CC BY
118
ПРОЦЕССЫ ОЧИСТКИ В ТЕХНОЛОГИИ ПИЩЕВОГО КРАСИТЕЛЯ ФИКОЦИАНИНА ИЗ СИНЕЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
А.А. Ефимов, В.А. Голованец, М.В. Ефимова (КамчатГТУ)
Основной группой веществ, определяющих внешний вид продуктов питания, являются пищевые красители и вещества, способствующие сохранению окраски. Автором разработана технология получения пищевой добавки - натурального красителя фикоцианина из термофильных синезеленых водорослей. Рассмотрены технологические процессы очистки фикоцианина от сопутствующих компонентов.
Food colorants and substances, providing color preservation of food products compose core group, which determine foodstuffs ’ visual appearance. The author has developed the technology of extracting natural colorant - phycocyanin from blue-green thermophilic algae. The article describes technological process of phycocyanin’s separation from coincident components.
Особенности химического состава синезеленых водорослей обусловливают повышение внимания к ним как к сырью для производства пищевых продуктов. У этих водорослей найдено около 30 различных внутриклеточных пигментов [1], которые можно разделить на три группы -хлорофилл, фикобилипротеины и, объединяя каротины и ксантофиллы в одну группу, - кароти-ноиды [3]. Соотношение между пигментами изменяется в зависимости от вида и условий культивирования [2]. Для синезеленых водорослей, в том числе термофильных, характерна синезеленая, оливково-зеленая, желто-зеленая окраска, а также встречается розовая и почти черная, что связано с наличием таких пигментов, как хлорофилл а, фикобилины и каротиноиды [8, 9].
Фикоцианин входит в состав фикобилинов вместе с фикоэритрином и аллофикоцианином и наряду с хлорофиллом а выполняет функции фоторецепторов в фотосинтезе. Фикоцианин - основной пигмент данной группы (синего цвета) - представляет собой комплекс фикоцианобилина с белком. Максимум поглощения для фикоцианина находится между 610 и 665 нм [5, 9].
Фикоцианин используется как пищевой краситель (молочные продукты, шербет, желе, жевательная резинка), как колорант в косметической промышленности (помада, карандаши для глаз) [7, 13].
Описание отработанных технологий получения фикоцианина в открытой печати практически отсутствует, так как это направление технологии достаточно новое и коммерческими предприятиями детальная информация не распространяется. Методы промышленного получения этого вещества основаны на его химической природе, на лабораторных методах исследования и получения, доступных для изучения, с корректированием на промышленные условия.
Классическая процедура выделения и очистки фикоцианина включает в себя комбинацию методов высаливания, ультразвукового измельчения, экстракции, центрифугирования, хроматографического разделения, удаления низкомолекулярных примесей с помощью диализа [4, 5, 10-12].
Однако при общности принципов выделения и очистки фикоцианина из синезеленых водорослей существуют значительные, иногда совершенно противоположные различия в конкретных параметрах, режимах, зависящие от особенностей объекта обработки, методики, состава среды и т. п. Многие авторы, предложив свои рекомендации и методики, подчеркивают неунивер-сальность своих выводов, необходимость проведения комплекса исследований в каждом конкретном случае.
Целью проведенных исследований являлась разработка технологии получения натурального красителя фикоцианина из синезеленых водорослей рода Phormidium, массово развивающихся в горячих источниках Камчатки. Потенциальная продуктивность этих водорослей по сухому веществу составляет 50-55 мг/ч с 1 м2 освещаемой водной поверхности. Содержание фикоцианина составляет 45,2 мг/г сухого вещества.
Разработанная технология включает следующие операции: прием биомассы водорослей, добавление углекислого магния, дезинтеграцию, экстракцию, центрифугирование, предварительную очистку, осаждение фикоцианина, переосаждение фикоцианина, диализ, консервирование, фасование, хранение.
Так как в состав используемых водорослей входит комплекс фотопигментов, существует необходимость их разделения и очистки фикоцианина от сопутствующих веществ. В отличие от методов получения фикоцианина как биологически активного вещества при получении пищевого красителя фикоцианина синего цвета нет необходимости полной очистки продукта от сопутствующих пигментов - достаточно получить готовый продукт, имеющий необходимый цвет. В качестве сырья использовали промытую концентрированную биомассу термофильных синезеленых водорослей рода Phormidium, культивированных в искусственных условиях.
Для более полного выделения целевого вещества из сырья необходимо предварительное разрушение клеточных стенок водорослей. Экстрагирование водорастворимого белка фикоциа-нина происходило и при неразрушенных клеточных стенках - через 4-5 суток экстракт приобретал насыщенный сине-фиолетовый цвет. При получении пигмента в промышленных масштабах такая скорость экстракции недостаточна. Для максимальной скорости экстракции необходимо разрушить клеточные стенки и чехлы трихомов, отделить фикобилипротеиновые «антенные» комплексы от наружной поверхности тилакоидных мембран клеток и перевести их в раствор. При этом нежелательно дальнейшее измельчение, разрушение тилакоидных мембран и хлорофилловых комплексов, агрегированных внутри и на поверхности мембран. При чрезмерном измельчении раствор билипротеинов загрязнялся очень тонкой взвесью органелл, прошедших через тонкие фильтры и практически не отделившихся отстаиванием, а при центрифугировании разделявшихся только при высоких значениях фактора разделения, что серьезно затрудняло процесс дальнейшей обработки.
Влияние степени измельчения на скорость экстракции определяли по нарастанию оптической плотности экстрактов на длине волны 440 нм. Равновесная концентрация водорастворимых пигментов в экстракте быстрее всего (через 0,75 ч) достигалась при экстрагировании образца, измельченного в течение 60 с. Однако из-за наличия в растворе тонкой взвеси на дальнейшем этапе осаждения фикоцианина происходило соосаждение сопутствующих веществ, что отмечалось на спектрограмме. Отделение взвеси требовало центрифугирования при высоких значениях фактора разделения - 6000g, что в промышленных условиях потребует использования сложного и дорогого оборудования. В то же время выигрыш в продолжительности процесса экстракции в
0,25 ч является несущественным. Это дало основание выбрать в качестве рационального режима измельчения продолжительность 45 с.
Для извлечения фикоцианина из измельченной массы применяли экстрагирование. Выбор экстрагента определяется природой фикоцианина как водорастворимого белка. В качестве экстрагента выбрали пресную питьевую воду. Динамику процесса определяли спектрофотометрически по концентрации продуктов экстрагирования - водорастворимых пигментов.
Степень извлечения фикоцианина после двух этапов экстракции составила 96,6%. После экстрагирования в жидкой фазе содержался комплекс водорастворимых фотопигментов (в том числе фикоцианин), в твердой фазе - не растворимые в воде пигменты и незначительное количество остаточного фикоцианина.
Для получения фикоцианина осадок больше не представлял ценности, и в существующих методиках переработки синезеленых водорослей осадок отбрасывают. Экстракт направляли на дальнейшие операции выделения фикоцианина.
Процессы очистки и осаждения белков проводили растворами сульфата аммония. Растворы требуемой концентрации получали добавлением насыщенного раствора сульфата аммония к раствору белка. Разделение твердой и жидкой фаз проводили в центрифуге ОС-6М при значении фактора разделения 5000g в течение 10 мин. При меньших значениях фактора разделения и продолжительности осаждения получили неполное осаждение и неплотный, загрязненный растворенным фикоэритрином осадок.
При осаждении белков происходит соосаждение сопутствующих компонентов вместе с целевым продуктом. При осаждении фикоцианина в 50%-ном растворе сульфата аммония на синем осадке фикоцианина был хорошо заметен слой зеленого цвета, в составе которого при спектральном анализе идентифицировали хлорофилл по пикам в «красной области» - 660-664 нм и «полосе Соре» - 400-450 нм.
В 20-30%-ном растворе сульфата аммония происходило осаждение светло-зеленого осадка. При дальнейшем увеличении концентрации сульфата аммония до 40% выпадали в осадок неокрашенные белки.
Так как зеленый осадок выпадал только в процессе высаливания, можно сделать вывод, что он состоял из комплексов хлорофилла и белков. До высаливания эти комплексы придавали исходному экстракту мутность, проходили через стеклянные и бумажные фильтры. После осаждения комплексов жидкость становилась прозрачной.
Результаты эксперимента показали, что белковые загрязнения выпадают в осадок в 20-40%-ном растворе сульфата аммония, т. е. до начала осаждения фикоцианина. Это дало возможность очистить раствор фикобилипротеинов предварительным осаждением хлорофилло-белковых комплексов в растворе сульфата аммония 40%-ной концентрации. Спектрофотометрический анализ осадка фикоцианина, полученного с использованием предварительной очистки, показал отсутствие загрязнения посторонними белками, отсутствие следов хлорофилла: исчезли пики при значениях длины волны 660-664 нм и 400-450 нм. Исчезли пики, свойственные некоторым нецелевым белкам, спектры которых имели максимум при значении длины волны 480 и 680 нм. После отделения загрязнений значение чистоты фикоцианина по соотношению А620/А280 составляло 1,36.
Для дальнейшей очистки целевого продукта от сопутствующих компонентов применяли его осаждение. После осаждения хлорофилло-белковых комплексов в растворе присутствовал комплекс водорастворимых пигментов - фикоцианина, фикоэритрина и аллофикоцианина, максимумы поглощения которых соответствуют длинам волн 620, 565, 654 нм.
Характерной особенностью пигментного состава данного объекта исследования является наличие фикоэритрина и очень небольшого количества аллофикоцианина.
Высаливание фикоцианина наблюдали в 50%-ном растворе - появлялась сначала тонкая взвесь, которая затем постепенно объединялась в оседающие хлопья синего цвета (рис. 1, б). Над осадком фикоцианина наблюдали проявление раствора фико-эритрина красного цвета (рис. 1, а).
Анализ спектра поглощения раствора (рис. 2), полученого при обратном процессе - растворении выпавшего осадка, показал наличие в нем фикоцианина (620 нм) и остаточного количества фикоэритрина. Значение коэффициента чистоты А620 нм/А565 нм составило 1,25, А620/А280 - 1,94. Загрязнение осадка фикоцианина фикоэритрином происходило в результате соосаждения. В осадке не отмечались следы аллофикоцианина.
Спектр поглощения супернатанта (рис. 3) дал отчетливый пик при длине волны 565 нм, соответствующий фикоэритрину, и слабовыраженный пик при длине волны 654 нм, соответствующий аллофикоцианину. Наличие небольшого пика при 620 нм указывает на то, что в растворе осталось некоторое количество фикоцианина - 8,4% от его исходного количества в биомассе. Попытки извлечь его путем высаливания, разделения в хроматографической колонке к положительному результату не привели. Вероятно, часть фикоцианина находится в составе устойчивого комплекса с фикоэритрином [6].
Как показал приведенный выше эксперимент, в рамках одностадийного разделения белков не удается получить чистый фикоцианин без примеси фикоэритрина. Последний при коэффициенте чистоты А620 нм/А565 нм, равном 1,25, придает заметный фиолетовый оттенок.
а
Рис. 1. Осаждение фикоцианина: а - слой фикоэритрина; б - слой фикоцианина
X, нм
Рис. 2. Спектр поглощения перерастворенного осадка фикоцианина
X, нм
Рис. 3. Спектр поглощения супернатанта после отделения фикоцианина
Для окончательной очистки целевого продукта от сопутствующих компонентов применяли переосаждение. Для этого осадок фикоцианина растворяли в пресной питьевой воде при соотношении 1 : 5 и переосаждали в 50%-ном растворе сульфата аммония. Визуально в процессе осаждения определяли значительно меньшее содержание фикоэритрина, изменение оттенка осадка фикоцианина по сравнению с первичным осаждением.
Спектр поглощения очищенного фикоцианина имел слабовыраженный пик при значении длины волны 565 нм - максимуме поглощения фикоэритрина. Для получения химически чистого препарата для иммунологических, рентгеноструктурных, молекулярно-биологических исследований применяется дальнейшая очистка от фикоэритрина. Однако для наших целей - получения пищевого красителя синего цвета - достигнутая степень очистки достаточна. При коэффициенте чистоты А620 нм/А565 нм, равном 2,09, раствор имел насыщенный синий цвет, полностью приемлемый для пищевого колоранта. Показатель чистоты А620нм/А280нм составил 2,12, что полностью удовлетворяет требованиям к пищевой добавке.
Для очистки полученного фикоцианина от сульфата аммония применяли диализ в низкопоточном диализаторе Fresenius Polysulfone® серии F-Low-Flux, F5 фирмы «Fresenius Medical Care AG» с полисульфоновой мембраной капиллярного типа эффективной поверхностью 1 м2. Для повышения эффективности проведения диализа в капиллярном диализаторе осадок фикоцианина предварительно растворяли в пресной питьевой воде до содержания сухих веществ 2%. Процесс очистки проводили при неподвижном слое очищаемого раствора, при расходе раствора 250 и 500 см3/мин. В качестве диализата применяли пресную питьевую воду. В камере пермеата для поддержания максимально возможной разности концентраций и, соответственно, скорости диализа создавали непрерывное проточное движение воды. Процесс проводили в режиме диализа. Для создания потока диализируемого раствора его отмеренное количество циклически доливали в диализатор.
Процесс перехода сульфата аммония из раствора в пермеат контролировали качественной реакцией с реактивом Несслера с определением оптической плотности пермеата при длине волны 440 нм. Время окончания диализа определяли по отрицательной реакции с реактивом Несс-
лера. Клиренс по сульфату аммония при расходе раствора 0 см3/мин составил 34 см3/мин, при 250 - 164 см3/мин, при 500 - 195 см3/мин. Наиболее эффективным режимом по показателю клиренса являлся расход раствора 500 см3/мин.
Таким образом, в результате серии последовательно проведенных операций выделения и очистки фикоцианина (экстрагирования, осаждения, переосаждения, диализа) получен продукт, представляющий собой водный раствор фикоцианина с рН 7, темно-синего цвета, не содержащий низкомолекулярных неорганических примесей.
Литература
1. ГусевМ.В., Минеева Л.А. Микробиология. - М.: Академия, 2003. - 464 с.
2. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология. - М.: Академия, 2006. - 352 с.
3. Современная микробиология. Прокариоты. Т. 1 / Под ред. Й. Ленгелер, Г. Древс, Г. Шле-
гель. - М.: Мир, 2005. - 654 с.
4. Purification and characterization of phycocyanin from the marine cyanobacterium Synechoccus sp. I09201 / J. Abalde, L. Betancourt, E. Torres et. al. // Plant Science. - 1998. - № 136. - Р. 109-120.
5. Boussiba S., Richmond A.E. Isolation and characterization of phycocyanins from the blue-
green-algae Spirulinaplatensis // Archives of Microbiology. - 1979. - Vol. 120. - P. 155-159.
6. Canaani Ora., Lipschultz C.A., Gantt E. Febs lette // Elsive Press. - 1980. - Vol. 155. - № 2. -
Р. 225-229.
7. Cohen Z. Product from microalgae // Handbook of microalgal mass culture. - CRC Press Inc. Boca Raton, 1986. - Р. 421-454.
8. Studies on C-phycocyanin from Cyanidium caldarium, a eukaryote at the extremes of habitat / L.E. Eisele, S.H. Bakhru, X. Liu et. al. // Biochimica et Biophysica Acta BBA - Bioenergetics, 2000. -P. 99-107.
9. The phycobilisomes of the cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) maxima / C. Gomez-Lojero,
B. Perez-Gomez, G. Prado-Flores et. al. // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. -1997. - Vol. 29. - № 10. - P. 1191-1205.
10. C-phycocyanin from the cyanobacterium Aphanothece halophytica / C.M. Hilditch, A.J. Smith, P. Balding, L.J. Rogers // Phytochem. - 1991. - № 30. - Р. 3515-3517.
11. Simple isolation of phycocyanin from Spirulina platensis and phycocyanobilin-protein interaction / H. Kageyama, A. Ishii, T. Matsuoka et. al. // J. Mar. Biotechnol. - 1994. - № 1. - Р. 185-188.
12. Purification of phycobiliproteins from Nostoc sp. ву aminohexyl-Sepharose chromatography / A.A. Tchernov, K.M. Minkova, N.B. Houbavenska, N.G. Kovacheva // J. Biotechnol. - 1999. -№ 69. - Р. 69-73.
13. Yoshinda A., Takagaki Y., Nishimune I. Enzyme immunoassay for phycocyanin as the main component of Spirulina colour in food biotechnology // Biochem. - 1996. - Vol. 60. - Р. 57-60.
