CC BY
22
Кср - середнш коефщент спiввiдношень в оплат працi на шдприемствi (се-редньоарифметичне значення К для вЫх пращвниюв); Кр ср. - середнiй коефь щент результативностi управл^сь^' працi (середньоарифметичне значення Кр по всiм працiвникам).
У зазначенш формулi iснуе пряма залежшсть оплати працi не тiльки вщ трудового внеску, але й вщ результатiв роботи всього колективу шдприемства, що забезпечуе поеднання iнтересiв виробництва та кожного пращвника.
В умовах ринково! економiки та вшьно! конкуренци за рiвних iнших вихiдних чинниюв бiльшого прибутку досягнуть пiдприемства, як забезпе-чать нарощування обсягiв та зниження витрат виробництва, найвищий рiвень ефективностi впровадження нових, нетрадицiйних, специфiчних трудових вiдносин. Характер трудових вщносин визначаеться, передусiм, вiдносинами власностi на засоби виробництва, його результатами та ступенем гумашзаци тощо. Незважаючи на юридично закрiплене право селянина бути господарем землi i власностi, вш у бiльшостi аграрних пiдприемств фактично ним не став - насамперед, через вщсутшсть мотиваци працi, непогодженосп розмь рiв його заробiтноi плати з кшцевими результатами, тобто з кшьюстю i яюс-тю вироблено! продукци. Ось чому, з метою удосконалення системи оплати працi в насшнищш необхiдно жорстко пов'язати фонд оплати пращ з обсяга-ми реалiзованоi продукци i виручкою, яка надходить вiд 11 продажу, зокрема через встановлення акордно1 розцiнки за 100 грн. вартост валово1 насшнево1 продукци, яку запропоновано визначити з урахуванням якосп (кондицшнос-тi) i за умов збiльшення тарифного фонду за продукцiю на 50 %.
Лiтература
1. В1тв1тцький В., Павленко В. Аспекти мотиваци пращ сшьськогосподарських вироб-ниюв в умовах економiчноi реформи// Украша: аспекти пращ. - 2002, № 5. - С. 42.
2. Калина А.В. Организация и оплата труда в условиях рынка (аспект эффективности): Учеб. пособие. - 3-е изд., перераб. и доп. - К.: МАУП, 2001. - 312 с.
3. Куликов Г. Пщвищення реальноi заробiтноi плати як провщний фактор мотиваци пращ в перехщнш економщ Украши// Украша: аспекти пращ. - 2002, № 6. - С. 12.
4. Лук'янченко Н.Д. Система управлшня працею в промисловосп: Автореф. дис. ... канд. екон. наук. - Одеса, 1997. - 16 с._
УДК 577.112 Мол. наук ствроб. В.А. Ковальова;
доц. Р. Т. Гут, канд. бюл. наук - НЛТУ Украши, м. Rbeie
СТВОРЕННЯ ТА АНАЛ1З БШЛЮТЕКИ ГЕН1В СОСНИ ЗВИЧАЙНО1
Бiблiотека кДНК, що була сконструйована з корешв проростюв сосни зви-чайно'1, характеризуеться високим титром первинних фагiв (1,2* 106 на мл), низьким piBHeM нерекомбiнантних клошв (1 %) та середнiм розмiром вставки - 1320 п.н. Роз-глянуто перспективи використання ^ei бiблiотeки.
Ключов1 слова: кДНК бiблiотeка; сосна звичайна; EST
Jun. research officer V.A. Kovalyova; assist. prof. R.T. Gout - NUFWT of Ukraine, L'viv Construction and analysis of the Scots pine cDNA library
The expressed cDNA library was constructed in our laboratory, using the mRNA from the seven-day seedlings roots as a starting material. This library is characterized by very high quality: the low level of non-recombinant clones (1 %), the high level of primary
Науковий тсиик, 2007, вип. 17.3
phages (2*106 in ml) and average length of insert - 1320 bp. Perspectives of the using of this library are discussed.
Keywords: cDNA library; Scots pine; EST
Визначш досягнення молекулярно! бюлогп в конструюванш рекомбь нантних молекул ДНК, !х амплiфiкащl та клонуваннi вiдкрили можливiсть щентифшаци та секвенування повних нуклеотидних послiдовностей генiв. Таке завдання виршуеться шляхом створення колекци рекомбiнантних молекул ДНК, як становлять повний геном даного оргашзму, - бiблiотеку генiв. Залежно вщ походження ДНК розрiзняють геномнi та кДНКовi (англ. complementary DNA, cDNA) бiблiотеки генiв. Для конструювання геномних бiблi-отек використовують ДНК, що видiлена з тканин, культур кштин, i3 окремих хромосом або i3 !х фрагментiв. кДНКовi бiблiотеки створюють 3i сумарно! мРНК, яка отримана i3 тканин або з культур кштин, в яких завщомо експре-суються гени, що щкавлять дослiдника [1].
Нещодавно i3 проростюв сосни звичайно! очищено бiлок з антифун-гальною активнiстю, подiбний до рослинних дефензишв [2]. Зважаючи на те, що штенсивний BLAST пошук серед нуклеотидних послщовностей, депоно-ваних у GenBank, кДНК дефензину Pinus sylvestris не виявив, на базi нашо! лаборатори створено експресуючу кДНКову бiблiотеку, стартовим матерь алом для не! слугувала мРНК iз корешв семиденних проросткiв. Ця бiблiоте-ка буде використана не тшьки для встановлення нуклеотидно! послiдовностi дефензина сосни звичайно!, але й для пошуку та секвенування iнших генiв цього рослинного оргашзму.
Матерiали i методи. У дослщах використовували вiдсортоване жит-тездатне насiння Pinus sylvestris L., отримане з Буського держлiсгоспу Львiвсь-ко! областi. Насiння сосни пророщували в термостатi за температури 26 °С у чашках Петрi на фшьтрувальному паперi, змоченому дистильованою водою. Кореш зi семиденних проросткiв видаляли, заморожували у рiдкому азотi та збер^али до використання.
Видiлення препара^в сумарноУ та матричноУ РНК. Сумарну РНК видшяли iз свiжозаморожених у рщкому азотi коренiв семиденних проростюв сосни модифжованим методом лтево-хлоридно! прециштаци [3]. Проростки (1 г) розтирали у ступцi в рiдкому азот до порошкоподiбного стану. Зразок змшували з 5 мл нагрiтого до 65 °С екстракцiйного буферу, що мютив - 2 % CTAB (гексадецилтриметиламошю бромiд, Sigma M-7635), 2 % полiвiшлm-ролiдон к30, 100 мМ трис-HCl, pH 8.0, 25 мМ EДTA, 2.0 M NaCl, 0,05 % спермiдин, 2 % в-меркаптоетанол. До суспензи додавали рiвний об'ем сумiшi хлороформ: iзоамiловий спирт (24:1), перемшували, фази роздiляли центри-фугуванням при 10 000 g, 10 хв. за юмнатно! температури. До супернатанту додавали % об'ему 10 М хлориду лтю, РНК прециттували протягом ночi за 4 °С i осаджували центрифугуванням (10 000 g, 15 хв., 4 °С). Осад розчиняли в 100 мкл буфера, що мiстив 1 М NaCl, 0.5 % ДДШ, 10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 10 мМ EДTA, додавали рiвний об'ем хлороформ: iзоамiловий спирт (24:1), перемiшували, центрифугували (10 000 g, 5 хв.), вiдбирали верхню фазу, добавляли 2 об'еми 96 % етанолу i осаджували РНК протягом ночi за температури -70 °С. Осад РНК шсля центрифугування (14 000 g, 15 хв., 4 °С) розчи-
няли в автоклавованш деiонiзованiй водi, обробленiй 0,1 % диетилшрокарбо-натом. Якiсть препара^в РНК оцiнювали спектрофоретично та електрофоре-зом в 1 % агарозному гель
Полi (А)+РНК очищали афшною хроматографiею на оligo (dT)25 носи Dynabeads ("Dynal", Велика Британiя). Для цього до розчину сумарно! РНК (100 мкл) в 1,5 мл пробiрцi (Eppendorf®) добавляли рiвний об'ем зв'зувально-го буферу (20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 2 мМ ЕДТА, 1,0 M LiCl), прорвали за температури 65 °С протягом 2 хв., помщали на лщ, а потiм змiшували 5 хв. з суспензiею сорбента оligo (dT)25, зрiвноваженого зв'язувальним буфером. Пробiрку помщали в магштний концентратор (Dynal MPC®) i через 30 сек. видаляли супернатант. Сорбент двiчi промивали буфером, що мютив 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 1 мМ ЕДТА, 0,15 М LiCl, мРНК елюювали в 20 мкл 10 мМ трис-HCl, pH 7,5 при на^ванш до 90 °С протягом 2 хв.
Створення бiблiотеки кДНК з корешв семиденних проросткiв сосни звичайно!. Для синтезу першого ланцюга кДНК брали 5 мкг препарату мРНК i набiр для синтезу кДНК ("Stratagenе", США). Для конструювання бiблiоте-ки використовували фрагменти кДНК розмiром вiд 0,5 до 4,0 тис. п. н., якi екстрагували з 1 % агарозного гелю за допомогою набору для екстракци ДНК з гелю ("Qiagen", США). кДНК клонували в ДНК ZAP Express векторa за сайтами рестрикци EcoR1 та Xho1. Рекомбiнантну ДНК пакували в фаговi частинки за допомогою набору Gigapack III Gold зпдно рекомендацiй вироб-ника ("Stratagenе", США).
Титр первинно! бiблiотеки визначали шляхом шфжування клiтин Escherichia coli штаму XL-1 Blue MRF рекомбiнантними фагами у рiзних розведеннях. Нерекомбiнантнi фаги виявляли за експреЫею ß-галактозидази у присутност iзопропiл-ß-D-тiогалактопiранозида (IPTG, 0,25мкг/мл) та 5-Br-4-Cl-3-iндолiл-ß-D-галактопiранозида (X-Gal, 0,5мкг/мл).
Аналiз бiблiотеки кДНК. Cереднi розмiри вставок кДНК визначали рестрикцшним аналiзом та електрофорезом в 1,5 % агарозному гель Для цього проводили in vivo excision фагемщи рВК^МУ iз ZAP Express векторa за допомогою хелперного фага ExAssist зпдно шструкци Stratagenе. Отрима-ним вектором шфжували клiтини Escherichia coli штаму XLORL, якi висiвали на LB-агар з канамщином (50мкг/мл). З окремих колонш видiляли плазмiдну ДНК, яку розщеплювали ендонуклеазами EcoR1 та Xho1.
Секвенування рекомбшантних кДНК здiйснювали за допомогою поль меразно! ланцюгово! реакци i автоматичного секвенатора АВ1 373.
Банки даних EMBO та GenBank використовували для аналiзу отрима-них нуклеотидних послщовностей.
Результати та обговорення. Для конструювання експресуючо! кДНКо-во! бiблiотеки використовували апiкальну частину коренiв семиденних проростюв сосни звичайно! довжиною 1 см. Сумарну РНК видшяли модифжова-ним методом лтево-хлоридно! прециштаци. Тканини сосни характеризуются високим вмютом полiфенолiв та полiсахаридiв, i це створюе труднощi при видшенш РНК гуанiдин-iзотiоцианатним та гуанiдин-гiдрохлоридним методами, а саме: низька яюсть препаратв РНК (домiшки бiлка та ДНК) i вихiд
Наукрвий вкник, 2007, вип. 17.3
менший за 20 мг з грама тканини. Застосований метод дае змогу виршити проб-леми чистоти препарату та шдвищити його вихiд за рахунок використання в екстракцшному буферi полiвiнiлпiролiдону, спермiдину та високо!" концентрацп хлориду натрiю. Так, вихiд сумарно!" РНК з одного грама корешв становив 100 мг. Сшввщношення Е260/Е280 для одержаного препарату (=1,9) свдаить про його високу чистоту, що також було показано електрофоретичним аналiзом (рис. 1). На електрофореграмi чггко вiзуалiзуються смуги 18S та 28S рибосо-мально1 РНК та добре виражений шлейф мРНК, що дае змогу використовувати цей препарат для видшення матрично!" РНК. Кiлькiсть мРНК, яка була отримана шляхом афшно1 хроматографiï на оligo (dT)25 - приблизно 1,2 % сумарно!' РНК. На основi цiеï мРНК шляхом зворотноï транскрипцiï синтезували кДНК.
Отримаш молекули кДНК лiгували в експресуючий вектор фага yZap по сайтах рестрикцп Xho1 та EcoR1 та пакувували у фаговi частинки in vitro, оскшьки саме фагове шфжування е найбiльш ефективним методом введення фаговоï ДНК у бактерiальнi клггини. У результатi було створено експресу-ючу бiблiотеку з титром первинних фапв 1,2х106. Iнформацiйна емнiсть 6ï6-лiотеки, а саме кiлькiсть клошв з рiзними iнсертованими фрагментами ДНК, визначаеться розмiрами вихiдного геному та необхщшстю присутностi кож-но1' його послщовност хоча б в одному клош. Тому достатньо репрезентативною для евкарютичних органiзмiв е бiблiотека, що мiстить не менше шж 8х105...106 клонiв [4]. Отримана кДНКова бiблiотека з коренiв сосни звичай-но1' вiдповiдае цiй умовь
28S 18S
Ш
Рис. 1. Елeктpoфopeгpама сумаpнoïРНК, яка видена з ^peme пpopoсткiв сoснu
Кшьюсть нерекомбшантних фапв визначалася фенотипiчно за характерною морфолопею бляшок. При вставщ екзогенно! ДНК в полшнкерну дь лянку, що розмiщена в геш ß-галактозидази векторного фага Zapy, вщбу-ваеться iнактивацiя цього фермента. Це легко визначаеться у прямому тест титрування фапв на бактерiальному газош E. coli за присутност IPTG (шдук-тор lacZ) та X-gal (субстрат lacZ) [5]. При гiдролiзi X-gal ß-галактозидазою утворюеться яскраво-синш 5-бром-4-хлорiндиго, i тому бляшки векторного фага будуть синього кольору, а рекомбшантш фаги будуть формувати прозо-рi бляшки (рис. 2). Створена нами бiблiотека мiстила приблизно 1 % нерекомбшантних фапв, що е свщченням ii хорошо! якостi i iнформативностi.
Для того, щоб переконатись, що фаги, якi становлять бiблiотеку, дiйсно мають вставки, з 20 випадково вибраних фапв з бiблiотеки сосни зви-чайно! шсля проведення in vivo excision видшили плазмiдну ДНК та провели И рестрикцiю ендонуклеазами EcoRl та Xhol (рис. 3). ДНК, що була отримана iз 20 фаголiзатiв, мiстила фрагменти-вставки середньою довжиною 1320 пар нуклеотидiв. Рестрикцiйний аналiз шдтвердив високу якiсть сконстру-йовано! кДНК бiблiотеки та можливiсть використання ii для вивчення структу-ри та експресп генiв сосни звичайно! в процес проростання насiння.
— Рис. 2. Прямий тест титрування фагiв на газот E. coli штаму MRF' за nрисутностi X-gal. Стртками вказаш бляшки (темш) нерекомбтантних фагiв
Рис. 3. Рестрикцшний аналiз клонованих фрагментiв кДНКз бiблiотеки кДНК сосни звичай ной 1 мкг плазмiди розщеплювали рестриктазами EcoR1 та Xho1, фрагменти роздтяли в 1,5% агарозному гелi, який зафарбовували бромистим етидieм: М- маркери, 1-10 - випадково вибраш клони
Для глобального комп'ютерного аналiзу структури транскриш!в, ре-конструкци структури гешв та визначення рiвня !х експреси застосовуеться метод EST (Expressed Sequence Tags). EST -це коротк нуклеотидш Ыквенси кДНК (звичайно 300-500 bp), що прочитат за один раз (single-pass reads). Вони е "вщбитком" з продуклв гена, що експресуються у певнш тканиш або на певнш стади розвитку. Усшшно розвиваються EST-проекти для багатьох ор-ганiзмiв, лiдируючим видом е Homo sapiens - бшьш нiж 7 мшьйошв EST, за ним щуть види з великим бiомедичним значенням та важливi сшьськогоспо-дарськi культури. Щодо основних лiсотвiрних деревних порщ, i зокрема хвойних, то на цей час реалiзуються EST проекти для Picea glauca, Picea sitchensis, Pinus radiata, Pinus taeda. Так для P. taeda у спещальному шдроздш GenBank - dbEST налiчуеться 329469 EST, а для P. sylvestris - 27 EST, серед яких 25 були депоноваш нашою лабораторiею тд номерами EG418144-51 та EL342377-93.
Таким чином, сконструйована нами бiблiотека кДНК з коренiв семи-денних проросткiв сосни звичайно! характеризуеться високою яюстю та реп-резентатившстю i могла б стати основою EST-проекту для Pinus sylvestris за умови вщповщного фiнансування.
Лiтература
1. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. - Новосибирск: Изд-во НГУ. - 1994. - 304 с.
2. Ковальова В.А., Гут Р.Т. Характеристика дефензинопод1бних бшюв сосни звичайно!// Бюполимери i кл1тина. - 2006, т. 22, № 2. - С. 126-131.
3. Chang S., Puryear J., Cairney J. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees// Plant Mol Biol Rep. - 1993. - V.11. - P. 113-116.
4. Клонирование ДНК. Методы/ Под ред. Д. Гловера. - М.: Мир. - 1988. - 539 с.
5. Ausubel F., Brent R., et. all. Current protocols in molecular biology// Brooklyn. - New-York: Greene Publ. Associates Inc. - 1993. - 724 p.
