CC BY
11
Нащональний лкотехшчний унiверситет Украши
УДК577.112 Мол. наук ствроб. В.А. Ковальова; проф. Г.Т. Криницький,
д-р. бюл. наук; доц. Р. Т. Гут, канд. бюл. наук - НЛТУ Украти, м. iïbeie
АНАЛ1З ЕКСПРЕСП ДЕФЕНЗИНУ У ПРОЦЕС1 ПРОРОСТАННЯ
НАС1ННЯ СОСНИ ЗВИЧАЙНОÏ
Вестерн-блот аналiзом за допомогою полiклональних анти-GST-PsDefl антитш виявлено iстотнi змiни у pÏBHÏ експреси дефензину, захисного бiлка рослин пщ час проростання насiння сосни (Pinus sylvestris L.).
Ключов1 слова: дефензин сосни звичайно'1'; експресiя; пол1клональш анти-GST-PsDefl антитiла.
Junior research officer V.A. Kovalyova; prof. H.T. Krynytskyy;
assoc. prof. R.T. Gout - NUFWT of Ukraine, L'viv
Analysis of Scots pine defensin expression under a seed germination
The substantial changes in the expression of Scots pine defensin under a seed germination were found by Western-blot analysis with polyclonal anti-GST-PsDefl antibodies.
Keywords: scots pine defensin; expression, polyclonal anti-GST-PsDefl antibodies.
Упродовж останнього десятил1ття досягнуто значного прогресу у ро-зумшт мехашзм1в реагування рослинних оргашзм1в на змши умов ïx юну-вання, зокрема на дда патогенних оргашзм1в. Нагромаджено великий обсяг фактичного матер1алу, який св1дчить, що дефензини багатьох вид1в покрито-насшних е важливим компонентом природного захисту рослинних кштин [1].
Нагромаджеш знання щодо бюлопчних властивостей рослинних де-фензишв та ïx рол1 у захист рослин вщ шфекцш вже починають використо-вуватися для виршення практичних завдань сшьського господарства. Так, е приклади отримання трансгенних рослин з геном дефензину, як виявили шд-вищену стшюсть до патогешв [1]. Поряд з тим, випробовуються препарати, що мютять елюитери, 1нтермед1ати сигнальних систем кштин, стресов1 фгго-гормони для стимулювання експреси гешв захисних бшюв та формування системноï набутоï або iндукованоï стшкосл [2]. Однак, треба зазначити, що дуже мало робгг присвячено вивченню ролi патогеншдукованих бшюв у за-xистi лiсотвiрниx деревних порщ вiд ураження фiтопатогенами, хоча шфшу-вання деяких деревостанiв хвойних порщ небезпечними збудниками корене-вих гнилей в Укра].ш сягае 100 %. Значного поширення набули грибш ураження сiянцiв та саджанщв у розсадниках.
Нещодавно вiдкритий нами дефензин сосни звичайноï виявив високу актившсть проти фiтопатогенниx грибiв, яю викликають захворювання хвойних деревних порщ [3-5]. Вiдомо, що проростання насшня - це один з найбшьш уразливих перiодiв в онтогенетичному розвитку рослини, тому дос-лiдження експреси дефензину саме на цьому еташ е важливим для з'ясування меxанiзмiв формування стiйкостi хвойних порiд до бютичного стресу.
Матер1али i методи
У дослщах використовували вiдсортоване життездатне насшня Pinus sylvestris L., отримане з ДП "Буське ЛГ" Львiвськоï областi. Насiння сосни пророщували в термостат за температури 26 °С у чашках Петрi на фшьтру-вальному паперi, змоченому дистильованою водою. Проростки видаляли, за-
Науковий вкник, 2007, вип. 17.8
морожували у рiдкому азот та збер^али за температури -70 °С до 'хнього використання.
Гомогенати тканин отримували мехaнiчним розтиранням у гомогеш-зaтoрi Поттера за 4 °С з додаванням лiзуючoгo буферу, що мютив 50 мМ трис-НС1, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 % Тритон Х-100 ("Sigma") 5 мМ EDTA та нaбiр iнгiбiтoрiв проте'наз ("Roche"). Отримaнi лiзaти центрифугували протя-гом 25 хв за 13000 g, 4 °С. Кoнцeнтрaцiю сумарного бшка в отриманих супер-натантах визначали за методом Бредфорда.
Вестерн-блот aнaлiз проводили пiсля електрофорезу у 15 % ДСН-ПА-АГ у трис-трициновш буфeрнiй систeмi [6]. Електроперенос бшюв з гелю на мембрану проводили на апарал Trans-Blot™, за рекомендащями виробника ("Bio-Rad") при 250 мА протягом 2 год.
Шсля нaпiвсухoгo переносу мембрану шкубували в буфeрi для блоку-вання 5 % знежиреного сухого молока в забуферному фiзioлoгiчнoму розчиш (ЗФР) за присутност 0,1 %-го Твш-20 упродовж 1 год. за юмнатно! температури для блокування сайпв нeспeцифiчнoгo зв'язування на мeмбрaнi. Мембрану шкубували з анти-дефензин 1 у блокувальному буфeрi (1:1000) 2 год. за юмнатно! температури. Надлишок aнтитiл вiдмивaли буфером для блокування. Мембрану вщмивали три рази по 10 хв. вказаним буфером. Анти-IgG кроля антитша, кoн,югoвaнi з пероксидазою хрону, додавали у розведенш 1:2500 та iнкубувaли протягом 1 год. за юмнатно! температури. Шсля шкуба-ци мембрану знову вщмивали вiд надлишку aнтитiл буфером ЗФРТ три рази по 5 хв. 1мунореактивш бшки виявляли за реакщею посилено! хемшюмшес-ценци (ECL). Час експозици оброблених мембран на рентгешвськш плiвцi за-лежав вiд штенсивносл хемшюмшесценци i тривав 1-15 хв.
Денситометричний aнaлiз мiкрoфoтoгрaфiй здiйснювaли за допомо-гою програми Gel-Pro Analyzer 4.0 ("Media Cybernetics", США).
Результати та ix обговорення
Проростання насшня - один з найбшьш критичних пeрioдiв в онтоге-нетичному розвитку рослини для ураження патогенними мжрооргашзмами. У цей момент мехашчш конститутивш бар'ери ще не сфoрмoвaнi, а цшстсть насшневих пoкривiв, якi забезпечували захист, порушуеться при накльову-ванш нaсiння. I як свiдчaть л^ературш джерела, ключову роль у запоб^анш iнфiкувaнню в цей пeрioд виконують aнтимiкрoбнi компоненти, що синтезу-ються проростком, зокрема дефензини [7]. Так вiдoмi роботи I. Первеукс [8] та К. Фоссдала [9] показали, що експреЫя дeфeнзинiв ялини голубо'' (PgD1) та ялини европейсько! (SPI 1) починаеться тсля появи проростку i значно посилюеться при елонгаци гiпoкoтилю. Оскiльки PgD1 та SPI 1 та де-фензин сосни звичайно! (PsDef1) належать до одно'' групи, то для пoрiвняння ми дослщили прoфiль експреси PsDef1 у процес проростання сосни звичайно! за допомогою отриманих нами пол^ональних aнтитiл (рис. 1).
В експеримент використано зародки зi сухого насшня, а також 1...7-ми дeннi проростки. На електрофоретичну дoрiжку наносили близько 10 мкг бшка кислоторозчинного екстракту кожного зразка (рис. 1, а). Як видно з рис. 1, б, iмунoрeaктивнa смуга з молекулярною масою близько 6 кДа
Нащональний лкотехшчний унiверситет УкраТни
спостершаеться у bcíx зразках, але сила сигналу змшюеться (рис. 1, в), поси-люючись на шостий, а особливо на сьомий день проростання.
В) п
^ 1 Рис. 1. ЕкспреЫя дефензину в
екстрактах зразшв зародтв сосни звичайноХ в динамц проростання:
а) електрофореграма екстракт1в, забарвлена Coomassie G-250; б) вестерн-блот анализ; в) денситометр1я. 1 - зародки сухого настня; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 - 1-7-ий дт проростання настня
1 2 3 4 5 6 7 8 Щкавим е факт наявност специфiчного сигналу в насшш, яке знахо-диться в сташ спокою, оскшьки на цей час юнуе думка, що дефензини хвойних порщ не беруть участ у захистi насшня вiд патогено!' швази, на вщ-мiну вiд покритонасiнних, в яких бшьшють дефензинiв мають насiнневе по-ходження. Ця гiпотеза виникла внаслщок того, що iмуноблотингом з вико-ристанням анти-SPI 1 антитiл не виявлено дефензишв у насiннi ялини евро-пейсько!', яке перебувае у сташ спокою [9], а також не знайдено транскриш!в PgD1 i в насшш Picea glauca [8]. Варто зауважити, що анти-SPI 1 антитша були специфiчнi до невеликого фрагменту (12 амшокислотних залишюв) дефе-низну ялини, а ця дшянка дуже варiабельна в дефензишв хвойних, i тому, на нашу думку, щ антитша не розшзнають ештошв дефензинiв насiнневого по-ходження, рiвень гомологи яких з SPI 1 становить 50 %. Ми отримали антить ла проти повно!' амшокислотно!' послiдовностi дефензину сосни звичайно!', що розширюе !'х можливост у виявленнi експреси дефензинiв у хвойних.
Для виявлення впливу фггопатогенного гриба на рiвень експреси дефензину, п'ятиденш проростки iнокулювали грибом Heterobasidion annosum i на третю добу аналiзували iмуноблотингом (рис. 2). Як контроль використо-вували восьмиденш неiнфiкованi проростки.
За результатами анти-PsDefl iмуноблотингу в умовах бiотичного стресу, викликаного дiею некротрофного фiтопатогена H. annosum, рiвень експреси дефензину сосни зростае, що свщчить про активащю механiзмiв за-хисту елiситерними молекулами гриба. Як вщомо з попередшх наших досль джень, ендогенний дефензин сосни володiе високою активнiстю in vitro що-до H. annosum [10], i шдвищення рiвня експреси за умов ди патогена сприяе розвитку стшкосп проросткiв до грибно!' швази.
Науковий тсиик, 2007, вип. 17.8
2
.л I
« 1,4 -
Р 1,2 -£ 1
« 0,8
I 0,6 -
I °'4" 0,2 -
о 4---1---
1 2 Рис. 2. ЕкспреЫя дефензину 1 сосни за умов дИ фтопатогенного чинника:
а) електрофореграма бтюв проростюв; б) ¡муноблотинг; в) денситограма.
1 - нетфтовам проростки; 2 - проростки, токулъоваш H. annosum
Таким чином, отримаш результати св1дчать, що при проростанш на-сшня сосни звичайно! реашзуеться генетична програма захисту уразливих для патогенних мiкроорганiзмiв тканин шляхом експреси антимiкробних бш-юв, зокрема дефензинiв, навiть за вщсутносп бiотичних стресорiв. Отриманi нами специфiчнi анти-дефензин 1 антитiла можуть бути хорошим шструмен-том для вивчення впливу рiзних факторiв бютично! та абютично! природи на експресiю дефензину сосни та формування стшкосл хвойних деревних порщ до фiтозахворювань.
Лггература
1. Thomma BPHJ, Cammue BPA, Thevissen K. Plant defensins// Planta. - 2002, vol. 216. -P. 193-202.
2. Gao A.G., Hakimi S.M., Mittanck C.A., Wu Y., Woerner B.M., Stark D.M. Fungal protection in potato by expression of a plant defensin peptide// Nat. Biotechnol. - 2000, vol. 18. - P. 1307-10.
3. Ковальова В.А., Гут Р.Т. Видшення бшюв is фунгщидною активнютю з проростов сосни звичайно!// Физиология и биохимия культурных растений. - 2006, vol. 39. - С. 114-120.
4. Kovaleva V.A., Gout R.T. Isolation and the antifungal activity of defensin-like protein from Scots pine roots// Joint conference of UIFRO " Population genetics and genomics of forest trees: from gene function to evolutionary dynamics and conservation. October 1-6, 2006, Madrid. - P. 188-189.
5. Ковальова В.А., Гут 1.Т., Гут Р.Т. Характеристика двох дефензиноподiбних бшюв з проростов сосни звичайно!// Бюжотмери i клгтина. - 2006, vol. 22. - С. 126-131.
6. Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1-100 kDalton// Anal. Biochem. - 1987, vol. 166. - Р. 368-379.
7. Liu Y., Luo J., Xu C., Ren F., Peng C., Wu G., Zhao J. Purification, characterization, and molecular cloning of the gene of a seed-specific antimicrobial protein from pokeweed// Plant Physiology. - 2000, vol. 122. - P. 1015-1024.
8. Pervieux I., Bourassa M., Laurans F., Hamelin R., Seguin A. A spruce defensin showing strong antifungal activity and increased transcript accumulation after wounding and jasmonate treatments// Physiol. Mol. Plant Pathol. - 2004, vol. 64. - P. 331-341.
9. Fossdal C.G., Nagy N.E., Sharma P., Lonneborg A. The putative gymnosperm plant defensin polypeptide (SPI1) accumulates after seed germination, is not readily released, and the SPlllevels are reduced in Pythium dimorphum-infected spruce roots// Plant Mol. Biol. - 2003, vol. 52. - P. 291-302.
10. Ковальова В.А., Гут I. Т., Гут Р.Т. Очистка та характеристика дефензину з корешв Pinus sylvestris L.// Матерiали IX Украшського бiохiмiчного з''!зду 24-27 жовтня 2006 р., Хар-юв. - С. 45-46.
6,5—►
а) 1 2 б) 1 2
