CC BY
12
wing difference of content of physiologically active substances in different parts of the seed has been discovered. Low activity of the stimulators of growth and relatively high activity of the inhibitors of growth in the seeds was studied.
Keywords: Magnolia, seed, sarkotesta, sklerotesta, embryo, endosperm, stimulators, inhibitors, biotesting. _
УДК 630*232.3 Acnip. Ю.М. Юсипович; ст. наук. ствроб. В.А. Ковальова, канд. бюл. наук; проф. Р. Т. Гут, д-р бюл. наук - НЛТУ Украти, м. Rbeie
ОРГАНОСПЕЦИФ1ЧНА ЕКСПРЕС1Я ДЕФЕНЗИНУ 1 (PSDEF1)
У PINUS SYLVESTRIS L.
Наведено даш про експреаю дефензину PsDefl у вегетативних i генеративних органах 15^чно'1 сосни звичайно!, а також у насшш та рiзних частинах проростюв (коршщ, гiпокотилi i ам'ядол^. Виявлено продукти транскрипцп PsDefl у пилку та макростробшах поточного року, зршому насшш, хво!, коршш та корi сосни. Отрима-ш результати свiдчать про конститутивну експресш цього бiлка в бшьшосп органiв сосни, що е пiдтвердженням його захисно! ролi на вах етапах онтогенетичного роз-витку сосни звичайно!.
Ключовi слова: дефензин 1, органоспецифiчна експреая, сосна звичайна.
Вступ. У систем! рослинного свггу юнуе чимало мехашзм1в 1мунного захисту рослинних оргашзм1в проти патогенного впливу. Провщна роль в цьому процес належить антимжробним бшкам (PR). Дефензини рослин е представниками ще! групи бюлопчно активних сполук за назвою PR-12. Дефензини присутш в насшш, вегетативних та генеративних органах покритона-сшних рослин. Рослинним дефензинам властивий широкий спектр бюлопчно! активност - антифунгальна, антибактер1альна, шпбування проте!наз та а-амь лаз, блокування юнних канал1в плазматично! мембрани патогена [15]. Експре-Ыя рослинних дефензишв може вщбуватися конститутивно або шдуковано шд впливом грибюв, гормошв, холоду, посухи, поранення та юнного наванта-ження [2, 10]. Рашше ми виявили дефензин 1 (PsDef1) у сосни звичайно! - по-лшептид з молекулярною масою 5,6 кДа, який належить до морфогенно! групи дефензишв i проявляе антигрибкову актившсть проти Fusarium solani, F. oxysporum, Heterobasidion annosum, Botritis cinerea та Pythium dimorphum [3, 4, 9]. Молекулярне клонування та розроблення методики отримання рекомбь нантного й ендогенного PsDef1 були здшснеш у лаборатори молекулярно-ге-нетичних маркер1в рослин кафедри лшвництва НЛТУ Укра!ни (Acc. No. EF455616). Первинна структура молекули PsDef1 збершае консервативш пос-лщовносп, характерш для рослинних дефензишв. кДНК PsDef1 кодуе бшок, який складаеться з 83 амшокислотних залишюв (а.з.), з них - 50 а.з. утворю-ють основний домен дефензину, а 33 а.з. - № -кшцевий сигнальний пептид, який внаслщок процесингу вщокремлюеться вщ структурного бшка [2, 10]. У голонасшних конститутивна експреЫя характерна для дефензину PgD1 Ыян-щв ялини блакитно! - Picea glauca, SPI1 i SPI1B у Picea abies - ялини евро-пейсько! та для дефензину GbD1 Ginkgo biloba [1, 7, 12]. Вивчення експреси дефензишв необхщне для розумшня мехашзм1в природного захисту деревних рослин проти патогенного впливу, зокрема для шдвищення продуктивност та збереженост с1янщв хвойних. Метою цього дослщження було визначення
експресн PsDefl за нормальних умов у насшт, проростках, вегетативних i ге-неративних органах сосни звичайно! на piBHi мРНК.
Матерiали i методи. У дослщах використано насiння Pinus sylvestris L., надане Львiвською зональною люонасшневою станщею. Хвою, корiння, бруньки, кору, а також макростробши, мiкростробiли та пилок вщбрано з 15-рiчноl сосни Дендроботанiчного саду НЛТУ Украши. Використано корiнцi, гiпокотилi i сiм,ядолi восьмиденних проросткiв сосни звичайно!, вирощених за температури 25 °C в чашках Петрi на фiльтрувальному папер^ змоченому дистильованою водою.
мРНК видшяли за модифiкованим методом Chang et. al. [6]. На основi сумарно! РНК отримували кДНК шляхом полiмеразноl ланцюгово! реакцн з попередньою зворотною транскрипщею (ЗТ-ПЛР). Реакцiйна сумiш приготовлена на обробленш диетилпiрокарбонатом (ДЕПК) мiлiq H2O, мiстила 2 мкл загально! РНК; 0,5 мМ нуклеотидiв (dNTPs), 5 мкМ праймерiв ол^о- d (Т)15, яку нагрiвали на водянш банi 5 хв за 65 °C з наступним додаванням буферу для зворотно! транскрипци та 1,5 од/мкл зворотно! транскриптази Re-vertAidTM Premium (Fermentas). Сумш iнкубували 30 хв за 50 °C. Реакцiю за-вершували на^ванням на водянiй банi до 85 °C протягом 5 хв.
Отриману кДНК амплiфiкували за допомогою ампшфкатора "Proteus Helena Biosciences". Для ПЛР-анатзу пiдiбрано праймери, специфiчнi для гена PsDefl з такою посшдовшстю: прямий - 5'-GGGATGATGCAGGTTCAAGT-3' i зворотний - 5'-ACATTTTCTGCCAGCCACAT-3', що утворювали продукт довжи-ною 159 п.н. Як контроль транскрипци слугував ген 60 s рибосомального бiлка L 44 (Acc. No. EL 342388.1). Амптфшацш кДНК L 44 проводили за допомогою таких праймерiв: прямий - 5'-CAAAGCTTGCAAAAAGCACA-3' та зворотний - 5'-TTCCCTTCCCCTTCTTGTCT-3', розмiр продукту становив 263 п.н. Загальна су-мш для ПЛР об'емом 25 мкл, приготовлена на м^^ H2O, мютила однократний МТЕ буфер; 2,5 мМ MgCl2; 0,2 мМ dNTPs (Fermentas); 0,8 рМ/мкл кожного праймера, 1мкл кДНК та 1 од/мкл AmiPol Hot Start ДНК-полiмерази (Molecular Tools). Параметри проведення ПЛР: 95 °C - 5 хв; 95 °C - 1 хв; 51,4 °C - 1 хв; 72°C -1 хв (30 циктв); 72 °C - 10 хв. Продукти ПЛР роздшяли в 2 % агарозному гелi у 0,5 % трис-боратному буферi, забарвлювали бромистим етцщем (0,5 мкг/мл), вiзу-атзували за допомогою УФ-трансiлюмiнатора та фотографували.
Результати та обговорення. Для дослщження експресн гена PsDef1 на рiвнi мРНК необхiдно було визначити специфiчнi праймери до ко-дуючо! послщовност (Acc. No. EF455616) iз 252 нуклеотидiв (рис. 1.). EF455616 PsDefl
ATGGCGGGCAAGGGAGTTGGCAGTCGACTCAGCACTCTTTTTCTGCTCG TGCTGCTTGTTATAACCATT GGGATGATGCAGGTTCAAGT TGCAGAGGG CCGA4 TGTGCAAAA CCCCGA GCGGCAAGTTCAAA GGGTA TTGTGTGAA CAA CA CCA A CTGCAAAAA TGTTTGCCGCA CTG A GGG A TTTCCAA CGGGAA GTTGC GATTTCCA TGTGGCTGGCA GAAAA TGTTA CTGTTA CAAA CCCTGCCCTTGA
Рис. 1. Нуклеотидна по^довтсть кДНК PsDefl.
Курсивом видтено нуклеотидну по^довтсть зртоХ форми дефензину 1 сосни звичайно'1, звичайним шрифтом — сигнальний пептид.
Шдкреслено нуклеотидна посл1довност1 праймер1в
Оскiльки вщомо, що гени дефензинiв мiстять штрон мiж двома екзо-нами, як кодують сигнальний пептид та зршу форму дефензину, то для запо-бiгання отримання псевдопозитивного сигналу вщ можливих домiшок геном-но! ДНК було пщбрано праймери таким чином, що прямий належав до сигнального пептиду, а зворотний - до зршо! форми дефензину PsDefl. Очшува-на довжина амплiфiкованого продукту - 159 п.н.
Сосна звичайна, як i бшьшють хвойних порщ, вщновлюеться тiльки насшневим шляхом. Генетична яюсть насiння визначально впливае у кшце-вому результатi на формування бюлопчно стшких i високопродуктивних на-саджень цiеï лiсотвiрноï породи, тому для аналiзу експресiï дефензину 1 ми обрали незрiле та зрше насiння сосни звичайноï. У незршому насiннi, яке зiб-ране iз серпневих дворiчних мегастробiл, продукти PsDefl на електрофорег-рамi не детектувалися, проте у зрiлому насшш, у сташ його спокою, добре вь зуалiзувалися транскрипти цього дефензину (рис. 2.). П.н. M 1 2
200 —Рис. 2. Продукт ампльфтаци кДНК h
ЩзЩ! зршого (дорЬкка 1) та незршого насшня - сосни звичайноХ (дорЬкка 2) jî
j 00 —специфгчними праймерами.
M-маркеры. П.н. - пар nymieomudie
Можливо, вiдсутнiсть амплiфiкованого продукту в незршому насшш пов'язана з тим, що основну функцiю захисту на цьому еташ формування нась нини виконують мiцнi тканини мегacтробiли. Зрше насшня безпосередньо кон-тактуе i3 патогенагресивним середовищем i в процес його дозрiвaння за-дiюютьcя мехашзми захисту, зокрема розпочинаеться екcпреciя дефензишв. У покритонасшних дефензини очищено з насшня таких рослинних родин, як As-teraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae, Saxifragaceae та Poaceae [13]. Ц досль дження св^ать про те, що рослинш дефензини е компонентом системи анти-мiкробного захисту в насшш багатьох представниюв покритонaciнних, а також можуть виконувати таку ж роль i в насшш голонасшних. Адже присутшсть транскриш!в дефензину PsDefl у тканинах сухого насшня сосни звичайно1, як i в багатьох шших покритонасшних, надае перевагу насшиш усшшно пророста-ти, формувати повноцiнний проросток у патогенагресивному cередовищi. За допомогою aнти-PsDef1aнтитiл ми виявили екcпреciю дефензину у проростках сосни звичайно1, вмют цього пептиду збiльшувaвcя у процес видовження проростка [5]. Шдтвердження експреси гена дефензину 1 у проростках ми отрима-ли i методом ЗТ-ПЛР. Варто зазначити, що продукт ампшфшаци детектувався в ушх частинах проростка: корiнцях, гiпокотилi та шм'ядолях (рис. 3).
Рис. 3. Електрофореграма продуктie амплгфгкаци кДНК h pbnux частин проростшв сосни iз специфичными до дефензину 1 прайм ерами: М — Маркеры; 1 - кортщ; 2 — гт о ко тип i; 3 - с Lit 'ядол1 У процес проростання насшня формуються проростки, як у вщкрито-му Грунт можуть контактувати зi спорами чи мiцелieм фiтопатогенних гри-бiв. Високий рiвень експреси дефензину PsDef1 в корiнцях, у гiпокотилях та Ым'ядолях зумовлений безпосереднiм контактуванням уЫе! поверхнi проростка iз Грунтом, адже через вщсутшсть ще несформовано! твердо! кштинно! стiнки проростки дуже чутливi до механiчного пошкодження, що сприяе па-тогеннiй швази. Анашз баз даних EST NCBI показав, що дефензиноподiбнi послiдовностi присутнi у кДНК бiблiотеках iз хво! i корешв iнших видiв хвойних рослин. Вестерн-блот анашзом iз використанням антидефензин 1 ан-титiл нам не вдалося виявити iмунореактивнi смуги в екстрактах проте!шв iз хво!, кори та корешв дорослих дерев сосни. Застосувавши для дослщження експреси дефензину 1 у тканинах 15^чно! сосни бшьш чутливий метод -ЗТ-ПЛР, ми виявили амплжон очжувано! довжини - 159 п.н. в коренях, кор^ хво! та насшт сосни (рис. 4, дорiжки 1, 2, 3, 4). Подiбний профiль експреси був описаний для дефензину 1 Picea glauca (PgD1), який на 87 % гомолопч-ний дефензину сосни [11]. Отримаш нами результати вказують на конститу-тивний характер експреси PsDef1 у тканинах рiзних органiв сосни звичайно!. У вегетативних бруньках продукт ампшфжаци не виявлено (рис. 4, дорiжка 5), що свщчить про тканиноспецифiчний характер експреси дефензину 1 сосни, подiбно як i в покритонасшних рослин [14].
Рис. 4. Електрофореграма продуктiв амплiфiкацu кДНК сумарно'1 РНК iз рЬних тканин сосни звичайноХзi специфiчними праймерами до Р8Бе/1 тарибосомаль-ного бтка Ь44:1 - кора 15-р1чно1 сосни; 2 - хвоя 15-р1чно1 сосни; 3 - зрые настня;
4 - коршня 15-р1чно1 сосни; 5 - вегетативш бруньки 15-р1чноХ сосни
У генеративних органах низки квггкових рослин, переважно, у зовшш-шх кштинних шарах пелюсток, чашолистюв, у пиляках та стовпчиках маточки виявлено експресда гешв дефензишв [8]. Методом ЗТ-ПЛР ми встановили наявшсть продукпв транскрипци гена дефензину 1 у генеративних органах сосни звичайно!: у макростробшах, що сформувалися на вегетативних паго-нах поточного року, а також у мжростробшах та пилку (рис. 5, дорiжки 1, 2, 3), хоча наявшсть продукту транскрипци у мжростробшах може бути i внас-лщок експреси РвБеА у пилку.
1 2 3
«- /M)efl L44
Рис. 5. Експреая гена PsDefl у генеративних органах 15рчно1 сосни звичайной
1 - макростробыи, 2 - мжростробыи, 3 - пилок
Отже, ми отримали доказ залучення пептиду PsDefl до захисту гаме-тофпу сосни звичайно! проти потенцшного його ураження патогенними ор-гашзмами. Отриманi результати пiдтверджують унiверсальнiсть механiзмiв захисту проти фiтопатогенних органiзмiв як у покритонасшних, так i в голо-насiнних представникiв рослинного свгту. Ми виявили, що експресiя гена PsDefl вщбуваеться у зрiлому насшш, проростках, вегетативних i генеративних органах сосни звичайно!, що е свiдченням участi дефензину в захист рослини на всiх етапах !! онтогенетичного розвитку.
Л1тература
1. Ковальова В.А. Дефензини в геномах рослин родини Pinaceae / В. А. Ковальова // На-уковий вiсник НЛТУ Укра!ни : зб. наук.-техн. праць. - Львiв : РВВ НЛТУ Укра!ни. - 2010. -Вип. 20.2. - С. 32-36.
2. Ковальова В.А. Отримання рекомбшантного дефензину 1 сосни звичайно! та його антифунгальна активнють / В. А. Ковальова, 1.Т. Гут, Р.Т. Гут // Бiополiмери i клiтина. - 2008. - Т 24, № 5. - С. 337-385.
3. Ковальова В.А. Антифунгальш властивост дефензину Pinus sylvestris L. / В. А. Ковальова, Р.Т. Гут // Лю1вництво Укра!ни в контекст св1тових тенденцш розвитку люового гос-подарства : шжнар. наук.-практ. конф., 20-23 вер. 2006 р.: тези доп. - Льв1в, 2006. - С. 272-273.
4. Ковальова В.А. Видшення бшюв 1з фунгщидною активнютю з проростюв сосни звичайно! / В. А. Ковальова, Р.Т. Гут // Физиология и биохимия культурных растений. - 2006. -39. - С. 114-120.
5. Ковальова В.А. Анашз експреси дефензину в процес проростання насшня сосни звичайно! / В. А. Ковальова, Г.Т. Криницький, Р.Т. Гут // Науковий вюник НЛТУ Укра!ни : зб. наук.-техн. праць. - Льв1в : РВВ НЛТУ Укра!ни. - 2007. - Вип. 17.8. - С. 24-27.
6. Юсипович Ю.М. Особливост видшення сумарно! РНК з р1зних тканин сосни звичайно! / Ю.М. Юсипович, В.А. Ковальова, Р.Т. Гут // Науковий вюник НЛТУ Укра!ни : зб. наук.-техн. праць. - Льв1в : РВВ НЛТУ Укра!ни. - 2010. - Вип. 20.5. - С. 37-41.
7. Fossdal C. The putative gymnosperm plant defensin polypeptide (SPI1) accumulates after seed germination, is not readily released, and the SPI1 levels are reduced in Pythium dimorphum-in-fected spruce roots / C. Fossdal, N. Nagy, P. Sharma, A. Lonneborg // Plant Molecular Biology. -2003. - Vol. 52, № 2. - P. 291-302.
8. Fung T. Lay Anderson. Isolation and Properties of Floral Defensins from Ornamental Tobacco and Petunia / T. Lay Fung, F. Brugliera, A. Marilyn // Plant Physiology, March. - 2003. - Vol. 131. - P. 1283-1293.
9. Kovaleva V.A. Isolation and the antifungal activity of defensin-like protein from Scots pine roots / V.A. Kovaleva, R.T. Gout // Joint conference of UIFRO "Population genetics and genomics of forest trees: from gene function to evolutionary dynamics and conservation". October 1-6, 2006, Madrid. - P. 188-189.
10. Lay F.T. Defensins - Components of the Innate Immune System in Plants / F.T. Lay, M.A. Anderson // Current Protein and Peptide Science. - 2005. - Vol. 6. - P. 85-101.
11. Pervieux I. A spruce defensin showing strong antifungal activity and increased transcript accumulation after wounding and jasmonate treatments / I. Pervieux, M. Bourassa, F. Laurans, R. Hamelin, A. Seguin // Physiol. Mol. Plant Pathol. - 2004. - Vol. 64. - P. 331-341.
12. Shena G. Molecular cloning, characterization and expression of a novel jasmonate-depen-dent defensin gene from Ginkgo biloba / G. Shena, Y. Pangb, W. Wub, Z. Miaoa, H. Qiana, L. Zhaoa, X. Sunb, K. Tanga // Plant Physiology. - 2005. - Vol. 162. - P. 1160-1168.
13. Terras F.R.G. Analysis of two novel classes of antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds / F.R.G. Terras, H.M.E. Schoofs, M.F.C. De Bolle, F. Van Leuven, S.B. Rees, J. Vanderleyden, B P.A. Cammue, W.F. Broekaert // J. Biol. Chem. - 1992. - Vol. 267. - P. 5301-5309.
14. Thomma B. Tissue-specific expression of plant defensin genes PDF2.1 and PDF2.2 in Arabidopsis thaliana / B. Thomma, W. Broekaert // Plant Physiol. Biochem. - 1998. - Vol. 36. - P. 533-537.
15. Thomma B. Plant defensins / B. Thomma, B. Cammue, K. Thevissen // Planta. - 2002. -Vol. 216, № 2. - P. 193-202.
Юсипович Ю.М., Ковалева В.А., Гут Р.Т. Органоспецифическая экспрессия дефензина 1 (PsDef1) у Pinus sylvestris L.
Представлены данные об экспрессии дефензина PsDef1 в вегетативных и генеративных органах 15-летней сосны обыкновенной, а также в семенах и разных частях проростков (корешки, гипокотили и семядоли). Обнаружены продукты транскрипции PsDef1 в пыльце и макростробилах текущего года, зрелых семенах, хвое, корнях и коре сосны. Полученные результаты свидетельствуют об конститутивной экспрессии белка в большинстве органов сосны, что является подтверждением его защитной роли на всех этапах онтогенетического развития сосны обыкновенной.
Ключевые слова: дефензин 1, oрганоспецифическая экспрессия, соста обыкновения.
Yusypovych Yu.M., Kovalyova V.A., GoutR.T. The specific organ expression of defensins 1 (PsDef1) in Pinus sylvestris L.
The expression of defensin PsDef1 in vegetative and generative organs of 15-year-old Scots pine, also in seeds and differential shoot parts (root, hypocotyl and cotyledon) are given in the article. Transcriptional products of PsDef1 in pollen and current year mac-rostrobiles, mature seeds, needles, roots and bark of Scots pine are detected. These results show the constitutive expression of the protein in most of organs, that confirms а protein protect role on all ontogenetical stages of Scots pine development
Keywords: defensin 1, specific organ expression, Scots pine.
УДК 630* 67 Acnip. О.П. Ютовець1 -Житомирський НАУ
ОЦ1НКА Р1ВНЯ ДИВЕРСИФ1КАЦ11 Л1СОГОСПОДАРСЬКОГО ВИРОБНИЦТВА НА П1ДПРИСМСТВАХ ПОЛ1ССЯ УКРА1НИ
Аналiз основних фiнансово-економiчних показниюв дiяльностi пщприемств дозволив ощнити рiвень диверсифшацп люогосподарського виробництва. Пщкресле-но роль диверсифшацшних процеав як засобу адаптацп тдприемства до кризових явищ в економщь
Ключовi слова: диверсифшащя, люогосподарське виробництво, деревообробка, експорт деревини, рентабельшсть.
Постановка проблеми. Перехщ до ринкових вщносин зумовлюе зрос-тання рол1 економ1чних фактор1в у державному люовому господарствь Вщ суб'екпв люогосподарсько! д1яльност1 вимагаеться постшний виб1р таких ме-тод1в та шлях1в шдвищення ефективност виробництва, як дають змогу досяг-нути кращих результат за рацюнальних обсяпв витрат. Чшьне мюце у вирь
1 Наук. кер1вник: проф. В.П. Краснов, д-р с.-г. наук - Полюький фшал УкрНДШГА
