондрий и запасных включений. Компоненты эндомем-бранной системы на всех стадиях развития клеток гиф встречались нечасто. Они были представлены редкими светлыми периферическими пузырьками и скоплениями агранулярных цистерн эндоплазматического ретикулума (Рис. 2 б, стрелки). Одиночные цистерны Гольджи и микротельца не выявлены. Цитозоль умеренной электронной плотности, богат свободными рибосомами в виде моно- и полисом.
Рис. 1. а - общий вид колонии L. corymbifera в чашке Петри через 7 суток после посева на питательную среду Сабуро; б-д - особенности морфологии гиф и спорангиофоров L. corymbifera в световом микроскопе; е - гифы вегетативного мицели я (е), ж - спорангии (показаны стрелками) в бинокулярной лупе; з - общий вид зрелого спорангия; и - зрелые спорангиоспоры; к - продольный полутонкий эпоксидный срез колонии гриба. е, б, и - оптика Номарского. Условные обозначения здесь и на рисунке 2: А - апофиза; В - вакуоль; Г - гифа; К - колумелла; КС - клеточная стенка; ЛВ -липидное включение; Мт - митохондрия; Пф - полифосфатные гранулы; С - септа; Сд - спородерма; Сн - спорангий; Сс -
спорангиоспора; Я - ядро.
Рис. 2. Ультраструктура гиф (а, г), клеточной стенки (б), септы (в), формирующихся (д, ж) и зрелого (е) спорангиев,
а также зрелых спорангиоспор (е, з, и) L. corymbifera.
Зрелые клетки гиф мицелия не различались между собой по толщине и строению латеральных клеточных стенок. Клеточные стенки тонкие (от 0,1 до 0,2 мкм), темные, гомогенные (Рис. 1 м, 2 б). В гифах, образующих спорангии, имели место одиночные, прямые (0,2 мкм), трехслойные (с двумя крайними темными слоями и центральным светлым) сплошные септы (Рис. 2 в).
Формирование сплошных септ в спорангиеносцах также способствует изоляции формирующихся генеративных структур от стареющих клеток мицелия, что позволяет им благополучно завершать свое развитие. Их присутствие обеспечивает ригидность гиф мицелия, подстилающих спорангиеносцы и сами спорангии, что важно для их механической устойчивости и возможности вертикальной пространственной ориентации, необходимой для процесса распространения спорангиоспор.
Старение гиф мицелия протекало следующим образом. Вначале происходило просветление содержимого ядер. Они теряли групповое расположение, их оболочка приобретала слегка извилистый контур, и впоследствии ее целостность нарушалась. Матрикс митохондрий просветлялся, существенно сокращалось число крист до полного исчезновения. Значительно уменьшалось число митохондрий и запасных веществ. В стареющих клетках без цитозоля долго сохранялись тонопласт (Рис. 2 г) и плазмалемма. В клеточных стенках стареющих гиф формировались многочисленные светлые перфорации варьирующейся (0,02-0,15 мкм) толщины (Рис. 2 г, стрелки). Это морфологическое наблюдение очень важно для правильной интерпретации ультраструктурных изменений при возможном изучении влияния антимикотиков на строение клеток гиф вегетативного мицелия.
Формирующиеся спорангии обратно-грушевидной формы (от 20-30 мкм, рис. 2 д, ж), с одной крупной и многочисленными мелкими вакуолями, заполняющими весь их объем. На рисунке 2 (е) представлен фрагмент зрелого спорангия, содержащий многочисленные шаровидные или эллипсоидные спорангиоспоры. В апикальной части оболочки спорангия имел место разрыв (Рис. 2 д, головка стрелки), который способствовал последующему освобождению спорангиоспор. Поверхность молодых спорангиоспор гладкая (Рис. 2 е, з), тогда как наружный слой спородермы у зрелых спор, покинувших спорангий, имел слегка волнистый контур (Рис. 2 и). Спорангиоспоры внутри спорангия и сразу после освобождения из него обладали гладкой
поверхностью, то есть были незрелыми. Собственно процесс их созревания, сопровождающийся формированием орнаментированной спородермы, проходил за его пределами, что создает определенные трудности при изучении ее строения, имеющей важное таксономическое значение.
Таким образом, при исследовании ультраструктурной организации культуральной формы L. corymbifera установлено, что их характерной особенностью является способность формировать тонкие клеточные стенки. Сходные по строению клеточные стенки были описаны ранее и для культуральных форм Lichtheimia spp. [4]. Характерным для изученного вида гриба было отсутствие варьирования ультраструктуры между отдельными гифами одной колонии, что ранее было впервые выявлено для гиф вегетативного мицелия ряда видов Aspergillus [1, 5, 6 и др.]. Представляет интерес продолжить начатые исследования и изучить тканевые формы этого гриба для того, чтобы выяснить, каким образом преобразуется тонкое строение клеток вегетативных гиф его мицелия.
ВЫВОДЫ
В колониях L. corymbifera закладка и последующее формирование спорангиофоров происходит в воздушном мицелии. В пределах мутовок формирование спорангиев протекает асинхронно.
При изучении продольных полутонких эпоксидных срезов колоний L. corymbifera установлено, что основная масса вегетативных гиф стелется по поверхности питательной среды, то есть является воздушной. Слаборазвитые ризоиды расположены в толще питательной среды.
При сравнении ультраструктуры клеток вегетативного мицелия культуральных форм L. corymbifera выявили, что они сходны по числу и строению ядер, митохондрий, по типу и количеству аккумулируемых запасных веществ и строению латеральных клеточных стенок.
Для зрелых клеток гиф L. corymbifera характерно наличие тонких, однослойных клеточных стенок и трехслойных сплошных септ.
Созревание спорагнгиоспор проходит после их освобождения из спорангия.
Данная работа выполнена в рамках Государственного задания Минздрава России «Изучение морфо-био-логических особенностей патогенных мукоромицетов - возбудителей микозов у пациентов с иммунодефицитом» (2019-2021 гг.).
ЛИТЕРАТУРА
1. Степанова А.А., Васильева Н.В., Чжан Ф., Тонг Д. Ультраструктурное исследование клеток вегетативного мицелия Aspergillus Candidus Link, выращенных in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2016; 18 (2): 23-27. [Stepanova A.A., Vasil'eva N.V., Chzhan F., Tong D. Ul'trastrukturnoe issledovanie kletok vegetativ-nogo miceliya Aspergillus candidus Link, vyrashchennyh in vitro. Problemy medicinskoj mikologii. 2016; 18 (2): 23-27 (In Russ)].
2. Stepanova A.A., Vasilyeva N.V., Bogomolova T.S., Chilina G.A. Cytological study of the in vitro growing cells of vegetative mycelium of Scedosporium apiospermum. Problems in medical mycology. 2017; 19 (1): 24-30.
3. Степанова A.A., Васильева Н.В. Электронно-микроскопическое изучение выращенных in vitro клеток гиф Pseudallesheria boydii, P. ellipsoidea и P angusta. Проблемы медицинской микологии. 2019; 21 (1): 34-40. [Stepanova A.A., Vasileva N.V. Elektronno-mikroskopicheskoe izuchenie vyrashchennyh in vitro kletok gif Pseudallesheria boydii, P. ellipsoidea i P. angusta. Problemy medicinskoj mikologii. 2019; 21 (1): 34-40 (In Russ)].
4. Степанова А.А., Хостелиди С.Н., Аравийский Р.А. и др. Электронно-микроскопическое исследование Lichtheimia spp. in vivo и in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2012; 14 (4): 55-61. [Stepanova A.A., Hostelidi S.N., Aravijskij R.A. i dr. Elektronno-mikroskopicheskoe issledovanie Lichtheimia spp. in vivo i in vitro. Problemy medicinskoj mikologii. 2012; 14 (4): 55-61 (In Russ)].
5. Степанова А.А., Синицкая И.А., Авдеенко Ю.Л. Субмикроскопическое изучение клеток вегетативного мицелия Aspergillusfumigatus Fres. Проблемы медицинской микологии. 2004; 6 (3): 34-40. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A., Avdeenko Y.L. Submikroskopicheskoe izuchenie kletok vegetativnogo miceliya Aspergillus fumigatus Fres. Problemy medicinskoj mikologii. 2004; 6 (3): 34-40 (In Russ)].
6. Степанова А.А., Синицкая И.А. Ультраструктура клеток вегетативного мицелия Aspergillus flavus Link, выращенного in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2006; 8 (1): 40-45. [Stepanova A.A., Sinickaya I.A. Ul'trastruktura kletok vegetativnogo miceliya Aspergillus flavus Link, vyrashchennogo in vitro. Problemy medicinskoj mikologii. 2006; 8 (1): 40-45 (In Russ)].
Поступила в редакцию журнала 02.07.2019
Рецензент: О.В. Яковлева
