CC BY
352
Новое в пищевых технологиях
С.В. СУХОВЕРХОВ
Новый подход к получению пигментов из красной водоросли Лкн/гШа 1оЪисМе№1ъ. Изучение влияния температурной обработки и сроков хранения на их качественный и количественный состав
Исследовано влияние условий хранения и методов экстракции на качественный и количественный состав пигментов из красной водоросли АИп/еШа tobuchiensis. Изучено изменение состава пигментов из А. юЪы-chiensis при температурной обработке и хранении.
В настоящее время в мире существует устойчивая тенденция перехода от синтетических пищевых красителей к натуральным и ведутся интенсивные поиски сырья для их производства. Наша пищевая промышленность испытывает дефицит безвредных натуральных красителей для производства пастилы, зефира, мармелада, газированных напитков и других продуктов питания.
Известно, что красные водоросли содержат такие пигменты, как фикоэритрин, фикоцианин и аллофикоцианин, различные соотношения которых и обусловливают их цвет от ярко-малинового до синего [1, 3, 5]. Эти пигменты активно участвуют в процессах фотосинтеза в водорослях и являются резервными белками [18-21]. Пигменты фикоэритрин, фико-цианин и аллофикоцианин являются безвредными натуральными красителями и представляют интерес для пищевой и косметической промышленности. Кроме этого они могут быть использованы в медицине в качестве иммуностимуляторов и при создании новых диагностических препаратов [13, 14].
Фикоэритрин, фикоцианин и аллофикоцианин представляют собой кислые водорастворимые глобулярные белки, относящиеся к группе фикобилипротеинов. Молекулы фикобилипротеинов состоят из нескольких небольших субъединиц с молекулярной массой около 20 кДа, а простетические группы ковалентно присоединены к белку и могут быть удалены лишь после жесткого химического воздействия. В зависимости от того, в каких водорослях обнаружены фикоэритрины и фи-коцианины, у ЯЪо^рЬу1а или у СуапорИуа, перед их названием ставится буква Я- или С- [3].
У билипротеинов разных видов водорослей несколько отличаются как белковые части, так и хромофорные группы (фикобилины). Белковые части имеют разную молекулярную массу и изоэлектрические точки (обычно рН от 4,3 до 7,2). Фикобилины отличаются главным образом положением двойных связей. По химическому строению они представляют собой производные терапиррольной системы, построенной по типу открытой цепи, а не в виде закрытого порфиринового кольца, как у хлорофилла или гемма (рис. 1) [3, 21].
Рис. 1. Структуры фикобилипротеинов: PCB - фикоцианобилин, PEB -фикоэритробилин, PUB - фикоуробилин
Хромофорами простетических групп фикоцианина и фикоэритрина являются соответственно фикоцианобилин (PCB) и фикоэритробилин (PEB). Некоторые билипротеины могут содержать два различных хромофора, например фикоцианин из Rhodophyta включает как фикоцианоби-лин, так и фикоэритробилин [3]. Кроме фикоцианобилина и фикоэритро-билина R-фикоэритрин и аллофикоцианин из красных водорослей могут содержать фикоуробилин (PUB) [21]. Фикоцианобилин, фикоэритроби-лин и фикоуробилин ковалентно связаны с белком, и их отделение возможно только при действии достаточно сильных реагентов - хлороформа, метанола, концентрированных растворов кислот и оснований [14].
Хотя все фикоэритрины, выделенные из водорослей, обладают характерным главным максимумом поглощения при 560-570 нм, спектры поглощения фикоэритринов из разных видов водорослей могут различаться. Это также относится к фикоцианинам (A,max = 610-620 нм) и алло-фикоцианинам (Xmax = 650-670 нм) [3, 21, 23].
В начале 1990-х гг. в России проводились исследования по разработке технологии получения натуральных красителей из водорослей Ahnfeltia tobuchiensis и Gracilaria verrucosa и была предложена комплексная технология по переработке красных водорослей с извлечением пигментов, полисахаридов и переработке отходов для производства пи-
щевых и кормовых добавок [6, 11, 12]. Данная технология предусматривала на первом этапе измельчение свежей водоросли до размера частиц 100 мкм, а затем выделение комплекса пигментов (Я-фикоэритрина и Я-фикоцианина). На следующем этапе проводили экстракцию агара, а водорослевый остаток после выделения агара использовали для получения кормовой добавки для животных. Несмотря на целый ряд преимуществ, комплексная технология переработки красных водорослей имеет недостатки, которые без дополнительной доработки не позволяют внедрить ее в промышленность. Во-первых, в этом процессе используются свежедо-бытые водоросли, следовательно, производство не может функционировать круглый год и должно быть расположено недалеко от места добычи водорослей. Во-вторых, не отработана технология измельчения свежих водорослей до размера частиц 50-100 мкм. В-третьих, выделяемый комплекс пигментов термически нестоек и неустойчив при хранении, что затрудняет его использование в пищевой промышленности, кроме того, он не прошел проверку на пищевую пригодность.
Задачей наших исследований на первом этапе стал выбор способа хранения водорослей для круглогодичной переработки и подбор оборудования для измельчения и экстракции пигментов из А. tobuchiensis. Не решив эти задачи, нельзя получить промышленные партии красителя, разработать и утвердить нормативно-техническую документацию, провести исследования по поиску стабилизаторов и консервантов для увеличения сроков хранения и повышения термической устойчивости пигментов.
Для того чтобы производство по получению пигментов функционировало круглогодично, необходимо иметь постоянный запас сырья. Наиболее распространенным методом заготовки водорослевого сырья для длительного хранения является сушка, кроме этого возможно консервирование с формалином или №С1, а также замораживание [8, 9]. Мы изучали влияние способов хранения на качественный и количественный состав пигментов. В экспериментах использовали красную водоросль А. tobuchiensis, добытую в июле, сентябре и октябре 2002 г. в прол. Старка зал. Петра Великого Японского моря. Собранный материал очищали от ракушечника, диатомовых водорослей и промывали в морской воде. Одну часть образцов высушивали в проветриваемом помещении, защищенном от попадания прямых солнечных лучей, упаковывали в бумажные мешки и хранили в затемненном помещении. Другую часть упаковывали в полиэтиленовые пакеты и хранили при температуре 0-4 оС. Третью часть упаковывали в полиэтиленовые пакеты, герметично запаивали, замораживали и хранили при температуре минус 18 оС от одного месяца до года. Для химико-технологических экспериментов пробы водоросли дважды промывали пресной водой и подсушивали между листами фильтровальной бумаги. Для изучения брали среднюю пробу водоросли.
Исследовали экстракты пигментов из свежей и высушенной водоросли, а также хранившейся при 0-4 оС и при минус 18 оС. Идентификацию и количественное содержание фикоэритрина, фикоцианина и алло-фикоцианина в экстрактах определяли по спектрам поглощения света. Спектры поглощения пигментов снимали на спектрофотометре SЫmadzu
иУ-2100 (Япония) с длинами волн от 360 до 700 нм. Концентрацию пигментов в экстракте определяли по формуле, вытекающей из закона Бу-гера-Ламберта-Бера [4]:
E
C =-----1000,
8-1
где С - концентрация пигментов, мг/л; Е - оптическая плотность раствора в главном максимуме поглощения пигмента (табл. 1); 1000 - коэффициент пересчета; 8- коэффициент экстинкции, л/г - см (табл. 1); I - длина кюветы, см.
Таблица 1
Максимумы поглощения и коэффициенты экстинкции фикобилипротеинов [10,13, 22]
Фикобилипротеины ^шах, нм 8, л/г - см
Фикоэритрин 563 8,02
Фикоцианин 620 7,3
Аллофикоцианин 670 5,8
На спектре поглощения света экстрактом из свежей водоросли хорошо видны пики, соответствующие максимумам поглощения Я-фико-эритрина (496, 538 и 563 нм), Я-фикоцианина (620 нм) и аллофикоциа-нина (672 нм) (рис. 2). На спектре поглощения света экстрактом из высушенной водоросли имеется только один максимум при 494 нм, соответствующий продуктам разложения Я-фикоэритрина. Спектр поглощения света экстрактом из водоросли, хранившейся в холодильнике при температуре 0-4 оС, имеет максимумы 496, 538 и 563 нм, соответствующие максимумам Я-фикоэритрина. Пиков, соответствующих максимумам поглощения Я-фикоцианина и аллофикоцианина, нет. На спектре поглощения света экстрактом из водоросли, хранившейся при минус 18 оС, имеются пики, соответствующие максимумам поглощения Я-фикоэритрина (496, 538 и 563 нм) и аллофикоцианина (672 нм). Пика, соответствующего максимуму поглощения Я-фикоцианина, нет (рис. 2).
Количественное содержание Я-фикоэритрина в экстрактах из свежей и хранившейся при минус 18 оС А. tobuchiensis практически одинаково, а в других экстрактах значительно ниже (табл. 2). Содержание аллофикоцианина в водоросли, хранившейся при минус 18 оС, в 3,5 раза ниже, чем в экстракте из свежей водоросли, в экстрактах из других образцов он отсутствует. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее подходящим способом хранения А. tobuchiensis для последующего выделения пигментов является упаковывание в герметично запаянные полиэтиленовые пакеты, замораживание и хранение при температуре минус 18 оС. Поэтому в дальнейшей работе использовались именно эти образцы.
Некоторую сложность при выделении пигментов представляет измельчение водорослей. Фотосинтетические пигменты содержатся в протяженной системе внутренних мембран хлоропласта, которые являются тем местом в клетке, где происходит фотосинтез [3, 14, 21]. Для того
чтобы выделить эти пигменты из водорослей, необходимо разрушить их клеточную структуру. Известно большое количество измельчителей и дезинтеграторов для неорганических веществ, материалов растительного и животного происхождения, основанных на разных принципах действия [2, 17].
Рис. 2. Спектры поглощения света экстрактами пигментов из свежей водоросли (1), высушенной водоросли (2), хранившейся при 0-4 оС (3) и при минус 18 оС (4)
Таблица 2
Качественный и количественный состав пигментов в экстрактах из A. tobuchiensis
Образец водоросли Концентрация пигментов, мг/л
R-фикоэритрин R-фикоцианин Аллофикоцианин
Свежая 129,4 34,2 93,1
Высушенная 29,0 - -
Хранившаяся при 0-4 оС 61,0 - -
Хранившаяся при минус
18 оС 121,6 - 27,2
Мы исследовали возможность применения для измельчения замороженной и хранившейся при минус 18 оС водоросли A. tobuchiensis следующих приборов: коллоидной мельницы МКС.000 (Дальреммаш, Россия), измельчителя типа дисмембратора Tecator Cemotec 1090 Sample Mill (Tecator, Япония) и вибрационной мельницы CMT Vibrating Sample Mill TI-100 (CMT Co. Ltd, Япония).
Проведенные испытания показали, что коллоидная мельница МКС.000 и измельчитель Tecator Cemotec 1090 Sample Mill не подходят для измельчения A. tobuchiensis. При использовании вибрационной
мельницы CMT Vibrating Sample Mill TI-100 происходит измельчение A. tobuchiensis до частиц размером от 100 до 500 мкм. Если проводить измельчение в водной среде (соотношение по массе водоросли и воды 1:20), то одновременно проходит и экстракция пигментов из водоросли. Спектр поглощения света экстрактом, полученным при использовании вибрационной мельницы, имеет пики, соответствующие максимумам поглощения света R-фикоэритрина (496, 538 и 563 нм) и аллофикоциа-нина (672 нм).
Состав экстракта пигментов из A. tobuchiensis исследовали методом ВЭЖХ. Разделение проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-6A (Япония) с колонкой Shodex Asahipak GS-620 (Showa Denko, Япония), элюент - дистиллированная вода, скорость - 1 мл/мин. Детектор 1 - УФ Shimadzu SPD-6AV (длины волн - 280, 496, 563, 620 и 672 нм), детектор 2 - дифференциальный рефрактометр Shimadzu RID-6A. Процентное соотношение пигментов и белковых примесей в пробе рассчитывали по сигналу рефрактометрического детектора [15, 16].
На хроматограмме первым пиком выходит аллофикоцианин, имеющий сильное поглощение при 672 и 280 нм и слабое при 563 нм (рис. 3). Следом, практически не разделяясь, выходит пик R-фикоэрит-рина, имеющий поглощение при 563 и 280 нм. Последними выходят белковые примеси, имеющие поглощение только при 280 нм. По данным ВЭЖХ содержание аллофикоцианина и R-фикоэритрина в экстрактах составляет от 25 до 40%, а белковых примесей - от 60 до 75%.
R-фикоэритрин +
аллофикоцианин
Рис. 3. Хроматограммы экстракта пигментов из A. tobuchiensis
Методами спектроскопии и ВЭЖХ исследовали динамику экстракции аллофикоцианина и Я-фикоэритрина из А. 1оЬисЫгт18 при использовании вибрационной мельницы. Установлено, что пигменты интенсивно
извлекаются из водоросли в первые 5-7 мин экстракции и концентрация R-фикоэритрина и аллофикоцианина в экстракте достигает соответственно 110,1 и 25,5 мг/л. Столь быстрое протекание процесса экстракции можно объяснить тем, что кроме обычной молекулярной диффузии при использовании вибрационной мельницы значительное количество вещества переносится конвективной диффузией, скорость которой до 1012 раз выше молекулярной [2, 7]. Это связано с тем, что в вибрационной мельнице движение жидкости носит турбулентный характер и, как следствие, переносятся не отдельные молекулы, а небольшие объемы раствора.
Таким образом, показано, что наиболее подходящим способом выделения пигментов из A. tobuchiensis является экстракция дистиллированной водой (соотношение по массе водоросли и воды 1:20) в вибрационной мельнице CMT Vibrating Sample Mill TI-100, время экстракции - 7 мин, температура комнатная.
Важным фактором, определяющим качество красителя и возможность его применения в пищевой промышленности, является его стойкость при действии повышенной температуры. Проведенные исследования пигментов из красной водоросли A. tobuchiensis [6, 11, 12] показали, что они неустойчивы при хранении и температурной обработке, а это затрудняет их использование в пищевой промышленности. Поэтому для успешного поиска стабилизаторов и консервантов с целью увеличения сроков хранения и повышения термической устойчивости пигментов из A. tobuchiensis необходимо изучить изменение качественного и количественного состава пигментов при хранении и термической обработке.
Для исследования влияния температурной обработки на качественный и количественный состав пигментов из A. tobuchiensis использовали термостат Shimadzu STO-2A (Япония). В стеклянную виалу объемом 4 мл помещали 3 мл экстракта пигментов из A. tobuchiensis, образец закрывали крышкой и нагревали в термостате при температуре 40, 50, 60, 70, 80 или 90 оС в течение 15 мин. После охлаждения пробы снимали спектры поглощения света на спектрофотометре Shi-madzu UV-2100 и по ним рассчитывали остаточную концентрацию пигментов в экстракте.
Исследование влияния температурной обработки на качественный и количественный состав пигментов из A. tobuchiensis показало, что при нагревании раствора пигментов до температуры 50 оС спектры поглощения света практически не изменяются (рис. 4). При повышении температуры до 60 оС начинается разрушение R-фикоэритрина, уменьшается интенсивность поглощения света при 496, 538 и 563 нм. При нагревании раствора до 70 оС происходит окончательное разрушение R-фикоэрит-рина, исчезают максимумы поглощения при 538 и 563 нм, остается только максимум поглощения при 496 нм. Аллофикоцианин является более устойчивым к нагреванию пигментом: даже при нагревании до 90 оС остается максимум поглощения света при 672 нм. Изменение количественного содержания R-фикоэритрина и аллофикоцианина при нагревании показано в табл. 3.
о 360 400 500 600 700 о
о о
Длина волны, нм
Рис. 4. Спектры поглощения света экстрактами пигментов, обработанных при температуре 20 оС (1), 50 оС (2), 60 оС (3) и 70 оС (4)
Таблица 3
Качественный и количественный состав пигментов из А. ЁоЬисН1еп515 после температурной обработки
Температура, оС Концентрация пигментов, мг/л
Я-фикоэритрин Аллофикоцианин
20 121,6 27,2
40 121,6 24,7
50 110,5 23,1
60 84,5 21,8
70 - 21,8
80 - 21,7
90 - 21,7
Далее исследовали устойчивость Я-фикоэритрина и аллофикоциа-нина из А. 1оЬисЫет1з при хранении. Экстракт пигментов хранили в холодильнике при температуре 0-4 оС в течение 30 дней, а затем снимали спектры поглощения света (рис. 5). На спектрах поглощения света растворами пигментов видно, что при хранении происходит разрушение Я-фикоэритрина и его содержание в экстракте снижается с 129,0 мг/л до 66,5 мг/л, т.е. практически в 2 раза. Еще менее устойчивым при хранении оказался аллофикоцианин, его содержание в экстракте снизилось с 93,1 мг/л до 11,2 мг/л, т.е. практически в 8,5 раз.
Методом ВЭЖХ в условиях, описанных выше, исследовали состав экстракта пигментов из А. 1оЬисЫет\з, хранившегося 30 дней в холодильнике при температуре 0-4 оС. На хроматограмме экстракта пигментов из А. 1оЬисЫет\з, хранившегося 30 дней, первым пиком выходит аллофикоцианин, имеющий сильное поглощение при 672 и 280 нм и слабое
при 563 нм (рис. 6). Следом, практически не разделяясь, выходит пик Я-фикоэритрина, имеющий поглощение при 563 и 280 нм. Затем выходят пики белковых примесей, имеющие поглощение только при 280 нм. Последним выходит пик низкомолекулярных примесей, скорее всего это продукты разложения хромофоров простетических групп Я-фикоэрит-рина и аллофикоцианина.
о 360 400 500 600 700 о
° Длина волны, нм
Рис. 5. Спектры поглощения света свежим экстрактом пигментов из А. 1оЬисШепз1з (1) и хранившимся 30 дней при температуре 0-4 оС (2)
Белковые примеси
Рис. 6. Хроматограмма экстракта пигментов из А. 1оЬисЫет18, хранившегося 30 дней при температуре 0-4 оС
Данные ВЭЖХ еще раз подтвердили, что при хранении пигментов в экстракте в 2 раза уменьшается их содержание и увеличивается содержание примесей.
Таким образом, установлено, что R-фикоэритрин из A. tobuchiensis устойчив при температуре до 60 оС, а аллофикоцианин не разрушается и при температуре 90 оС. Однако в условиях хранения при температуре 0-4 оС в течение 30 дней R-фикоэритрин более устойчив, чем аллофикоцианин.
Литература
1. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей / Г.К. Барашков. - М.: Пищ. пром-сть, 1972. - 335 с.
2. Бобылев Р.В. Технология лекарственных форм: учебник в 2 т. Т. 2 / Р.В. Бобылев, Г.П. Грядунова, Л. А. Иванова [и др.]; под. ред. Л. А. Ивановой. - М.: Медицина, 1991. - 544 с.
3. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов: пер. с англ. / Г. Бриттон. - М.: Мир, 1986. - 442 с.
4. Васильев В.П. Аналитическая химия: в 2 кн. Кн. 2: Физикохимические методы анализа / В.П. Васильев. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Дрофа, 2002. - 384 с.
5. Возжинская В.В. Промысловые водоросли СССР: справочник / В.В. Возжинская, А. С. Цапко, Е.И. Блинова [и др.]. - М.: Пищ. пром-сть, 1971. - 272 с.
6. Жильцова Л.В. Постадийное получение красного красителя и агара из анфельции / Л.В. Жильцова, В. Д. Дзизюров // Изв. ТИНРО. 1997. Т. 120. С. 123-130.
7. Зюлковский З. Жидкостная экстракция в химической промышленности / З. Зюлковский. - Л.: Госхимиздат, 1963. - 480 с.
8. Кизеветтер И.В. Переработка морских водорослей и других промысловых водных растений / И.В. Кизеветтер, В.С. Грюнер, В.А. Евтушенко. - М.: Пищ. пром-сть, 1967. - 416 с.
9. Кизеветтер И.В. Промысловые водоросли и травы дальневосточных морей / И.В. Кизеветтер, М.В. Суховеева, Л.П. Шмелькова. - М.: Легкая и пищ. пром-сть, 1981. - 112 с.
10. Ли Б. Д. Разделение, идентификация и количественное определение фотосинтетических пигментов макробентосных водорослей / Б.Д. Ли // Экологические аспекты фотосинтеза морских макроводорослей / отв. ред. Э.А. Титлянов, В.И. Звалинский. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1978. С. 38-166.
11. Пат. 92016191 РФ, МПК6 А23L1/0532. Способ комплексной переработки красной водоросли анфельции / Жильцова Л.В., Дзизюров В. Д., Жербутович В.В.; опубл. 1995.
12. Пат. 2052962 РФ, МПК6 A23L1/337. Способ комплексной переработки красных водорослей / Жильцова Л.В., Дзизюров В. Д., Жербутович В.В.; опубл. 1996.
13. Рудик В.Ф. Ускоренный метод определения содержания фико-цианинов в синезеленых водорослях / В.Ф. Рудик, В.С. Гудумак. -Кишенев, 1988. - 7 с.
14. Стадничук И. Н. Фикобилипротеиды синезеленых, красных и крип-товых водорослей / И.Н. Стадничук, М.В. Гусев // Биохимия. 1979. Т. 44, № 4. С. 579-593.
15. Суховерхов С.В. Исследование пигментов из красной водоросли Meristotheca papulosa / С.В. Суховерхов, И.А. Кадникова, Н.М. Аминина // Всероссийская конф. молодых ученых: тез. докл. Мурманск: ПИНРО, 2002. С. 192.
16. Суховерхов С. В. Применение высокоэффективной эксклюзионной хроматографии для исследования и контроля технологии получения агара / С.В. Суховерхов // Журн. аналит. химии. 2002. Т. 57, № 8. С. 1-8.
17. Фихте Б. А. Дезинтеграторы клеток / Б. А. Фихте, Г.А. Гуревич. - М.: Наука, 1988. - 224 с.
18. Bogorad L. Phycobiliproteins and complementary chromatic adaptation / L. Bogorad // Ann. Rev. Plant. Physiol. 1975. Vol. 26. P. 114-120.
19. Boussiba S. C-phycocyanin as a storage protein in the blue-green alga Spirulina platensis / S. Boussiba , A.E. Richmond // Areh. Microbiol. 1980. Vol. 125. P. 143-147.
20. Glazer A.N. Phycocyanins: structure and function / A.N. Glazer // Photo-chem. Photobiol. Rev. 1976. Vol. 1. P. 71-115.
21. Holzwarth A.R. Structure-function relationships and energy transfer in phycobiliprotein antennae / A.R. Holzwarth // Physiol. Plant. 1991. Vol. 83. P. 518-528.
22. O'Carra P. Purification and N-terminal analyses of algal biliproteins / P. O'Carra // Biochem. Journ. 1965. Vol. 94. № 1. Р. 171-174.
23. Zilinskas B.A. Phycobilisome structure and function / B.A. Zilinskas, L.S. Greenwald // Photosynth Res. 1986. Vol. 10. P. 7-35.
© Суховерхов С.В., 2005 г.
