Научная статья на тему 'Технология получения фикоцианина из термофильных синезеленых водорослей как пищевой добавки'

Технология получения фикоцианина из термофильных синезеленых водорослей как пищевой добавки Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

CC BY
1118
229
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Ефимов А. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Технология получения фикоцианина из термофильных синезеленых водорослей как пищевой добавки»

664.022

ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФИКОЦИАНИНА ИЗ ТЕРМОФИЛЬНЫХ СИНЕЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ КАК ПИЩЕВОЙ ДОБАВКИ

А.А. ЕФИМОВ

Камчатский государственный технический университет

Цвет пищевых продуктов, их внешняя привлекательность играют большую роль в реализации продуктов питания, оценке их стоимости и конкурентоспособности. Появление в начале ХХ в. ярких и стойких синтетических красителей, во многом вытеснивших натуральные пигменты, обострило вопрос о безопасности и гигиенической оценке красителей и привело к возникновению ряда законодательных документов в этой области.

Природные красители - естественные компоненты пищевых продуктов или биологических объектов, не употребляемые обычно в качестве продуктов питания или составной их части. Натуральные красители как правило выделяют из природных источников в виде смеси соединений, различных по своей химической природе, состав которой зависит от источника и технологии получения, в связи с чем бывает сложно обеспечить его постоянство. Натуральные красители обычно не обладают токсичностью, но для многих из них установлены допустимые суточные дозы. Некоторые натуральные красители обладают биологической активностью.

Фикоцианин - специфический фотосинтетический пигмент синезеленых водорослей, входящий в состав тетрапиррольных пигментов фикобилинов вместе с фикоэритрином и аллофикоцианином. Фикоцианин -основной пигмент данной группы (синего цвета) -комплекс фикоцианобилина с белком, его молекулярная масса составляет 226 кДа [1]. В зарубежной практике фикоцианин используют как пищевой краситель, как колорант в косметической промышленности [2, 3]. Кроме того, фикоцианин - биологически активное вещество, обладает антиоксидантной, антивирусной активностью [4, 5].

Для выделения фикоцианина нами предложено использование биомассы термофильных синезеленых водорослей - обитателей горячих источников с температурой 45-55°С. Это обусловлено способностью водорослей к быстрому воспроизводству биомассы -50 мг сухого вещества в час с 1 м2 поверхности - в условиях высоких температур и постоянством химического состава термальных вод природных источников, что позволяет осуществлять искусственное культивирование водорослей с наименьшими затратами. Результаты исследований, проведенных нами в 1995-2006 гг., показали, что возможно и перспективно промышленное культивирование синезеленых водорослей [6].

Цель исследований - определение способов, технологических режимов выделения фотопигмента фикоцианина из термофильных синезеленых водорослей и получения из него пищевой добавки - пищевого красителя.

В качестве сырья использовали биомассу термо -фильных синезеленых водорослей рода Ркогт1ёшт, культивированных в искусственных условиях.

Для получения пищевой добавки биомассу водо -рослей промывали с целью удаления загрязнений и компонентов среды культивирования. Промывание производили на сите с размером ячеи 1,0 х 1,0 мм пресной питьевой водой, соответствующей требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01, с температурой < 20°С, расход воды составил 10 : 1.

Размер ячеи сита оказывает влияние на потери биомассы за счет потери отдельных клеток, целых водорослевых нитей с промывными водами. Для выбора размера ячеи промывание проводили на ситах с размером ячеи 1,5 х 1,5; 1,0 х 1,0; 0,5 х 0,5 мм. Синезеленые водоросли рода Ркогт1сИыт образуют длинные нити (трихомы), связанные между собой полисахаридной слизью. Такие структуры хорошо задерживаются на сите с крупной (1,5 х 1,5 мм) ячеей. Минимальные потери - 0,5% от массы исходного сырья - получили при использовании сита с размером ячеи 0,5 х 0,5 мм. Однако при этом из-за забивания ячеи сита биомассой резко возрастала продолжительность промывания. Оптимальным оказалось промывание биомассы на сите с размером ячеи 1,0 х 1,0 мм.

Промывание вели до исчезновения в промывной воде следов сульфат-ионов, определяемых реакцией с ионами бария, так как содержание сульфат-ионов в питательной среде при культивировании синезеленых водорослей наибольшее. Для равномерности протекания процесса промывание проводили при медленном, осторожном перемешивании, когда клеточные стенки не повреждаются, не происходит их вымывания и потерь внутриклеточного содержимого.

После промывания биомассу хранили до дальнейшей переработки. Условия хранения оказывают значительное влияние на состояние и выход целевых веществ.

Фикоцианин по своей химической природе - сложный белок, характеризующийся химической и микробиологической лабильностью. Как фотопигмент фикоцианин изменяет свои свойства при воздействии света. При хранении биомассы необходимо обеспечить такие условия, которые предотвращают изменения фикоциа-нина, обеспечивают его максимальный выход как готового продукта.

Исследовали такие способы хранения до обработки, как охлаждение, замораживание, сушка. Изменения в биомассе определяли по содержанию небелкового азота как показателю порчи белка и по содержанию фикоцианина. Для предотвращения изменений фотопигментов хранение проводили в темноте. Предельный срок хранения без охлаждения при 20°С определяли по органолептическим показателям и по содержанию небелкового азота; он составил < 6 ч. При хранении в охлажденном до 4-9°С состоянии в течение 5 сут содержание фикоцианина не изменялось, однако уже через 3 сут повышение содержания небелкового азота и появление неприятного запаха свидетельствовали о начальной стадии порчи. Предельный срок хранения при 4-9° С - до 48 ч.

При хранении биомассы в замороженном состоянии при -18°С не только не снизилось содержание фикоцианина, но у величился его выход до 84% от начального содержания в биомассе за счет дезинтеграции субклеточных чехлов и клеточных стенок при замораживании-размораживании. Тем не менее, увеличение выхода пигмента при такой дезинтеграции оказалось ненамного большим, чем при проведенной на дальнейших этапах технологии механической гомогенизации. С учетом значительных энергетических затрат на замораживание и холодильное хранение этот способ хранения биомассы не имеет преимуществ перед охлаждением. Сушка биомассы потоком воздуха с температурой 35°С приводила к снижению последующего выхода фикоцианина до 56%.

Оптимальным вариантом с точки зрения предотвращения порчи, выхода готового продукта, снижения затрат являлось хранение биомассы до обработки в охлажденном до 4-9°С состоянии в течение 48 ч.

После промывки биомассы содержание влаги в ней достигало 95%, что требовало на дальнейших операциях повышенного расхода компонентов - буферного раствора, реагентов для фракционирования. Значительная часть влаги являлась свободной, находилась на поверхности водорослевой массы и легко удалялась отстаиванием, фильтрованием, центрифугированием. Фильтрование и отстаивание проводили на сите с размером ячеи 1,0 X 1,0 мм до прекращения отделения воды. Продолжительность процесса 35-40 мин. При таком способе отделения влаги содержание сухих веществ в массе составило около 15%, что недостаточно для проведения дальнейших операций. Более полного отделения влаги достигали центрифугированием при режимах 400, 600, 800, 1000 об/мин. При частоте вращения 800 об/мин обнаруживали признаки разрушения клеточных оболочек и вытекания внутриклеточного содержимого - промывная вода приобретала сине-фиолетовый цвет. Скорость отделения влаги при увеличении продолжительности центрифугирования уменьшалась и после 2 мин центрифугирования при 600 об/мин становилась незначительной. Оптималь-ный режим центрифугирования: частота вращения 600 об/мин, продолжительность2 мин. При этом остаточное содержание сухих веществ составило 20%.

После отделения влаги проводили дезинтеграцию клеток водорослей, которая должна обеспечивать оптимальную степень разрушения клеточных стенок и сохранение нативных свойств выделяемых компонентов. Дезинтеграция необходима для оптимизации дальнейших экстракционных процессов.

Экстрагирование водорастворимого белка фико-цианина происходило и при неразрушенных клеточных стенках, через 4-5 сут экстракт приобретал сине-фиолетовый цвет. При получении пигмента в промышленных масштабах такая скорость экстракции недостаточна. Необходимо разрушить клеточные стенки и чехлы трихомов, отделить фикобилипротеиновые антенные комплексы от наружной поверхности тила-коидных мембран клеток и перевести их в раствор. При этом нежелательно дальнейшее измельчение де-зинтеграта, разрушение тилакоидных мембран и хлорофилловых комплексов, агрегированных внутри и на поверхности мембран. При чрезмерной дезинтеграции раствор билипротеинов загрязнялся очень тонкой взвесью органелл, хлорофилловых комплексов, проходивших через тонкие фильтры, практически не отделявшихся отстаиванием, а при центрифугировании разделявшихся только на очень высоких оборотах. Отделение таких компонентов при фракционировании билипротеинов требовало введения дополнительной операции - предварительного осаждения загрязняющих компонентов, высокого расхода реагентов. Выход фикоцианина при неполной дезинтеграции снижался на 2,5%, так как часть белков оставалась связанной с неразрушенными тканями. Однако при этом не наблюдали выхода хлорофилла, не требовалось проведения дополнительных технологических операций и дополнительного расхода реагентов.

Ферментативные и химические методы дезинтеграции клеток сопровождаются изменением фикобили-протеинов, поэтому они в работе не рассматривались.

Применение замораживания-размораживания, как показало микроскопирование, не обеспечивало достаточной степени разрушения клеточных стенок. Кроме того, этот процесс длителен и энергоемок, и его целесообразно применять как дополнительный при использовании мороженого сырья.

Механическую дезинтеграцию проводили в блендере ножевого типа при минимальных скоростях во избежание нагрева продукта - 1000 об/мин в течение 15, 30, 45, 60 с. Продолжительность измельчения устанавливали исходя из требуемой степени измельчения, разрушение трихома и клеточных стенок контролировали микроскопированием. При продолжительности измельчения менее 45 с в образцах обнаруживали многочисленные неразрушенные трихомы. При продолжительности дезинтеграции свыше 45 с в растворе присутствовала трудноотделяемая взвесь. Оптимальным режимом механической дезинтеграции определили частоту вращения 1000 об/мин при продолжительности 45 с.

Затем проводили экстрагирование комплекса фи-кобилипротеинов водой. В целях повышения концен-

трации растворенных компонентов и снижения расхода реагентов использовали растворы, извлеченные из дезинтегрированной массы, которые составляли 80% от массы исходного продукта. Разбавление водой не ускоряло процесса экстрагирования. Для ускорения процесса, особенно без добавления экстрагента, применяли перемешивание при частоте 60 об/мин. Продолжительность процесса определяли по скорости накопления продуктов экстракции - водорастворимых фотопигментов. Скорость накопления пигментов контролировали по оптической плотности раствора и по достижению равновесной концентрации в жидкой фазе. При 40С и скорости перемешивания 60 об/мин рав -новесной концентрации достигали через 1,25 ч. Для извлечения остаточных фикобилипротеинов из твердой фазы использовали повторную экстракцию свежей порцией растворителя в соотношении 1 : 1 в течение 30 мин и затем объединяли полученные экстракты. Применение двухступенчатой экстракции позволило увеличить выход фикобилипротеинов на операции на 4%.

После экстрагирования в жидкой фазе содержался комплекс водорастворимых фотопигментов, в том числе фикоцианин, в твердой фазе - хлорофилл и кароти-ноиды. Полного осаждения твердой фазы и получения плотного осадка без потерь фикоцианина достигали при факторе разделения > 900g (где g - ускорение свободного падения, м/с2) и центрифугировании в течение 4 мин.

Фракционирование фикобилипротеинов производили высаливанием сульфатом аммония в присутствии фосфатного буфера при рН 7. В исходном растворе, по результатам спектральных анализов, присутствовали фикоцианин и фикоэритрин. При добавлении 80% насыщенного раствора сульфата аммония в осадок выпадал фикоцианин. Процесс проводили при 40С в темноте. Полное выпадение осадка фикоцианина наблюдали через 2-3 ч. Отделение осадка производили при значении фактора разделения 1240g в течение 10 мин. При меньших значениях фактора разделения и продолжительности осаждения получили неполное осаждение и неплотный, сильно загрязненный растворенным фико-эритрином осадок

Выделившийся осадок фикоцианина из-за соосаж-дения примесей содержал значительное - до 20% - количество фикоэритрина. Очистку фикоцианина производили методом переосаждения. Осадок суспендировали в равном количестве буферного раствора и при добавлении 80% насыщенного раствора сульфата аммония осаждали повторно.

Полученный осадок имел характерную для фикоцианина синюю окраску, слабую красную флуоресценцию, содержал незначительное количество фикоэрит-рина и был загрязнен неорганическими солями, в основном сульфатом аммония. Для удаления низкомолекулярных примесей использовали процесс диализа через полупроницаемые мембраны - целлофан и перга-

мент. В качестве чистого растворителя использовали питьевую воду. Конструкция лабораторной установки для диализа предусматривала создание постоянного притока чистого растворителя в камеру пермеата и постоянный отвод отработанного пермеата. Содержащиеся в растворе низкомолекулярные вещества за счет диффузии через поры мембраны проходили в зону пермеата, через которую непрерывно протекала чистая вода. Фикоцианин как высокомолекулярное соединение оставался в растворе. Таким образом достигали обес-соливания. Процесс перехода сульфата аммония в пер-меат, а также остаточное количество сульфата аммония в растворе контролировали качественной реакцией на ионы аммония с реактивом Несслера. Отсутствие белков в пермеате проверяли биуретовой реакцией. Более быстро - в течение 4 ч - полной очистки раствора достигали при использовании пергамента в качестве полупроницаемой мембраны.

Полученный осадок фикоцианина содержал 70% влаги. Для получения готового продукта - порошкообразного фикоцианина применяли процесс сушки осадка в потоке воздуха. Оптимальные результаты были достигнуты при температуре сушки 35°С. При более высокой температуре функциональные свойства фикоцианина, в том числе его растворимость, снижались. Полученный после высушивания порошок синего цвета полностью растворялся в воде.

Показатели безопасности готового продукта определяли на базе лаборатории ГУППП « Камчатпищепро-дукт», ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Камчатской области», степень токсичности определяли с использованием в качестве тест-объекта реснитчатой инфузории Tetrahymena pyriformis.

Таким образом, на основе лабораторных методов обоснована технология получения пигмента фикоциа-нина из биомассы термофильных синезеленых водорослей - естественного богатого источника этого вещества.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мокроносов А.Т., Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В.

Фотосинтез. Физиолого-экологические и биохимические аспекты. -М.: Академия, 2006. - 448 с.

2. Cohen Z. Product from Microalgae // Richmond A. Handbook of Microalgal Mass Culture. - CRC Press Inc. Boca Raton, 1986. - Р. 421-454.

3. Yoshinda A., Takagaki Y., Nishimune I . Enzyme immunoassay for phycocyanin as the main component of Spirulina colour in food biotechnology // Biochem. - 1996. -60. - Р. 57-60.

4. Anti-inflammatory activity of Phycocyanin extract in acetic acid induced colitis in rats / R Gonzalez., S. Rodriguez, C. Romay et al. // Pharmacological Research. - 1999. - № 39. - 1. - Р. 55-59.

5. Antiviral activity of Spirulina maxima against herpes simplex virus type 2 / A. Henrndez-Corona, I. Nieves, M. Meckes et al. // Antiviral Research. - 2002. - № 56. - 3. - P. 279-285.

6. Пат. 2 292389 РФ. Способ культивирования термофильных цианобактерий / М.В. Ефимова, Т.И. Кузякина, А. А. Ефимов // БИПМ. - 2007. - № 3.

Кафедра технологии рыбных продуктов

Поступила 20.07.07 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.