CC BY
89
№ 2 - 2012 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 616.89-008.441.13:575.174.015.3
СВЯЗЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА ЭТАНОЛА ALDH 2, ADH 1С, ADH4 и CYP2E1 С РИСКОМ РАЗВИТИЯ АЛКОГОЛЬНОЙ ЗАВИСИМОСТИ
В.П. Иванов, Д.В. Кущёв
ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития
России (г. Курск)
Для оценки наследственной компоненты подверженности алкогольной зависимости был проведен молекулярно-генетический анализ в русской популяции шести ДНК-маркеров четырех структурных генов, включавших гены основных ферментов метаболизма этанола: цитохрома Р450 2Е1 — 3 полиморфизма (CYP 2E1 1053 C > T, CYP 2E1 7632 T > A; CYP 2E1 9896 C > G); альдегиддегидрогеназы (ALDH2 357 A > G) и алкогольдегидрогеназы (ADH 1C 272 R > G и ADH 4 rs 1800759 A > C). Обнаружена ассоциация генотипа AG гена ALDH 2 (OR = 3,56; 95 % CI 1,12-11,18; р = 0,004) игенотипаСС гена ADH 4 (OR = 1,88; 95 % CI 1,02-3,46; р = 0,05)с риском развития алкогольной зависимости.
Ключевые слова: алкогольная зависимость, ферменты метаболизма этанола, генетический полиморфизм.
Иванов Владимир Петрович — доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, заведующий кафедрой медицинской биологии, генетики и экологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (4712) 58-81-47, е-mail: main@kgmu.kursknet.ru
Кущёв Дмитрий Владимирович — врач психиатр-нарколог, заочный аспирант кафедры биологии, медицинской генетики и экологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет», e-mail: kuschevdv@mail.ru
Введение. Результаты эпидемиологических исследований показывают, что среди больных с наркологическими расстройствами преобладают больные алкогольной зависимостью (АЗ). По данным ВОЗ, распространенность алкоголизма во всем мире, составляет около 10 % у мужчин и 3-5 % у женщин [2]. В России показатель общей заболеваемости алкоголизмом в 2010 году составил 1407,23 на 100 тыс. общего населения [3]. Широкое распространение АЗ среди населения имеет тяжелые медицинские последствия, оказывает существенное влияние на социальные и демографические процессы, поэтому в настоящее время во всех странах по-прежнему актуальны научные исследований в этой области.
Согласно современным представлениям, АЗ имеет мультифакториальную природу [2]. Мультифакториальность этиопатогенеза АЗ — это сложное взаимодействие генетических, средовых факторов, микро- и макросоциального окружения больного. К настоящему времени установлены многие гены-кандидаты предрасположенности к алкоголизму, установлены многочисленные средовые факторы риска заболевания и описаны ранее неизвестные стороны его патогенеза. Однако, несмотря на прогресс молекулярной генетики, по-прежнему, в мировом научно-медицинском сообществе отсутствует единое мнение о ведущих патогенетических механизмах, лежащих в основе зависимости от алкоголя. Изложенное выше, а также необходимость дальнейшего расширения представлений о генных факторах алкогольной патологии определили актуальность проведения настоящего исследования.
Цель настоящей работы: исследовать вовлеченность полиморфных вариантов генов ферментов метаболизма этанола в формирование предрасположенности к АЗ; изучить взаимодействия между генами ферментов метаболизма этанола и их роль в формировании АЗ.
Материалы и методы исследования. Обследован 121 пациент, страдающий АЗ 1-2 стадии. Формирование экспериментальной выборки проводилось из пациентов, находившихся на стационарном лечении, и больных, состоявших на диспансерном учете, получавших лечение амбулаторно в наркологическом ЛПУ Белгородской области. Диагноз был поставлен в соответствии с Международной классификацией болезней десятого пересмотра (МКБ-10, 1994). Контрольную группу составили 70 условно здоровых человек, не имеющих диагностических признаков наркологической патологии, не состоящих на учете у нарколога. Группы были рандомизированы по полу и по возрасту. Все обследуемые относились к европеоидной расе, постоянно проживали на территории России (Белгородской области) и не были связаны между собой узами родства. В начале работы в соответствии с современными этическими стандартами с каждого пациента было получено добровольное информированное согласие.
Молекулярно-генетические исследования проводились на базе лаборатории кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета (г. Курск). Для проведения молекулярно-генетических исследований у всех обследуемых проводился забор венозной крови. Выделение геномной ДНК осуществляли из замороженной венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольнохлороформной экстракции [5]. Генотипирование полиморфизмов генов ферментов метаболизма этанола (ФМЭ) проводилось методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционного анализа по методикам, опубликованным в литературе. Для оценки наследственной компоненты подверженности АЗ был проведен молекулярногенетический анализ в выбранной популяции шести ДНК-маркеров четырех структурных генов, включавших гены основных ферментов метаболизма этанола: цитохрома Р450 2Е1 — 3 полиморфизма (СУР 2Е1 1053 C > Т, СУР 2Е1 7632 T > А СУР 2Е1 9896 C > G); альдегиддегидрогеназы (ЛЬБИ2 357 А > G) и алкогольдегидрогеназы (ЛБИ 1С 272 R > G и ЛБИ 4 ге 1800759 A > Г).
Соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга, расчет наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, сравнение частот аллелей и генотипов в подгруппах проводили общепринятыми методами популяционной биометрии. Поиск ассоциаций проводили путём сравнения частот аллелей и генотипов в группе больных по сравнению с контрольной. Для сравнения частот аллелей и генотипов между группами использовали критерий х с поправкой Иетса на непрерывность [1]. Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеванию судили по величине отношения шансов (OR) [6]. Был принят 5 % уровень статистической значимости.
Метод MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) использовался с целью моделирования межгенных взаимодействий генов ФМЭ при АЗ [7]. Неравновесие по сцеплению и гаметические корреляции между парами ДНК-маркеров рассчитывались методом максимального правдоподобия исходя из частот генотипов в таблицах сопряженности 3 '
3 при условии кодоминирования между оцениваемыми полиморфизмами отдельного гена.
Результаты и их обсуждение. В контрольной группе уровень наблюдаемой гетерозиготности не превышал теоретически ожидаемых значений и все полиморфизмы генов ФМЭ находились в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга. У больных АЗ обнаружены статистически значимые отклонения частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга (РХВ) по генам CYP2E! 1053 C > T, ALDH2 357 A > G, ADH4 rs1800759 А > С, связанные со снижением фактической гетерозиготности в изучаемой группе.
Для изучения ассоциации полиморфных вариантов генов ферментов метаболизма этанола с развитием АЗ был проведен сравнительный анализ частот аллелей изучаемых полиморфных генов ферментов метаболизма этанола между контрольной группой и группой больных АЗ. АЗ ассоциировалась с аллельными вариантами двух полиморфных генов ферментов метаболизма этанола: ALDH2 A357G иADH4 rs1800759 A/С. Во всех случаях частоты вариантных аллелей генов в группе больных АЗ были выше частот в контрольной группе: для рецессивного аллеля G гена для гена ALDH 2 — OR = 3,42; 95 % CI 1,55-7,22; р = 0,001; для рецессивного аллеля С гена ADH 4 — OR=3,65; 95 % CI 1,51-9,23; р = 0,002. Статистически значимых различий в частотах аллелей других полиморфных генов ферментов метаболизма этанола между контрольной группой и больными АЗ не установлено.
В связи с тем, что анализ частот аллелей генов ферментов метаболизма этанола не даёт полного представления о характере взаимосвязи полиморфизмов
с предрасположенностью к АЗ, представлялось важным оценить влияние генотипов ферментов метаболизма этанола на формирование заболевания.
В группе больных с АЗ установлены достоверные увеличения частоты гетерозигот 357 A/G гена ALDH2 (OR = 3,56; 95 % CI 1,12-11,18) и рецессивных гомозигот СС гена ADH 4 (OR = 1,88; 95% CI 1,02-3,46), что указывало на их ассоциацию с повышенным риском развития АЗ. Также статистически значимые различия в изучаемых выборках наблюдались по дикому генотипу 357AA гена ALDH 2 (OR = 0,26; 95 % CI 0,10-0,67) и доминантным гомозиготам rs1800759AA гена ADH 4 (OR = 0,34; 95 % CI 0,13-0,87) в сторону увеличения их частот в контрольной группе, что свидетельствовало об их ассоциации с пониженным риском развития заболевания. Статистически значимых различий в частотах генотипов других полиморфных вариантов генов ФМЭ между группой здоровых индивидов и группой больных АЗ не установлено.
Таким образом, аллели и генотипы полиморфизмов генов ALDH2 A357G и ADH
4 rs1800759 A/C ассоциировались с риском развития АЗ.
Важной задачей исследований мультифакториальных заболеваний является анализ неравновесия по сцеплению и гаметических корреляций (неслучайное сочетание аллелей разных локусов в гаметах) между генетическими маркерами. Гаплотипический анализ позволяет выявить унаследованные определенные аллельные комбинации, свидетельствующие о селективном преимуществе данных аллельных вариантов генов, поддерживаемых естественным отбором и связанных с функциональной сопряженностью генетических продуктов данных генов, контролирующих общие метаболические процессы в клетках [4].
Первоначально нами был проведен анализ ассоциаций парных сочетаний генотипов ФМЭ между группами больных АЗ и здоровых. Анализ показал, что различий в частотах гаплотипов у больных АЗ в сравнении с контрольной группой не наблюдалось (р > 0,05). В обеих группах наиболее частыми гаплотипами гена CYP2E1 были следующие:1053С/7632Т (79-87 %), 1053C/9896C (86-89 %) и 7632T/9896C (86-89 %).
Следующим этапом работы была оценка величин неравновесия по сцеплению (LD) между полиморфными вариантами гена CYP2E1 в группе контроля и больных АЗ. Рассчитанные нестандартизированные коэффициенты гаметического неравновесия по сцеплению (D) между полиморфизмами C1053T и T7632A гена CYP2E1 были следующими: D = — 0,000583 (р > 0,05) в группе больных АЗ и D = +0,010521 (р > 0,05) в группе здоровых индивидуумов. Для пары полиморфизмов C1053T/C9896G гена CYP2E1 эти показатели составили: D = —0,001228 (р > 0,05) в группе больных АЗ и D = +0,000863 (р > 0,05) в группе контроля. Наконец, для пары полиморфизмов T7632A/C9896G гена CYP2E1 коэффициенты неравновесия по сцеплению были равны: D = —0,004649 (р > 0,05) в группе больных АЗ и D = +0,002247 (р > 0,05) в группе контроля.
Затем мы проанализировали парные коэффициенты гаметических корреляций (rg), рассчитанные для индивидуальных полиморфизмов исследуемых генов в изучаемых выборках. В контрольной группе статистически значимых гаметических корреляции выявлено не было. В группе больных АЗ были установлены статистически значимые (р <
0,05) гаметические корреляции между аллельными вариантами генов ALDH2 иADH1C(rg = +0,222); ADH1^ ADH4 (rg = +0,201) а также ALDH2 ИADH4 (rg = +0,206).
Для оценки межгенных взаимодействий с помощью метода MDR использовался алгоритм всестороннего поиска (Exhaustive search algorithm), который оценивал все возможные комбинации полиморфизмов в отношении риска развития АЗ. В тех случаях, когда этот алгоритм не позволял выявить статистически значимую модель взаимодействия локусов, мы использовали алгоритм Forced, на основании которого для создания n-локусных комбинаций маркеров вручную выбирались генные локусы, которые на предыдущих этапах анализа показали вовлеченность в развитие болезней. При анализе выборки больных АЗ установлена одна статистически наиболее значимая трехлокусная модель (воспроизводимость — 100 %, точность предсказания — 63,7 %), включающая
взаимодействия генов CYP2E1 C9896G х ALDH2 х ADH4 (р = 0,047). Причем, взаимодействие полиморфных генов ALDH2 и ADH4 характеризовалось выраженным антагонизмом, в свою очередь взаимодействие каждого из этих полиморфных генов с полиморфизмом CYP2E1 C9896G можно охарактеризовать как аддитивное.
Заключение. Таким образом, в настоящей работе установлены маркеры повышенного риска развития АЗ, которые составляли аллельные варианты двух полиморфных генов ферментов метаболизма этанола: ALDH2 A357G и ADH 4 rs1800759 A/C. Полученные данные могут рассматриваться как предикторы АЗ, что открывает перспективы для научно обоснованного подхода к раннему выявлению, лечению и профилактике этого заболевания.
Список литературы
1. Реброва, О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О. Ю. Реброва. — М. : МедиаСфера, 2006. — 312 с.
2. Наркология. Национальное руководство / Под ред. Н. Н. Иванца, И. П. Анохиной, М. А. Винниковой. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008. — 720 с.
3. Основные показатели деятельности наркологической службы в 2010 году. / В. В. Киржанова [и др.]. — М., 2011. — 139 с.
4. Фогель Ф. Генетика человека / Ф. Фогель, А. Мотульски. — М. : Мир, 1990. — Т. 3. — 366 с.
5. Marmur J. A procedure for the isolation of DNA from microorganisms / J. Marmur // J. Mol. Biol. — 1961. — Vol. 3, N 2. — P. 208-218.
6. Pearce N. What does the odds ratio estimate in a case-control study? / N. Pearce // Int. J. Epidemiol. — 1993. — Vol. 22, N 6. — P. 1189-1192.
7. Ritchie M. D. Multifactor dimensionality reduction for detecting gene-gene and gene-environment interactions in pharmacogenomics studies / M. D. Ritchie, A. A. Motsinger // Pharmacogenomics. — 2005. — Vol. 6, N 8. — P. 823-834.
CONNECTION OF GENIC POLYMORPHISM OF ENZYMES OF ALDH 2, ADH 1С, ADH4, CYP2E1 ETHANOL METABOLISM WITH THE RISK OF ALCOHOL ADDICTION DEVELOPMENT
V.P. Ivanov, D.V. Kushchev
SEIHPE «Kursk State Medical University Minhealthsocdevelopment» (Kursk c.)
For an estimation of heriditary ingredient of alcohol addiction susceptibility the molecular and genetic analysis in Russian population of six DNA markers of four structural genes including genes of the main enzymes of ethanol metabolism was performed: P450 cytochrome 2Е1 — 3 polymorphisms (CYP 2E1 1053 C > T, CYP of 2E1 7632 T > A; CYP 2E1 9896 C> G); aldehydedehydrogenase (ALDH2 357 A > G) and alcoholdehydrogenase (ADH of 1C 272 R > G and ADH 4 rs 1800759 A > C). The association of AG genotype of ALDH 2 gene (OR = 3,56; 95 % CI 1,12-11,18; p = 0,004) and CC genotype of ADH 4 gene (OR = 1,88; 95 % CI 1,023,46; p = 0,05) with risk of alcohol addiction development was discovered.
Keywords: alcohol addiction, enzymes of ethanol metabolism, genetic polymorphism.
About authors:
Ivanov Vladimir Petrovitch — doctor of medical sciences, professor, honored science worker of the Russian Federation, academician of the Russian Academy of Natural Sciences, head of medical biology, genetics and bionomics chair at SEI HPE «Kursk State Medical University Minhealthsocdevelopment», office number: 8 (4712) 58-81-47, e-mail: main@kgmu.kursknet.ru
Kushchyov Dmitry Vladimirovich — addiction psychiatrist, correspondence PG student of medical biology, genetics and bionomics chair at SEI HPE «Kursk State Medical University Minhealthsocdevelopment», e-mail: kuschevdv@mail.ru
List of the Literature:
1. Rebrova O. Y. Statistical analysis of medical data. Application of STATISTICA applied programs / O. Y. Rebrova. — M: Media sphere, 2006. — 312 P.
2. Addictology. The national management / Under ed. of N. N. Ivants, I. P. Anokhina, M.A.Vinnikova. — M: GEOTAR-media, 2008. — 720 P. c.
3. The main indicators of narcological service activity in 2010. / V. V. Kirzhanova [etc.]. — M, 2011. — 139 P.
4. Fogel F. Human genetics / F. Fogel, A.Motulski. — M: World, 1990. — V. 3. — 366 P.
5. Marmur J. A procedure for the isolation of DNA from microorganisms / J. Marmur // J. Mol. Biol. — 1961. — Vol. 3, N 2. — P. 208-218.
6. Pearce N. What does the odds ratio estimate in a case-control study? / N. Pearce // Int. J. Epidemiol. — 1993. — Vol. 22, N 6. — P. 1189-1192.
7. Ritchie M. D. Multifactor dimensionality reduction for detecting gene-gene and gene-environment interactions in pharmacogenomics studies / M. D. Ritchie, A. A. Motsinger // Pharmacogenomics. — 2005. — Vol. 6, N 8. — P. 823-834.
