CC BY
200
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ЭЙМЕРИОЗА ЦЫПЛЯТ,
ВЫЗВАННАЯ EIMERIA TENELLA
Сафиуллин Р.Т., МурзаковР.Р., Андреянов О.Н.
ВНИИ гельминтологии им. К.И. Скрябина
Введение. Из анализа современного состояния птицеводства видно, что у нас в стране еще велика доля птицеводческих хозяйств, использующих напольное содержание птиц, где кокцидиозы регистрируются довольно часто и при большой экстенсивности инвазии. При этом следует помнить, что даже на современных птицефабриках, где основная масса птиц выращивается в клетках, технология предусматривает содержание родительского стада на полу, что также приводит к заражению эймериями. Кроме того, за последние годы во многих странах Европы и у нас в России идет переход к технологии напольного выращивания бройлеров. Вызвано это повсеместным использованием гибридов кросс, у которых за 36 дней выращивания живая масса доходит 2,2-2,3 кг и конечно для них напольная технология предпочтительная, когда они свободно двигаются по птичнику, что обеспечивает нормальное развитие органов, прежде всего сердца и организма в целом. Безусловно, при напольной технологии выращивания, невозможной найти птицеводческое хозяйство свободное от эймериозной инвазии. По данным литературы в кишечнике кур обнаруживают более 10 видов эймерий, но наиболее часто встречаются Eimeria tenella, E. necatris, E. acervulina, E. maxima и нередки случаи когда регистрируется смешанная инвазия несколькими видами эймерий одновременно. Из отмеченных видов эймерий E. tenella является наиболее патогенным и широко распространенным в хозяйствах стран Европы и в России. Патогенное действие эймерий обусловлено массовой гибелью инвазированных эпителиальных клеток, воспалением стенки кишечника, нарушением всасывания питательных веществ из кишечника, что ведет к ослаблению организма и изменению состава микрофлоры кишечника. Исходя из широкого распространения эймериоза среди цыплят-бройлеров, для своевременной и точной корректировки лечебно-профилактических мероприятий нужно знать какая доза спорулированных ооцист вызывает инвазию, с какого времени и сколько выделяется ооцист с пометом зараженной птицы. Для возможного ответа на эти вопросы перед собой поставили задачу воспроизвести экспериментальную модель эймериоза цыплят, вызванную E.tenella.
Материалы и методы. Первоначально была проведена биопроба по экспериментальному заражению цыплят. Опыт проводили в условиях вивария ГНУ ВНИИТиП на 42 цыплятах, 14-дневного возраста, свободных от кокцидий, корма которых не содержали противококцидийные препараты. Для контроля концентрации спорулированных ооцистов кокцидий (2000 ооцист/мл) в работе использовали камеру Мак Мастера, а для разбавления буфер WSH с таким расчетом, чтобы возможно было ввести 1 мл суспензии
452
каждому цыпленку. Для достижения хорошего смешивания материала использовали магнитный смеситель. Цыплят подвергали нумерации и по принципу аналогов разделили на 7 групп по 6 цыплят в группе. Первые шесть групп цыплят по 6 голов в каждой были использованы для биопробы на тест искусственного заражения цыплят и составления градуировочной кривой по установлению зависимости количества выделения ооцист эймерий от дозы их заражения. Для заражения цыплят была использована исходная культура спорулированных ооцист E.tenella, которая содержала 2000 ооцист в 1 мл. Предварительно готовили разведение культуры с использованием буфера WSH. Цыплят подвергали индивидуальному взвешиванию и содержали в клетках изолированно. Цыплят 1, 2, 3, 4, 5 и 6 групп подвергали заражению путем дачи внутрь суспензии, содержащей концентрации 2000; 1000; 250; 125; 62 и 15 ооцист/мл в разведении с буфером WSH, соответственно. Цыплята седьмой группы получали по 1 мл буферного раствора и служили контролем.
За время опыта цыплята всех групп находились в аналогичных условиях содержания и имели одинаковый рацион. За цыплятами в течение всего периода опыта вели ежедневные клинические наблюдения за общим состоянием и их поведением, приемом корма и воды, видимыми физиологическими изменениями и другими.
Для определения ооцист в фекалиях от цыплят каждой опытной группы отдельно с 6 по 12-е сутки ежедневно собирали весь помет, взвешивали, добавляли воду до объема 2000 г, смешивали смесителем в течение 5 минут. Пробы для дальнейших исследований отбирали из каждой группы в количестве 25 г, которые консервировали 4%-ным раствором бихромата калия и доводили до однородной массы путем размешивания миксером в емкости с завинчивающейся крышкой и хранили в холодильнике при +4°С.
Наличие ооцист в фекалиях определяли флотационным методом с использованием насыщенного раствора натрия хлористого плотностью 1,18
-5
г/см , а их количество подсчитывали с использованием камеры Мак Мастера. При этом навеску фекалий 1 г помещали в стеклянный стаканчик, заливали 35 мл флотационного раствора и перемешивали палочкой до получения однородной массы и исчезновения комков, по мере размешивания добавляли раствор до объема 30 мл. Взвесь фильтровали через ситечко в другой стаканчик, осадок на ситечке отжимали палочкой. Затем пастеровской или любой другой микропипеткой быстро переносят 0,15 мл взвеси в каждую из шести ячеек камеры, накрывают крышкой и оставляют на 3-5 минут и за отмеченное время имеющиеся ооцисты поднимаются и прилипают к поверхности сетки камеры. При подсчете ооцист пользовались микроскопом МБС и увеличением х100 раз. Из каждой пробы подсчитывали количество ооцист в шести ячейках камеры и выводили среднюю за каждый исследуемый день. Поскольку для исследования была отобрана проба 0,15 мл исходной взвеси материала 1:29, то есть 1/200 от 30 мл, чтобы определить количество ооцист эймерий в 1 г помета, выявленное их количество в одной ячейке (в нашем случае среднее количество из шести) умножали на 200.
453
Зная общее количество помета по каждой группе цыплят за исследуемые дни (с 6 по 12-й) и количество ооцист эймерий в 1 г экскрементов проводили подсчет общего количества выделенных ооцист за отмеченный период.
Для составления градуировочной кривой проводили анализ линейной регрессии между логарифмическими значениями количества ооцист, которыми цыплята были заражены и общим числом всех выделенных в помете ооцист. В графике х соответствовал кривой дозы заражения, а у кривой выделенных в помете ооцист. Регрессионный анализ проводили с помощью персонального компьютера в программе EXCEL.
Результаты исследований. Оценку культуры ооцист проводили после определения процента споруляции с использованием счетной камеры и микроскопа. При этом подсчитывали количество спорулированных и неспорулированных ооцист, а процент выводили делением количества спорулированных на общее количество спорулированных и неспорулированных ооцист. В нашем случае культура была хорошей, поскольку споруляция составила 95%.
Концентрацию ооцист определяли с использованием камеры Мак Мастера. Для этого брали 0,2 мл суспензии ооцист и 9,8 мл насыщенного раствора хлористого натрия (40%), и размешивали. Затем заполняли камеру Мак Мастера, подождали три минуты и подсчитывали количество ооцист под микроскопом. Объем одной камеры 0,15 мл, подсчитывали ооцист во всех шести камерах и сумму делили на шесть. Количество ооцист в 1 мл суспензии выводили следующим образом: обнаруженное количество *50 (степень разведения) * 0,95.
Основная часть работы проведена на цыплятах-бройлерах, кросс АВН 47, которые в суточном возрасте после инкубатора были помещены (19.11.2009) в 1-й блок вивария ВНИИТиП. На 10-11-й дни после посадки цыплят проводили выборочный отбор по 20 проб помета и их исследовали в условиях лаборатории ВИГИС флотационным методом Фюллеборна. По результатам исследований все пробы помета были свободными от ооцист эймерий.
На 14-й день (2.12.2009) для опыта были отобраны и переведены в 11-й блок 42 клинически здоровых цыпленка, которых подвергали индивидуальной нумерации, взвешиванию и содержали их изолированно по группам.
Необходимо отметить, что до посадки опытных цыплят как в блоке №1, так и в блоке №11 была проведена тщательная очистка и дезинфекция. Кроме того, в блоке №11 дополнительную влажную (пенная) дезинфекцию проводили вироцидом и регулярно заправляли дезковрик.
По условиям опыта ограничений в кормлении цыплят не было и их кормили сухим рассыпчатым комбикормом рецепта ПК-2 для бройлеров 1-35дневного возраста по зоотехническим нормам. Потребление воды было без ограничений. За время опыта кормление и условия содержания опытных цыплят всех групп были одинаковые. Так, в блоке №11, где содержали цыплят температура воздуха равнялась 22±2°С, влажность воздуха 60±5%.
454
Результаты проведенных взвешиваний показали, что живая масса цыплят 1, 2, 3, 4, 5 и 6-й групп, которых использовали для заражения и задавали разные дозы спорулированных ооцист эймерий на день начала опыта (2.12.2009) в среднем составила 270,3; 241,7; 245,7; 245,7; 270,8 и 244,3г соответственно, а масса контрольных цыплят равнялась 236,9г.
Оценку общего состояния опытных цыплят после назначения разной дозы спорулированных ооцист эймерий проводили по данным клинических наблюдений, которые показали наличие определенного угнетенного состояния, они были малоактивны и забивались в кучу. По-видимому, это реакция на стресс, вызванный отловом, перемещением из одного блока в другой, взвешиванием, нумерацией и дачей культуры ооцист. Каких-либо осложнений при назначении культуры ооцист и после нее не отмечено. Со второго дня после начала опыта по данным общеклинических наблюдений цыплята, получавшие чистую культуру спорулированных ооцист и контрольные не отличались друг от друга.
Второе взвешивание опытных и контрольных цыплят проводили через 5 суток после назначения культуры ооцист. Более заметные изменения нами были выявлены при взвешивании зараженных спорулированной культурой ооцист цыплят. Так, у цыплят 1, 2 и 3-й групп, которым задавали по 2000; 1000 и 250 ооцист средний прирост к исходной массе тела через 5 суток составил 288,8; 263,4 и 270,7 г соответственно. У цыплят 4, 5 и 6 -й групп, получавших по 125; 62 и 15 спорулированных ооцист прирост к исходной массе тела был более заметный и составил 349,3; 382,2 и 372,5 г соответственно. У цыплят 7-й контрольной группы данный показатель составил 243 г. Следует отметить, что использованный нами показатель прирост к исходной массе тела является интегрированным и свидетельствует, что у цыплят 1, 2 и 3-й групп инвазионный процесс, вызванный спорулированными ооцистами E.tenella, протекал более интенсивно и оказал свое влияние на прирост массы. Дальнейшие исследования по определению количества выделяющихся с пометом ооцист подтвердили отмеченное и наибольшее количество ооцист установлено у цыплят 1 и 2-й групп.
За время опыта всего пало 2 цыпленка, по одному из 2-й (7.12.2009) и 7й (8.12.2009) группы, которые были подвергнуты вскрытию и копроскопическим исследованиям.
При вскрытии павшего цыпленка №0470708 из 2-й зараженной группы дозой 1000 ооцист/мл обнаружены следующие признаки: видимые слизистые оболочки и мышцы бледные. Слизистая оболочка слепых отростков геморрагически воспалена, красного цвета, местами некротизирована. Со стороны серозной оболочки слепые отростки темно-красного цвета. При исследовании соскобов со слизистой оболочки слепых отростков найдено скопление ооцист. Вскрытие павшего цыпленка из контрольной группы показало отсутствие отмеченных выше признаков и самих ооцист кокцидий.
Согласно условиям опыта с 6 по 12 сутки ежедневно из каждой группы собирали весь помет в отдельности, взвешивали и подвергали
455
копроскопическому исследованию в условиях лаборатории вигис. Исследования по определению ооцист в фекалиях зараженных цыплят, собранных с 6 по 12-е сутки после дачи культуры показали их наличие, но в разных группах показатели отличались. Цыплята 7-й группы, которые получали буфер WSH без ооцист, служили незараженным контролем и во все сроки исследований оставались свободными от инвазии.
Цыплята 1-й группы, получавшие по 2000 спорулированных ооцист/мл, во все сроки исследований с пометом выделяли ооцисты в количестве от 0,16 до 38,2 в камере и средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 20,4. Количество ооцист в 1 г помета по этой группе составило 4080, и данный показатель нами использовался как исходный при расчете процента снижения количества ооцист или интенсэффективность при испытании препаратов. При исследовании помета от цыплят 2-й группы, которым задавали по 1000 спорулированных ооцист/мл во все сроки находили ооцист в количестве от 2,7 до 52,3 в камере, а средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 34,4. Количество ооцист в 1 г помета по данной группе составило 6880 и, это был наибольший показатель среди зараженных цыплят. Сравнивая между собой показатели 1-й (2000 ооцист/мл) и 2-й группы (1000 ооцист/мл) можно предположить, что спорулированные ооцисты кокцидий в кишечнике цыплят 2-й группы имели наилучшую приживаемость, о чем свидетельствуют результаты ежедневных (с 6 по 12 дни) исследований проб помета. Доза спорулированных ооцист 2000/мл, по-видимому, задавалась с гарантией, то есть с определенным запасом прочности, хотя особой необходимости в этом не было. В биологическом плане для цыплят 14дневного возраста для экспериментального заражения оптимальной была доза 1000 ооцист/мл.
Цыплята 3-й и 4-й групп зараженного контроля, получавшие по 250 и 125 ооцист/мл во все сроки исследований с пометом выделяли ооцисты, и в показателях имели между собой много общего. Так, количество ооцист колебалось от 0,33 до 14,5-14,6, а средний показатель в 1 -й камере за период исследований составил 8,9 и 7,65 соответственно. Количество ооцист в 1 г помета по этим группам составило 1780 и 1530.
У цыплят 5-й и 6-й групп, которым назначали по 62 и 15 ооцист/мл соответственно в первый срок исследований (через 6 суток) ооцист в помете не находили. В другие сроки исследований у цыплят 5-й группы количество ооцист колебалось от 2,5 до 6,7, и средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 3,31, а количество ооцист в 1 г помета равнялось 6,62. Тогда как у цыплят 6-й группы количество ооцист было незначительное, колебания составили от 0,16 до 1,5, средний показатель - 0,47 и количество ооцист в 1 г помета 94.
При анализе количественных показателей по выделению ооцист эймерий с пометом экспериментально зараженных цыплят заметна определенная цикличность. Если при исследовании в первый срок (через 6 суток) ооцист находили в помете незначительно или они отсутствовали, то во
456
второй, третий и четвертый сроки (через 7, 8 и 9 суток после дачи ооцист) их было достаточно много. В пятый срок исследований (через 10 суток) ооцист в помете находили заметно меньше, затем их количество было значительно больше.
Анализ результатов экспериментального заражения цыплят путем дачи им культуры спорулированных ооцист кокцидий показывает наличие линейной зависимости между дозой заражения и количеством выделяемых с пометом ооцист за проведенный нами период исследований. Анализ линейной регрессии был проведен между логарифмическим значением дозы ооцист, которой цыплята были заражены и общим количеством всех выделенных в помете ооцист.
Уравнение, описывающее градуировочную кривую имеет вид:
У=А+Вх, где
у - кривая общего количества ооцист в помете, х - кривая дозы заражения,
А и В - коэффициент регрессии (диаграмма 1).
Используя формулу, описывающую процесс заражение инокулята известной величины можно вычислить из числа выделенных с пометом ооцист
Х=(у-А):В
Заключение. Исследования по экспериментальному заражению цыплят-бройлеров 14-дневного возраста разными дозами спорулированных ооцист E.tenella показали успешное функционирование данной модели. Во всех группах, где цыплятам давали инвазионный материал с шестого дня после назначения, имело место выделение ооцист эймерий, что свидетельствует об успешности заражения. Количественный анализ выделения ооцист с пометом зараженных цыплят показал наличие определенной цикличности, тем не менее, наибольшее их количество в помете было через 7, 8 и 9 суток после дачи ооцист. Наибольшее количество ооцист в помете было у цыплят 1 и 2-й групп, которым задавали по 2000 и 1000 спорулированных ооцист. Анализ результатов исследований показал наличие линейной зависимости между дозой заражения и количеством выделенных с пометом ооцист за проведенный нами период исследований.
Литература: 1. Бакулин В.А. Болезни птиц. - С.-Петербург, 2006. -686с. 2. Вершинин И.И. Кокцидиозы животных и их дифференциальная диагностика. - Екатеринбург, 1996. - 264с. 3. Кириллов А.И. Кокцидиозы птиц. - М., 2008. - 230с. 4. Колабский Н.А., Пашкин П.И. Кокцидиозы сельскохозяйственных животных. - Л., 1974. - 159с. 5. Крылов М.В. определитель паразитических простейших. - С.-Петербург, 1996, Зоологический институт РАН. - 693с.
Experimental Eimeria tenella model in chickens. Safiullin R.T., Murzakov R.R., Andrejanov O.N. All-Russian K.I. Skryabin Scientific Research Institute of Helminthology.
Summary. One performed experimental infection of broilers aged 14 days at different doses of Eimeria tenella oocysts 2000; 1000; 250; 125; 62 and 15
457
specimens per bird. The excretion of Eimeria oocysts in faeces was noted beginning from 6 day of infection. The highest number of oocysts in faeces was recorded in broilers received 2000 and 1000 sporulated oocysts. The direct dependence between infection dose and number of excreted oocysts was established.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КЕНОКОКСА ПРОТИВ ООЦИСТ ЭЙМЕРИЙ ПТИЦ В УСЛОВИЯХ ПРОИЗВОДСТВА
Сафиуллин Р.Т., Мурзаков Р.Р.
ВНИИ гельминтологии им. К.И. Скрябина
Введение. В птицеводстве многих стран мира, в том числе и России распространенными заболеваниями, причиняющими заметный экономический ущерб, являются эймериоз, аскаридиоз, гетеракидоз, дерманиссиоз и другие паразитозы. Работами отечественных и зарубежных ученых доказано, что любое птицеводческое хозяйство, практикующее напольное содержание птиц, неблагополучно по паразитарным болезням особенно по эймериозу. Установлено, что предотвратить потери от эймериоза молодняка кур можно лишь в том случае, если проводить комплекс мероприятий против эндо- и экзогенных стадий возбудителя и при умелом использовании
профилактических обработок с применением современных высокоэффективных кокцидиостатиков. К сожалению, часто кокцидиостатики не полностью подавляют развитие эймерий, заболевание приобретает скрытый характер, без видимых проявлений. Резистентность и продуктивность такой птицы резко снижается и гибель может наступить от любого другого заболевания. Выйти из сложившейся ситуации можно с помощью санитарногигиенических мероприятий, направленных на уничтожение паразита во внешней среде, что обезопасит цыпленка хотя бы в первые дни после посадки в птичник и позволит нормально развиваться. Следует помнить, что ооцисты кокцидий покрыты плотной защитной оболочкой и весьма устойчивы во внешней среде. Использование растворов традиционных химических средств дезинвазии, таких как 2-3%-ного формалина, 2-4%-ного едкого натрия, 5%-ной кальцинированной соды, 3-5%-ного креолина, 4%-ного ксилонафта, хлорной извести с содержанием 3%-ного активного хлора, 20%-ной взвеси свежегашеной извести и других не дают значимого результата. Применение этих препаратов для уничтожения ооцист во внешней среде требует длительной экспозиции и температура рабочего раствора должна быть не ниже 800С. Из числа физических методов дезинвазии можно отметить использование пламени огня, но из-за пожарной безопасности и возможности разрушения оборудования и конструкций использование данного метода ограничено. Исходя из отмеченного, перед собой поставили задачу испытать в условиях производства эффективность 4%-ного раствора препарата кенококс
458
