Ультраструктура клеток Trichophyton violaceum Sabour. Ex E. Bodin, выращенных на агаре Чапека Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 616.992

УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТОК TRICHOPHYTON VIOLACEUM SABOUR, EX Е, BODIN, ВЫРАЩЕННЫХ НА АГАРЕ ЧАПЕКА

Степанова А.А. (вед. н. сотр.)*

НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава, Санкт-Петербург, Россия

© Степанова А.А., 2010

С помощью методов трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии исследовали ультраструктуру клеток вегетативного мицелия Т. violaceum у штамма, выделенного от больного онихомикозом и выращенного на твердой агаризирован-ной среде Чапека. Показаны различия в строении клеток воздушного и субстратного мицелиев. Приведено детальное описание септ, их порового аппарата и морфогенеза макроконидий

Ключевые слова: компоненты клетки, макроконидии, морфогенез, септальный поровый аппарат, ультраструктура, in vitro

ULTRASTRUCTURE OF TRICHOPHYTON VIOLACEUM SABOUR, EX E, BODIN GROWN AT THE CHAPEK AGAR

Stepanova A.A. (leading scientific researcher)

Kashkin Research Institute of Medical Mycology, SEI APE SPb MAPE, Saint Petersburg, Russia

© Stepanova A.A., 2010

The ultrastructure of T. violaceum hyphal cells of vegetative mycelium, isolated on Czapek nutritions agar from a patient with onychomycosis was investigated using transmission and scanning electron microscopy. The differences in the cells structure of aerial and substrate mycelia are revealed. The description of septa, septal pore apparatus and macroconidiumformation are given in detail.

Key words: cell components, in vitro, macroconidium,

morphogenesis, septal pore apparatus, ultrastructure

* Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна

Тел.: (812) 303-51-40

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы в различных возрастных и социальных группах людей отмечают существенный рост заболеваемости онихомикозами, в списке возбудителей которых не последнее место занимает Т. violaceum. Этот гриб вызывает микоз волосистой части головы, кожи и ногтей человека [1, 2]. Изучение особенностей биологии развития Т. violaceum in vitro с помощью методов электронной микроскопии представляет весьма актуальную задачу. Так, данные по строению септ и порового аппарата имеют большое значение для определения видовой принадлежности гриба, в том числе в тканях человека. Они весьма полезны для решения вопросов систематики и филогении грибов из рода Trichophyton. Закономерности биологии развития Т. violaceum in vitro могут быть использованы в качестве «контрольных» для выяснения характера ультраструктурных преобразований и особенностей морфогенеза разных типов клеток этого вида гриба в тканях человека, понимания субклеточных механизмов взаимодействия в системе макрооргапизм-отриб, действия различных антимикотиков как на отдельные органеллы, так и на развитие клеток гриба в целом.

До настоящего времени Т. violaceum изучали с использованием методов замораживания-скалывания и просвечивающей электронной микроскопии. С помощью первого метода были получены сведения об ультраструктуре клеточной стенки, плазмалеммы и интерфазных ядер [3], тогда как с помощью второго метода - ядра и другие компоненты цитоплазмы [4, 5]. Однако, в целом, органеллография разных типов клеток этого вида гриба в условиях культуры оставалась плохо освещенной, не был известен общий ход морфогенеза разных типов клеток данного вида дерматомицета в условиях культуры. Решение этих вопросов и составило цель настоящего исследования.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использовали штамм Т. violaceum (PKnrF-1211) из коллекции НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО Росздрава, выделенный от больного онихомикозом (А.П., 20.01.2003). Культуры гриба выращивали на агари-зированной среде Чапека в термостате при 27 °С и исследовали через 5, 10, 20 и 30 дней после посева. Колонии Т. violaceum через пять дней после посева на питательную среду - белые, кожистые, радиально складчатые, диаметром 0,6 см. Через 10,20 и 30 суток после посева цвет воздушного и субстратного мицелиев оставался прежним; а диаметр колоний возрастал, соответственно, в среднем, до 1,5, 3,0 и 4,5 см.

Съемку макроконидий проводили в световом микроскопе Olympus ВХ 51с использованием живых культур гриба без применения красителей. Метод подготовки образцов для сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии описан нами ра-

нее [6]. Образцы изучали в трансмиссионном (JEM 100 SX) и сканирующем (JSM 6390-LA) электронном микроскопе фирмы JEOL.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Воздушный мицелий. Клетки воздушного мицелия варьировали в диаметре (от 1,9 до 2,5 мкм), располагались хаотично и довольно плотно относительно друг друга (Рис. 1 а, б). В них отмечали два ядра эллипсоидной формы (1,Ох 1,6 мкм), локализованные, как правило, у клеточной стенки. Ядрышко - одно, мелкое (0,3 мкм), эксцентричное, высокой электронной плотности. Нуклеоплазма по электронной плотности сходна с цитозолем. Конденсированный хроматин в виде умеренного числа мелких электронноплотных глыбок различной формы, встречающихся в толще нуклеоплазмы, и в связи с внутренней мембраной ядерной оболочки, которая несла на своей поверхности многочисленные рибосомы.

В процессе роста клеток воздушного мицелия в них имело место формирование небольшого числа (4-7 на срез клетки) мелких (0,3-0,6 мкм) одиночных полиморфных вакуолей (Рис. 1 б). Форма их округлая, эллипсоидная или неправильная. Морфологию вакуолей определяли всевозможные включения: обрывки мембран разной протяженности и конфигурации, скопления фибриллярного и гранулярного материала варьирующей электронной плотности, формы и объема, а также темные, глобулярные включения небольших размеров (0,2-0,3 мкм), приуроченные к тонопласту.

По мере роста клеток воздушного мицелия число митохондрий существенно не изменялось и, в целом, было небольшим. Они встречались повсеместно, одиночные, небольшие (0,3-0,5 мкм), округлые, гантелевидные или эллипсоидной формы. Матрикс этих органелл плотный, содержал умеренное число светлых крист различной протяженности.

Дифференциация клеток воздушного мицелия сопровождалась синтезом запасных веществ в форме липидных включений и розеток гликогена (Рис. 1 б). Первые - в небольшом числе (2-5 на срез клетки), диаметром 0,2-0,3 мкм, округлые, светлые, как правило, приурочены к клеточной стенке. Они мелкие (0,10 мкм), низкой электронной плотности, собраны в небольшие группы, либо формировали варьирующих размеров скопление вблизи клеточной стенки. Крайне редко розетки гликогена можно было встретить в тесном контакте с липидными включениями. В закончивших рост зрелых клетках запасные вещества были преобладающим компонентом цитозоля, при этом скопления гликогена доминировали.

Другие компоненты клеток не были выявлены. Цитозоль - плотный, содержал умеренное число свободных рибосом. Плазмалемма клеток ровная, плотно прилегала к тонкой (0,12 мкм) двухслойной клеточной стенке. Внутренний слой клеточной стенки более толстый (0,11 мкм), светлый, тогда как наружный - тонкий (0,01 мкм), темный, рыхлый, часто

прерывистый, с неровным внешним контуром.

Субстратный мицелий. Клетки субстратного мицелия также располагались беспорядочно и плотно относительно друг друга. Плотность расположения гиф мицелия этого типа возрастала по мере роста и дифференциации колонии. В центральной части клеток гиф локализовались два ядра. Форма их могла быть округлой (1,3 мкм, Рис. 1 в), эллипсоидной (1,0x0,6 мкм) или слегка неправильной (1,5 мкм, Рис. 1 г). Ядрышко - одно, крупное (0,5 мкм), эксцентричное (Рис. 1 в), плотное, темное, с неправильным контуром; состояло, в основном, из гранулярного компонента. Содержание конденсированного хроматина умеренное; он был равномерно распределен по площади среза ядра.

Вакуоли в молодых клетках - небольших размеров (Рис. 1 в) и разнообразной формы (округлой, эллипсоидной и неправильной). По мере роста клеток они сливались между собой, что приводило к формированию более крупных вакуолей (Рис. 1 г). В содержимом последних выявляли скопления фибриллярного и гомогенного материала, обрывки концентрически ориентированных мембран (Рис. 1 г, е), а также темные гомогенные глобулярные включения вблизи тонопласта (Рис. 1 д). В закончивших рост клетках мицелия формирование центральной вакуоли совпадало с переходом их к старению.

По мере созревания клеток мицелия число митохондрий возрастало от 5 до 12 на срезе. Они крупные (0,5-0,7 мкм), полиморфные, с густыми темными кристами и матриксом умеренной электронной плотности (Рис. 1 в). Редкие, короткие, слабоизвилистые цистерны агранулярного эндоплазматического ретикулума отмечали на протяжении всего периода развития клеток. Созревание клеток субстратного мицелия сопровождалось синтезом большого числа липидных включений (Рис. 1 в, г, е, ж). Последние -одиночные, либо собраны в немногочисленные группы. Липидные включения имели варьирующий диаметр (0,3-0,6 мкм), умеренную электронную плотность и наличие темного тонкого ровного периферического ободка.

Цитозоль высокой электронной плотности, насыщен свободными рибосомами. Плазмалемма клеток ровная или слегка извилистая. Клеточная стенка довольно тонкая (0,20 мкм), двухслойная, с тонким (0,03 мкм), темным и гомогенным (Рис. 1 з, обозначен цифрой 1) наружным слоем и более широким, фибриллярным умеренной электронной плотности нижним (Рис. 1 з, обозначен цифрой 2).

Следует отметить, что в центральной и средней частях 5-ти дневной колонии Т. уШасеит небольшой процент клеток воздушного и субстратного мицелиев находились на разных стадиях старения и отмирания. С возрастом колонии гриба частота встречаемости стареющих и отмерших клеток в гифах мицелия убывала в направлении от ее центра к периферии. В 30-ти дневной колонии гриба интакт-ные клетки в гифах воздушного и субстратного ми-

целиев практически отсутствовали. Завершающие этапы морфогенеза клеток мицелия протекали сходно. При этом размеры ядер и ядрышек сокращались почти в два раза, заметно усиливалась вакуолизация. Электронная плотность цитозоля существенно возрастала, тогда как численность органелл, напротив, снижалась. Старение клеток субстратного мицелия у Т. уЫасеит сопровождалось утилизацией запасных веществ, что совпадало с переходом колонии гриба к формированию макроконидий.

Поровый аппарат септ клеток вегетативного мицелия. Клетки воздушного и субстратного мицелия Т. уМасеит снабжены однослойными клиновидными светлыми септами (Рис. 1 к) толщиной, в среднем, 0,15 мкм. В центре септ выявлялась сквозная пора диаметром 0,10 мкм, вблизи которой располагались от 1 до 4 тельца Воронина сферической (0,12 мкм) формы. Содержимое телец гомогенное, низкой электронной плотности. Снаружи они несли темную трехслойную отграничивающую мембрану. Вторым компонентом септальных пор гиф мицелия были мелкие темные пробки округлой формы, в основном, выявляющиеся в септальной поре стареющих клеток.

Формирование макроконидий. В культурах изученного штамма через 20 дней после посева отмечалось умеренное число макроконидий, закладка которых происходила на поверхности зрелой гифы воздушного мицелия (Рис. 2 а-в). Микроконидии, описанные для этого вида гриба другими авторами [1], в культурах анализируемого штамма не были выявлены.

Закладка макроконидии начиналась с формирования небольшого латерального выроста клеточной стенки (Рис. 2 к), последующий апикальный рост которого приводил к образованию зачатка макроконидии (Рис. 2 а, г, и). Растущие макроконидии были легко различимы от латеральных выростов гиф мицелия наличием конусообразной формы и небольшого сужения в их основании (Рис. 2 д, е, ж). При достижении зачатком макроконидии 2/3 своей окончательной длины, в его основании закладывалась отделительная (базальная) септа (Рис. 2 л), затем последовательно (в акропетальном направлении), на одинаковом расстоянии друг от друга, другие септы (Рис. 2 м, н). Септы формировались в виде складки плазмалеммы, растущей синхронно и центростремительно (Рис. 1 и). Они однослойные, прямые, светлые, с небольшой (0,12 мкм) центральной порой (Рис. 2 м, п) и сплошные в зрелых (Рис. 2 р, с), без компонентов порового аппарата.

Отметим, что для сегментов макроконидий -объекта настоящего исследования, так же, как и для Т. mentagrophytes уаг. interdigitale [7] и Т. гиЬгит [8], было характерно наличие одного ядра. В содержимом растущей макроконидии присутствовали мелкие вакуоли с разнообразным содержимым (Рис. 2 н), а также запасные вещества - гликоген и липидные включения (Рис. 2 о, п-с). Небольшие по объему,

разнообразной формы скопления, составленные из светлых мелких (0,10 мкм) розеток гликогена, отмечали вблизи клеточных стенок макроконидий. Сходный набор запасных веществ был описан и для формирующихся макроконидий Т. mentagrophytes уаг. interdigitale [7], однако в сегментах макроконидий у Т. гиЬгит [8] были обнаружены только липидные включения, да и то в небольшом числе. Проведенный нами анализ качественного и количественного состава запасных веществ в макроконидиях культур изученных трех видов дерматомицетов показывает, что он полностью соответствует таковому в формирующих их клетках воздушного мицелия.

Интересным представляется наблюдение, согласно которому, перед формированием каждого последующего сегмента и, соответственно, септы в цитозоле обособляемого сегмента макроконидии, происходило формирование одной вакуоли средних размеров (Рис. 2 н). Отметим, что участие вакуолей в морфогенезе макроконидий было отмечено ранее и для Т. гиЬгит [8]. Однако у последнего вида модель формирования макроконидий была принципиально иной: в практически закончившей рост макроконидии одновременно происходила закладка и формирование средних размеров вакуолей, равномерно распределенных в цитозоле. Затем в промежутках между ними также одновременно (симультанный тип закладки септ), а не акропетально, как у Т. уЫасеит, закладывались септы.

Закончившие рост макроконидии (1,02,0x6,0-9,0 мкм) в культурах Т. уЫасеит - 3- (Рис. 2 в) и 4-клеточные (Рис. 2 р), с конусообразным апексом и суженным основанием, с гладкой поверхностью (Рис. 2 з). В цитозоле сегментов зрелых макроконидий наблюдали многочисленные скопления крупных липидных включений (0,2-3 мкм, Рис. 2 р), что отмечали также для Т. mentagrophytes уаг. interdigitale [7] и Т. гиЬгит [8]. Созревание макроконидий Т. уЫасеит сопровождалось обезвоживанием и возрастанием электронной плотности цитозоля (Рис. 2 с) до такой степени, что запасные вещества переставали выявляться. Клеточная стенка зрелых макроконидий по строению и толщине (0,13 мкм) не отличалась от аналогичной гиф воздушного мицелия.

Отделение зрелых макроконидий от клеток вегетативного мицелия наблюдали после полного лизиса среднего слоя базальной септы, в ходе чего происходило формирование так называемого «рубчика» (Рис. 2 т, стрелка). При исследовании процесса морфогенеза макроконидий в сканирующем электронном микроскопе показано, что в отдельных случаях отделение макроконидии происходило и на уровне септы, следующей после базальной (Рис. 2 и). На уль-тратонких срезах «рубчик» можно было легко идентифицировать также по скоплению темного фибрил-ллярного материала (Рис. 2 т, стрелка). Клеточная стенка зрелых макроконидий толщиной 0,22 мкм, двухслойная, как и у формирующих их клеток вегетативного мицелия.

Способность клеток воздушного мицелия исследованного штамма Т. уЫасеит продуцировать умеренное число макроконидий коррелиловало с аналогичным количеством запасных веществ в их содержимом. Среди ранее изученных видов дерматомицетов - Т. mentagrophytes уаг. interdigitale [7] и Т. гиЬгит [8], в клетках вегетативного мицелия первого из них наблюдали наибольшую аккумуляцию запасных веществ в форме липидных включений. К тому же только у штамма этого вида дерматомицета, помимо макроконидий, мы наблюдали и большое число микроконидий. В противовес Т. уЫасеит и Т. mentagrophytes уаг. interdigitale [7], низкое содержание запасных веществ в клетках мицелия у Т. гиЬгит [8] совпадало с отсутствием на гифах мицелия микроконидий, а также небольшим числом формируемых ими макроконидий, которые к тому же, имели вид недоразвитых, сильно редуцированных. На основании приведенных фактов можно сделать вывод о том, что способность клеток мицелия изученных видов дерматомицетов в условиях культуры формировать макро- и микроконидии, а также частота их встречаемости, размеры и богатство их запасными веществами напрямую зависят от способности первых синтезировать и аккумулировать запасные вещества.

Таким образом, зрелые клетки гиф воздушного и субстратного мицелиев Т. уЫасеит сходны между собой по размерам и форме ядер, а также структуре клеточной стенки. В научной литературе [3,5] имеются сведения о присутствии в клетках вегетативного мицелия Т. violaceu.ni нескольких ядер, вакуолей, элементов эндоплазматического ретикулума и митохондрий, однако данные об особенностях морфогенеза клеток воздушного и субстратного мицелиев отсутствовали. По нашему мнению, основными признаками дифференциации клеток гиф воздушного мицелия у Т. уШасеит были: формирование небольшого числа мелких вакуолей и синтез умеренного числа запасных веществ в форме липидных включений и розеток гликогена, тогда как субстратного: пролиферация митохондрий и синтез аналогичных типов запасных веществ, но в намного большем количестве.

Несмотря на принадлежность к одному роду, Т. уЫасеит существенно отличался от ранее изученных Т. mentagrophytes уаг. interdigitale [7] и Т. гиЬгит [8,9] по толщине септ и размерам телец Воронина. Зрелые макроконидии Т. уМасеит имели двухслойные латеральные стенки, по толщине сходные с таковыми гиф воздушного мицелия, что ранее было показано для Т. mentagrophytes уаг. interdigitale [7] и

Т. гиЬгит [8,9], выращенных в аналогичных условиях. Клетки субстратного мицелия культур всех этих трех видов дерматомицетов формировали намного более толстые латеральные стенки, по сравнению с таковыми воздушного мицелия. Таким образом, выявленные различия по строению порового аппарата септ и типу закладки септ макроконидий позволяют, даже при небольшом числе исследованных видов рода Trichophyton, сделать предположение о его искусственности и, соответственно, о возможности его ревизии с привлечением данных по другим видам, включая типовой вид - Т. tonsurans Malmsten.

В целом, развитие клеток субстратного мицелия у анализируемого штамма Т. violaceum в условиях культуры протекало однотипно.

ВЫВОДЫ

1. Зрелые клетки гиф воздушного и субстратного мицелиев Т. violaceum содержали два интерфазных ядра, характеризующихся умеренным уровнем хро-матизации.

2. Клетки гиф воздушного и субстратного мицелиев Т. violaceum сходны между собой по числу, размерам и форме ядер, наличию компонентов эндомем-бранной системы. Основными признаками гиф воздушного мицелия были: формирование небольшого числа мелких вакуолей и синтез умеренного числа запасных веществ в форме липидных включений и розеток гликогена, тогда как признаками субстратного мицелия - пролиферация митохондрий и синтез большого числа запасных веществ аналогичного типа.

3. Между клетками вегетативного мицелия Т. violaceum присутствовали однослойные светлые клиновидные септы, к которым приурочены мелкие сферические (0,14 мкм) тельца Воронина округлой формы в числе от 1 до 4. Другим компонентом сеп-тальных пор были небольшие темные пробки округлой формы, появляющиеся в септальной поре стареющих клеток вегетативного мицелия.

4. Септы в формирующихся макроконидиях закладывались последовательно в акропетальном направлении в виде складок плазмалеммы, растущих центростремительно. Они прямые, светлые, с небольшой центральной порой в растущих макроконидиях и сплошные - в закончивших рост. Закладке каждой последующей септы предшествовало формирование в цитозоле макроконидии вакуоли средних размеров.

5. Зрелые клетки воздушного и субстратного мицелиев Т. violaceum имели двухслойные латеральные клеточные стенки сходной толщины.

ЛИТЕРАТУРА

1. de Hoog G.S., Guarro J, Gene J, Figueras M.J. Atlas of Clinical Fungi. - 2d ed. CBS, Utrecht the Netherlands; Universitat Rovira I Virgili Reus, Spain. - 2002. - 1126 p.

2. Аравийский P.A., Климко H.H., Васильева H.B. Диагностика микозов. - СПб.: Изд. дом СПб МАПО. - 2004. - 176 с.

3. Hasegawa Т., Nakai Е., Rajan V.S. Freeze-etching observations of Trichophyton violaceum //Sabouraudia. - 1977. - Vol.15, №1. - R 95-98.4. Ito Y., Setoquti Т., Nozawa Y., Sakurai S. An electron microscopic observation of Trichophyton violaceum II J. Invest. Dermatol. - 1967. - Vol.48, №2. - P. 124-127.

5. Amer M.A., Taha М., Diab N.A., et al. Ultrastructure of Trichophyton violaceum // Int. J. Dermatol., - 1993. - Vol.32, №2. - P. 97-99.

6. Степанова А.А., Синицкая И.А. Морфогенез конидиогенного аппарата Aspergillus niger van Tieghem. по данным электронной микроскопии //Ж. Проблемы мед. микологии. - 2004. - Т.6, №2. - С. 37-48.

7. Степанова А.А., Синицкая И.А. Ультраструктура Trichophyon mentagrophytes var. interdigitale Blanchard//Ж. Проблемы мед. микологии. - 2004. - Тб, №2. - С. 119-120.

8. Савицкая Т.И., Васильева Н.В., Мартынов А.А. и др. Электронно-микроскопическое изучение выращенных in vitro клеток Trichophyton rubrum (Castell.) Semon // Ж. Проблемы мед. микологии. - 2007. - Т.9, №1. - С. 20-25,

9. Savitskaya T.I., Stepanova А.А. Morphogenesis Trichophyton rubrum (Castell.) Semon according to the electron-microscopic data. 3-rd Trend in Medical Mycology. - Turin, Italy, 2007. - P. 66.

Поступила в редакцию журнала:

Рецензент: Н.П.Блинов

Рис. 1. Ультраструктура клеток гиф воздушного (а, б) и субстратного (в-з, к) мицелия Т. ую1асеи в сканирующем (а) и трансмиссионном (б-к) электронных микроскопах. Условные обозначения (здесь и на рисунке 2,3): В - вакуоль; ВМ - воздушный мицелий; Г - гликоген; ЗМ - зачаток макроконидии; ЗОМ - зрелая отделившаяся макроконидия; КС - клеточная стенка; ТВ - тельца Воронина; ТГ -темная глобула; С - септа; СП - септальная пора; СК- стареющая клетка; Л В - липидное включение; МК- макроконидия; С - септа; ФМ - формирующаяся макроконидия; ФС- формирующиеся септы; Я - ядро; Яд - ядрышко. Цифрами (Рис. 1 з) обозначены слои латеральной клеточной стенки. Стрелкой (Рис. 2 т) показано место отделения макроконидии по базальной септе; прямой линией (Рис. 2 к) - начальная стадия формирования зачатка макроконидии. Ув.: а- х2000; д-ж- х20000; з - Х80000; и, - Х70000.

Э I» [ Щ Ц - г лын I 1И о р 11

у .

Рис. 2. Особенности строения макроконидий Т. ч'юШсеит в световом (а-в), сканирующем (г-и) и трансмиссионном электронном микроскопах (к-т). Ув.: а-и -х40СЮ; к, л-о, р, с- Х50000; п, т -Х70000.

Рис. 3. Схематическое изображение морфогенеза макроконидий Т. уіоіасеит: а - фор-мирование зачатка макроконидии; б - начальная стадия формирования базальной септы макроконидии; в - формирующаяся макроконидия с базальной септой; г-е - мак-роконидии в период акропетального формирования септ; ж - зрелая макроконидия со сплошными септами и липидными включениями; з - зрелая макроконидия, отделившаяся от клетки воздушного мицелия