CC BY
134
УДК 619:616.993.192.1:636.5
К ВОПРОСУ О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ МЕТОДИЧЕСКОЙ
БАЗЫ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО КОКЦИДИОЗА ЦЫПЛЯТ
Шемяков Д.Н., Брылина МА.
ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»
Птицеводство в Российской федерации занимает лидирующее положение среди всех отраслей животноводства. Министерством сельского хозяйства была разработана «Концепция развития птицеводства Российской Федерации» на период 2013-2020 годы [2]. Однако интенсивному развитию птицеводства во многом препятствуют заболевания паразитарной этиологии, среди которых на первое место выходит кокцидиоз птиц [1, 2]. В настоящее время постоянно синтезируются и производятся новые кокцидиостатики, осуществляется скрининг их эффективности в эксперименте и в производственных условиях. В связи с этим существует настоятельная необходимость совершенствования экспериментальной базы для такого рода исследований, позволяющая получить достоверные и полные экспериментальные данные с минимизацией трудовых, временных и материальных затрат.
На сегодняшний день существуют несколько вариантов основной методики экспериментального заражения и культивирования ооцист кокцидий в лабораторных исследованиях, опубликованных, в основном, в иностранных источниках [4, 5]. Цель метода - выделить и накопить инвазионные стадии кокцидий с последующим заражением цыплят спорулированными ооцистами для дальнейшего определения эффективности кокцидиостатика. Однако в разных источниках для осуществления данной цели предлагаются многочисленные способы и методы, особенно это касается концентрации и инкубирования возбудителей и подсчета концентрации кокцидий в растворе. Целью нашей работы явилось совершенствование методики с целью использования ее для эксперимента.
Материалы и методы. Материалом для исследования являлся помет, который отбирали на птицефабриках ППЗ «Смена» Московской области и ЗАО «Приосколье» Белгородской области. Наличие в пробах ооцист кокцидий устанавливали общепринятым флотационным методом Фюллеборна, а их количество в 1 г подсчитывали методом В.Н.Трача, используемого в количественных гельминтологических исследованиях [3]. Наиболее эффективным оказалось выделение ооцист из помета цыплят, отобранного на 27-32 сутки выращивания. По литературным данным выделение единичных ооцист обнаруживают, начиная с 22 дня выращивания цыплят. Пик выделения ооцист кокцидий приходится на 27-32 сутки. Затем количество ооцист идет на спад к 36 суткам выращивания [2]. Важно, что отбор проб фекалий
513
необходимо производить только у цыплят напольного содержания. Метод В.Н.Трача, использованный нами для количественного подсчета ооцист кокцидий в 1 г фекалий, имеет ряд преимуществ по сравнению с камеральными методами, предполагающими использование камер МакМастера и других модификаций. Пробу помета весом 5 г помещали в стаканчик емкостью строго 100 мл с диаметром свободного края 5 см (для этой цели удобно использовать стандартные пластиковые контейнеры для сбора проб мочи). Периодически помешивая, в стаканчик наливали раствор аммиачной селитры плотностью 1,3 и через 45 мин с ее поверхности металлической петлей диаметром 5мм брали 5 капель (1 из центра и 4 с периферии), переносили на предметное стекло и микроскопировали. Подсчитывали все ооцисты в 5 каплях взвеси, определяли среднее количество. Для определения количества ооцист в пробе весом 1 г площадь поверхности стаканчика делили на площадь петли, выявляя количество капель, которые по площади соответствуют всей поверхности взвеси. Умножив полученное количество капель на среднее количество ооцист в одной капле, получали общее количество ооцист. Полученное число делили на массу фекалий в пробе и определяли количество ооцист кокцидий в 1г фекалий [3]. Так оценивали возможность использования отобранных проб помета для дальнейших исследований.
Следующим этапом было выделение и концентрирование ооцист из помета, которое проводили методом центрифугирования. Для этого отфильтровывали помет (5 г), залитый водопроводной водой, через мелкое сито, полученный фильтрат разливали в центрифужные стаканы объемом 50 мл, центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 минут. Затем надосадочную жидкость сливали, в осадок добавляли насыщенный раствор поваренной соли, тщательно размешивали до гомогенного состояния. Стаканы с полученной взвесью центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 минут, верхний слой центрифугата снимали пастеровской пипеткой в объеме 10-15 мл из каждого стакана. Центрифугирование с насыщенным раствором соли проводили 5-6 раз, проводя контроль под микроскопом до тех пор, пока в поле зрения не обнаруживалось достаточное количество ооцист. После последнего центрифугирования всю суспензию с ооцистами отбирали из стакана пипеткой и сливали в стеклянную колбу, заливали водой из расчета 1:10 и оставляли на сутки для осаждения ооцист.
Дальнейшее проведение методики включает в себя споруляцию (культивирование, инкубирование) ооцист. Надосадочную жидкость из колбы с осаждеными ооцистами сливали, не затрагивая осадок. Осадок переносили в другой сосуд и добавляли 10%-ный раствор бихромата калия из расчета 1:10. Сосуд помещали в теплое место при 25-28С0 для споруляции ооцист. Очень важным моментом является необходимость подачи в сосуд с ооцистами воздуха при помощи микрокомпрессора для аквариумов, так как оказалось, что без активной аэрации раствора процесс споруляции надолго задерживается. Через трое суток определяли процент споруляции путем подсчета созревших и неспорулированных ооцист при микроскопировании
514
мазка исследуемой суспензии (окуляр - х10, объектив - х20). Спорулированность полученных проб для дальнейшего использования составила 70%. Для расчета доз инвазионного материала при последующем заражении необходимо провести подсчет количества ооцист в полученном объеме жидкости с помощью камеры Горяева, под микроскопом (окуляр -х10, объектив - х20). Учет ооцист проводили во всех 225 квадратах камеры. Подсчитывали только спорулированные, недеформированные ооцисты. Если ооцисты лежали на границе квадрата, то учитывали только ооцисты, находящиеся на верхней и правой сторонах квадрата. Проводили подсчет в четырех камерах, выводили среднее арифметическое, после чего полученное число умножали на коэффициент 11 (ГОСТ 25383-82). Конечный результат соответствовал количеству ооцист в одном миллилитре исследуемой жидкости [1].
Экспериментальные исследования проводили на цыплятах кросса Шейвер-уайт 10-суточного возраста, выращенных в условиях вивария, весом 68-74 г. Заражение цыплят производилось последовательно в возрасте 10, 12, 16, 17 сут. путем перорального введения суспензии, содержащей спорулированные ооцисты в количестве 34 тыс., 23 тыс., 21 тыс. и 9 тыс./мл соответственно. Эта схема заражения и дозы ооцист, содержащиеся в 1 мл фекальной суспензии, оказались эффективными для развития экспериментального кокцидиоза, признаки острого течения которого обнаружились у 29% цыплят к 18-19 суткам после первичного заражения (возраст цыплят составил, соответственно, 28-29 дней). Следует отметить, что резкое повышение количества ооцист в фекалиях зараженных цыплят (их количество составило от 40-50 до 180-200 в 1 поле зрения микроскопа, что свидетельствует о наличии инвазии средней тяжести (согласно ГОСТ 2538382), выявилось уже на 10-е сут. после первичного заражения. Мониторинг выделения ооцист вели с 7 сут. после первичного заражения, используя полуколичественный метод. С этой целью в каждой группе отбирали общие пробы помета по 5 г, которые заливали 50 мл насыщенного солевого раствора и исследовали по методу Фюллеборна. Оценивали количество ооцист в капле солевого раствора. Диагностику экспериментального заражения проводили комплексно на основании клинических признаков, патологоанатомических изменений кишечника при вскрытии цыплят с клиническими признаками острого кокцидиоза и лабораторных исследований помета. Идентификацию кокцидий, выделенных от зараженных цыплят, проводили, основываясь на микроскопии ооцист, учитывая их морфологические признаки и характерные патологоанатомические изменения в различных отделах кишечника зараженных цыплят с микроскопией мазков-соскобов, взятых из типичных мест поражения.
Заключение. Таким образом, можно заключить, что экспериментальное воспроизведение кокцидиоза цыплят в лабораторных условиях является достаточно просто выполнимым и эффективным методом для исследования как особенностей течения, проявления и эпизоотологии болезни, так и для
оценки эффективности различных кокцидиостатиков в условиях эксперимента.
Литература: ¡.Кириллов, А.И. Кокцидиозы птиц - М., 2008. - 230 с. 2.Мурзаков Р.Р.// Сб. мат. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 2011. - Вып. 12. - С. 331-333. 3. Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды -М.:Колос, 1984.- С.52. 4. Amer M.M., Awaad M.H., Rabab M. // J. Am. Sci. -2010.-№ 6. 5. Khalafalla R. E., Daugschies A.// Parasitol. Res. - 2010.- №5.
To the question of methodological basis improvement for modeling of the experimental Coccidia infection in chickens. Shemyakov D.N., Brylina M.A. K.I. Skryabin Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology.
Summary. One can conclude that the experimental reproduction of Coccidia infection in chickens in laboratory conditions is a sufficiently simple, feasible and effective method for investigation of peculiarities of clinical course, manifestations and epizootology of this infection and evaluation of efficacy of different anticoccidial agents in experimental conditions.
